农药在田间使用后，大部分会进入土壤中，有可能对土壤造成污染。据统计，截至2012年，我国受农药污染的农业土地面积约为1 300～1 600万公顷^[1]。蚯蚓是土壤生态系统中重要的生物类群，在维持土壤生态系统功能中起着重要作用。作为土壤中无脊椎动物的代表，蚯蚓常被用作土壤环境的指示生物，用于评价污染物对土壤环境的影响。但目前大多数研究均集中在污染物对蚯蚓的短期、急性毒性效应方面^{[2, 3, 4]}，有关污染物对蚯蚓生长、繁殖等长期影响的研究较少，周世萍等以赤子爱胜蚓Eisenia foetida为受试生物，研究了暴露于含有亚致死剂量毒死蜱的人工土壤中蚯蚓超氧化物歧化酶、过氧化氢酶、谷胱甘肽过氧化物酶活性的变化^[5]；张轶辉等探讨了Al³⁺ 对蚯蚓乙酰胆碱酯酶的毒性^[6]。

毒死蜱属有机磷类农药，具有胃毒、触杀、熏蒸三重作用，对水稻、小麦、棉花、 果树、蔬菜及茶树上多种咀嚼式和刺吸式口器害虫均具有较好的防效。作为高毒有机磷农药的主要替代品种，目前毒死蜱在我国使用广泛，登记厂家已达1 000余家^[7]。研究表明，毒死蜱对蚯蚓的急性毒性较低，刘伟、赵华及闫轶亚等采用土壤接触法测得毒死蜱对赤子爱胜蚓的14 d-LC₅₀值分别为182.21、83.63和 208.88 mg/kg^{[2, 3, 4]}。但目前尚未见有关毒死蜱对蚯蚓生长及繁殖影响的研究报道。笔者以赤子爱胜蚓为受试生物，以人工土壤为试验基质，首先进行了毒死蜱对赤子爱胜蚓的急性毒性试验，以便为其生长和繁殖试验设计提供参考，同时验证方法的有效性，在此基础上，研究了毒死蜱对赤子爱胜蚓生长和繁殖的影响，旨在为毒死蜱的安全使用提供参考。

1 材料与方法 1.1 药剂及试剂

99.0%毒死蜱(chlorpyrifos)原药，美国百灵威科技有限公司；95%苯菌灵(benomyl)原药及2-氯乙酰胺(2-chloroacetamide,纯度≥98.0%)，美国Sigma-Aldrich公司。

赤子爱胜蚓Eisenia foetida:购自南京市江宁蚯蚓养殖场，试验前于试验条件(温度20 ℃±1 ℃，相对湿度80%～85%，光照400 ～800 lx)下预养7 d。选择生殖环明显、质量在300～600 mg之间的成年蚯蚓供试。

以人工土壤为试验基质，具体配方见表1，加入CaCO₃调节土壤pH至6.0。因试验周期较长，试验期间需向基质中投放饲料，并保持土壤湿润。

表 1(Table 1)

表 1 人工土壤组分及配比 Table 1 Contents and proportion of artificial soil 组分 Contents 质量分数 Percent/% 石英砂(120～180 μm) Quartz sand(120～180 μm) 70 高岭土 Kaolin clay 20 草炭 Sphagnum peat 10

表 1 人工土壤组分及配比 Table 1 Contents and proportion of artificial soil

试验共设10、25、50、80及100 mg/kg(每千克干土中含毒死蜱有效成分毫克数，以下同)5组处理，同时设空白对照和参比物质2-氯乙酰胺对照组，参比物质对照用以验证试验的有效性。每组均设3次重复。称取0.5 g(精确至0.001 g)毒死蜱，加入少许丙酮溶解后，用蒸馏水定容至100 mL，得到质量浓度为5 mg/mL 的母液。每个标本瓶中装入500 g干土，分别加入1、2.5、5、8 及10 mL母液，静置1 h，待溶剂挥发后，加适量蒸馏水，调节土壤水分含量至土壤干重的35%。将药液与土壤充分拌匀，得到毒死蜱质量分数分别为10、25、50、80及100 mg/kg的5组处理。每个标本瓶中放入10条蚯蚓，用保鲜袋扎好瓶口，扎适量小孔通气。将标本瓶置于20 ℃±1 ℃、相对湿度80%～85%、连续光照(光强为400～800 lx)的培养箱内。试验期间保持土壤湿润，分别于暴露7和14 d后，根据蚯蚓的死亡率，采用SPSS 16.0软件计算LC₅₀值及95%置信限^[8]。

试验设计、土壤基质配制及试验条件同1.4.1节，同时设空白对照，每处理均设3次重复。试验期间以牛粪作为蚯蚓饲料。于试验开始1 d后向每个标本瓶中投入约5 g牛粪于土壤表面，用去离子水湿润(每瓶约5～6 mL)，之后每7 d喂食1次(若饲料未摄食完，再次喂食时需减去剩余部分饲料量)。暴露28 d后，计算蚯蚓的体重变化^[9]。

在毒死蜱对蚯蚓生长影响试验结束(暴露28 d)后，将成年蚯蚓移走，留下卵及幼蚓，继续暴露28 d，其间只添加1次饲料，28 d后统计幼蚓数量，计算孵化率。为检验试验操作及方法的有效性，以对蚯蚓具有繁殖毒性的苯菌灵^[9]为阳性对照，同时测定了苯菌灵对蚯蚓的繁殖毒性。每处理均设3次重复。

采用下式计算毒死蜱对蚯蚓繁殖的影响：

繁殖抑制率/%=[(对照组每只成年蚯蚓所产平均幼蚓数-处理组每只成年蚯蚓所产平均幼蚓数) /对照组每只成年蚯蚓所产平均幼蚓数]×100

毒死蜱及2-氯乙酰胺对赤子爱胜蚓的急性毒性测定结果见表2。

表 2(Table 2)

表 2 毒死蜱及2-氯乙酰胺对蚯蚓的急性毒性 Table 2 Acute toxicity of chlorpyrifos and 2-chloroacetamide to earthworms 药剂 Substance 时间 Time/d LC50/ (mg/kg dry soil) 95%置信限 95% Confidence limit/(mg/kg dry soil) 毒性等级 Toxicity category 毒死蜱chlorpyrifos 7 97.07 (84.61～119.3) 低毒 Low toxicity 14 88.75 (78.22～92.54) 低毒 Low toxicity 2-氯乙酰胺2-chloroacetamide 7 42.87 (33.72～54.51) 低毒 Low toxicity 14 38.58 (27.10～54.94) 低毒 Low toxicity

表 2 毒死蜱及2-氯乙酰胺对蚯蚓的急性毒性 Table 2 Acute toxicity of chlorpyrifos and 2-chloroacetamide to earthworms

在人工土壤中，毒死蜱对蚯蚓的14 d-LC₅₀值为有效成分88.75 mg/kg。根据农药对蚯蚓的毒性等级划分标准^[8]，在供试人工土壤中毒死蜱对蚯蚓为低毒。

试验期间，空白对照组蚯蚓生长正常，未出现死亡；参比物质2-氯乙酰胺对蚯蚓的14 d-LC₅₀值为38.58 mg/kg，在10～100 mg/kg范围内，证明试验满足有效性要求^[8]。

暴露28 d后，低浓度处理组部分蚯蚓身体局部膨起、肿大，反应迟钝，出现个别死亡；较高浓度处理组蚯蚓身体普遍扭曲，运动能力明显减弱，部分蚯蚓体表有黄色渗液；最高浓度处理组则出现了3～4条死亡蚯蚓。

以蚯蚓体重变化为指标评价毒死蜱对其生长的影响。结果(表 3)表明，暴露7 d后，80和 100 mg/kg 处理组蚯蚓体重比对照分别下降了14.7%和15.0%，差异显著；14 d后，最高浓度(100 mg/kg)处理组蚯蚓体重比对照下降了19.4%，差异极显著；经过 28 d 暴露，10、25、50、80及100 mg/kg处理组蚯蚓平均体重比对照分别下降了9.8%、15.7%、17.5%、23.9%和27.0%，体重下降与药剂浓度之间高度相关，且除10 mg/kg处理组外均与对照差异显著或极显著(P < 0.01, r=0.984)。其28 d最低可观测效应浓度(LOEC)值为25 mg/kg。

表 3(Table 3)

表 3 毒死蜱对蚯蚓体重的影响 Table 3 Effect of chlorpyrifos on the body weight of the test earthworms 毒死蜱质量分数 Conc. of chlorpyrifos /(mg/kg dry soil) 蚯蚓平均体重 Average body weight of earthworm/mg 0 d 7 d 14 d 28 d 0(CK) 345±23 353±34 361±29 389±51 10 353±37 362±47 361±55 351±21 25 349±13 338±33 322±58 328±53* 50 355±29 333±87 327±54 321±39* 80 345±29 301±71* 318±45* 296±65* 100 351±10 300±44* 291±62** 284±43** 注：*表示处理组与对照差异显著(P < 0.05)；**表示差异极显著(P < 0.01)。 Note: *means there is significant difference between treatment group and control group(P < 0.05); ** means there is highly significant difference between treatment group and control group(P < 0.01).

表 3 毒死蜱对蚯蚓体重的影响 Table 3 Effect of chlorpyrifos on the body weight of the test earthworms

从图 1 中可看出，毒死蜱对蚯蚓繁殖具有明显的抑制作用，10、25、50、80及100 mg/kg处理组的繁殖抑制率分别为32.26%、80.97%、89.03%、89.68%和97.42%，繁殖抑制率与药剂处理浓度之间存在一定的相关性(r=0.788)。其28 d LOEC值为25 mg/kg。试验结果表明，对照药剂苯菌灵影响蚯蚓繁殖的LOEC值为5 mg/kg，与Römbke等^[10]的研究结果一致，证明本研究中所采用的繁殖毒性试验操作及方法有效。

图 1

图 1 不同浓度毒死蜱对蚯蚓繁殖的影响 Fig. 1 Impact of different concentration of chlorpyrifos on the reproduction of earthworms

毒死蜱属于有机磷类农药，通常认为其致毒机制是与生物体内的胆碱酯酶结合，使其失去分解乙酰胆碱的作用，从而引发一系列神经毒性^[11]。也有研究表明，毒死蜱对蚯蚓的抗氧化酶系具有抑制作用，其对蚯蚓除具有神经毒性外，还与对蚯蚓的脂质过氧化作用密切相关^[5]。本研究以赤子爱胜蚓E.foetida为受试生物，以人工土壤为试验基质，测定了毒死蜱对蚯蚓的急性毒性及对其生长和繁殖的影响。结果表明：在有效试验条件下，毒死蜱对蚯蚓的14 d-LC₅₀值为有效成分88.75 mg/kg；在大于25 mg/kg剂量毒死蜱下暴露28 d后，蚯蚓的体重与繁殖率均受到了明显的不利影响(LOEC值为25 mg/kg)。本研究仅表征了毒死蜱对蚯蚓生长和生殖的影响，对于其影响机制，包括毒死蜱对蚯蚓的神经毒性及对抗氧化酶系的抑制作用与其对蚯蚓的生殖损伤之间的相关性等还有待进一步探明。