二硫代氨基甲酸酯类杀菌剂(EBDCs)^[1]对水果、蔬菜以及田间作物的广谱性真菌病害具有良好的防治效果^[2]，其中代森锰锌和代森联是该类药剂中主要的有效成分^[2,3]。

目前对二硫代氨基甲酸酯类化合物及其代谢物的检测方法主要有顶空气相色谱法及甲基衍生-高效液相色谱法等^[4,5]。其中，顶空气相色谱法是通过检测反应产物二硫化碳的含量并进行换算，间接获得二硫代氨基甲酸酯类化合物的含量，其原理决定了该方法具有选择性不强、前处理耗时费力且二硫化碳释放稳定性和重复性较差等不足^[6,7,8]，故未能得到广泛应用。而甲基衍生-高效液相色谱法操作繁琐耗时，难以高效批量处理样品^[9,10,11]。

除上述两种方法外，Zhang等^[12] 报道了1,2-乙二硫醇与异硫氰酸酯(R—NCS)的反应，生成特征性的1,3-二硫杂环戊烯-2-硫酮。而Chung等^[13]也报道了类似的反应，但采用了更为稳定的1,2-苯二硫酚(1,2-BDT)代替1,2-乙二硫醇。

Debbarh等^[14]则运用该方法测定了含有类似基团(R—N—CS)的代森锰锌(见图 1)，其机理是利用亲核试剂1,2-BDT进攻双键C发生亲核取代反应，脱去游离胺(R—NH₂)并缩合成苯并二硫杂环戊烯-2-硫酮(1,3-BDTT)^{[15 --------- 17]}，因此不受二硫代氨基甲酸酯类常见代谢物乙撑硫脲及二硫化碳^[14]的影响。以上反应构成了1,2-苯二硫酚衍生法测定二硫代氨基甲酸酯类化合物的基础。然而，作者在利用1,2-苯二硫酚衍生法测定代森类化合物时，发现由于1,2-BDT和/或1,3-BDTT的不稳定性，该方法在检测溶于乙二酸四乙胺(EDTA)中的代森锰锌待测物时，样品仅在24～48 h内稳定(未发表数据)，不能满足批量样本测试要求。因此，本研究拟引入抗氧化剂四氢呋喃(THF)和抗坏血酸(Vc)对该方法进行改进，并通过对4种常见二硫代氨基甲酸酯类商品杀菌剂有效成分的检测，考察该方法的实用性，期望为该类化合物的批量测试提供理论基础和技术支持。

图 1

Fig. 1

图 1 代森锰锌与1,2-苯二硫酚环的缩合反应 Fig. 1 Cyclocondensation reaction of mancozeb with 1,2-benzenedithiol

代森锰锌(mancozeb,96.8%)和代森联(metriam,84.0%)标准品购自德国Dr. Ehrenstorfer公司；乙撑硫脲(98.0%)和 1,2-苯二硫酚(95.0%)购自百灵威J&K公司(北京)。

商品杀菌剂：70%代森锰锌可湿性粉剂(WP，代森锰锌质量分数为70%)购自利民化工股份有限公司；68%精甲霜锰锌水分散粒剂(WG，代森锰锌质量分数为68%)购自瑞士先正达公司；68%霜脲锰锌水分散粒剂(代森锰锌质量分数为68%)购自美国杜邦公司；55%唑醚代森联水分散粒剂(代森联质量分数为55%)购自徳国巴斯夫公司。

试验所用甲醇、乙腈均为色谱纯。超纯水由Milli-Q系统制备。乙二酸四乙胺(EDTA)、二乙烯三胺五乙酸(DTPA)、柠檬酸钾、磷酸氢二钾、抗坏血酸(Vc)、氢氧化钾、异丙醇和四氢呋喃均为分析纯。 1.2 主要仪器

Alliance E2695高效液相色谱仪-2489紫外检测器(美国Waters公司)；Phenomenex Lunar C₁₈色谱柱(250 mm × 4.6 mm，5 μm)；带Security Guard AJO-4287柱芯预柱；SHZ-88A水浴恒温振荡仪(苏州培英实验设备有限公司；FA1104N电子天平(上海天平仪器厂，量程和精度：110 g/0.000 1 g)；E-201-c精密pH计(上海雷磁厂)；Milli-Q超纯水机(美国Millipore公司)。 1.3 色谱条件

高效液相色谱工作条件在前人研究基础^[14]上优化为：柱温25 ℃；进样体积10 μL；流速1.0 mL/min；检测波长365 nm。梯度洗脱：0～12 min，V(乙腈)∶V(水)=75∶25；12～24 min，V(乙腈)∶V(水)=85∶15。保留时间：由于代森锰锌和代森联的待测目标物都是 1,3-BDTT，因此图 2列出了以代森锰锌为反应物的 1,3-BDTT色谱图。抗坏血酸出峰时间在3 min前，1,3-BDTT在10.5 min出峰。

图 2

Fig. 2

图 2 代森锰锌标准品(10 mg/L)经1,2-苯二硫酚衍生后 产物1,3-BDTT的高效液相色谱图Fig. 2 HPLC chromatogram of reaction products of mancozeb (10 mg/L) after reaction with 1,2-benzenedithiol

准确称取3份0.005 0 g代森锰锌标准品及5份代森联标准品，分别用4 mL 50 mmol/L的络合剂溶解，用氢氧化钾调节pH值。其中：3份代森锰锌标准品分别用EDTA、柠檬酸钾和DTPA溶液溶解，均调节pH值至9.3。5份代森联标准品中，一份用EDTA溶解，调节pH值至11.0；两份用二乙基三胺五乙酸溶解，pH值分别调至10.0和11.0；两份用柠檬酸钾溶解，pH值分别调至10.5和11.0。共获得代森锰锌及代森联的8种 500 mg/L标准储备液，均于-4 ℃保存。 1.4.2 衍生化方法

参考Debbarh等^[14]的方法进行。吸取0.1 mL二硫代氨基甲酸酯类化合物溶液于5 mL带塑垫螺盖的玻璃离心管中，加入 0.6 mL 100 mmol/L的磷酸氢二钠缓冲液(pH 8.5)和1 mL 12 mmol/L的1,2-BDT溶液，充N₂后旋紧。于65 ℃水浴振荡进行衍生化反应2 h，冷却至室温，4 000 r/min下离心10 min，收集上清液，经 0.45 μm针孔过滤得到待测液。 1.4.3 反应条件优化 1.4.3.1 标准曲线

将代森锰锌(EDTA为络合剂，pH 9.3)和代森联(DTPA为络合剂，pH 10.0)标准储备液分别用对应的络合剂进一步稀释，得到质量浓度分别为10、20、30、40、50和60 mg/L的标准工作溶液。 按1.4.2 节方法进行衍生化反应得待测液，待测液放置0和24 h后分别取样测定代森锰锌或代森联的质量浓度，绘制标准曲线。 1.4.3.2 1,2-BDT浓度确定

准确称取0.100 0 g 1,2-BDT，用异丙醇溶解并定容至25 mL，再用异丙醇进一步稀释得到浓度分别为8、10、12、14和16 mmol/L 的1,2-BDT溶液。将0.1 mL 50 mg/L的代森锰锌标准工作溶液和0.6 mL 100 mmol/L的磷酸氢二钠缓冲液(pH 8.5)加入5 mL玻璃离心管中，分别快速加入1 mL 上述浓度的1,2-BDT溶液，按1.4.2节方法进行衍生化反应，得到待测液。待测液放置0和24 h后分别取样测定代森锰锌或代森联的质量浓度，考察不同浓度1,2-BDT对检测结果的影响，并将最优化的1,2-BDT浓度用于后续试验。 1.4.3.3 络合剂及pH值选择

取1.4.1节配制的8种代森锰锌及代森联标准储备液，按1.4.2节方法衍生化得到待测液，放置0、24和48 h后分别取样测定代森锰锌或代森联的质量浓度，考察不同络合剂及pH值对检测结果的影响。 1.4.3.4 抗氧化剂选择

将代森锰锌标准储备液(EDTA，pH 9.3)用EDTA(20 mmol/L,pH 9.3)进一步稀释得到100 mg/L的标准工作溶液，吸取25 mL该标准工作溶液于50 mL容量瓶中，共设 4个处理：处理1为空白对照，不添加其他任何物质；处理2～4分别加入2 mL四氢呋喃、2 mL 1 000 mg/L的抗坏血酸以及2 mL四氢呋喃+2 mL 1 000 mg/L的抗坏血酸。所有处理均用EDTA(20 mmol/L，pH 9.3)定容至50 mL，按照1.4.2节方法进行衍生化反应，得到待测液，分别放置0、12、24、36、48、60、72、96和120 h后取样测定代森锰锌质量浓度，考察不同抗氧化剂对检测结果的影响。 1.5 添加回收试验

考虑到1,2-BDT和1,3-BDTT的不稳定性，本研究对不同浓度范围的二硫代氨基甲酸酯类化合物进行了添加回收试验。分别称取0.020 0 g和0.500 0 g的两组70%代森锰锌可湿性粉剂、68%精甲霜锰锌水分散粒剂、68%霜脲锰锌水分散粒剂和55%唑醚代森联水分散粒剂于125 mL锥形瓶中，根据其有效成分相应添加代森锰锌或代森联标准品，其中0.020 0 g组添加量为0.010 0 g，0.500 0 g组为0.250 0 g，使添加水平分别为0.1和25 mg/L。 分别加入2 mL乙醇，超声振荡10 min。在唑醚代森联水分散粒剂中加入50 mL 20 mmol/L的DTPA溶液，其余有效成分为代森锰锌的各处理中分别加入50 mL 20 mmol/L的EDTA溶液。继续超声振荡10 min，于4 000 r/min离心20 min，上清液相应用DTPA或EDTA溶液定容至100 mL。吸取0.1 mL 上清液至10 mL容量瓶中，加入0.4 mL四氢呋喃和0.4 mL 1 000 mg/L的抗坏血酸，再相应用DTPA或EDTA定容，即得到8种待衍生化反应的杀菌剂样品溶液，按1.4.2节方法衍生化得到待测液，直接取样测定代森锰锌或代森联质量浓度。

标准曲线：将代森锰锌(EDTA，pH 9.3)和代森联(DTPA，pH 10.0)标准储备液进一步稀释，制备两组标准工作溶液，其质量浓度分别为0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5 mg/L(对应0.020 0 g组待测样品)和20、30、40、50、60、70 mg/L(对应0.500 0 g 组代测样品)。按1.4.2 节方法衍生化后直接进样测定代森锰锌或代森联质量浓度，绘制标准曲线。 1.6 商品杀菌剂测定

同1.5节方法制备8种杀菌剂样品溶液，但不添加标准品，经1.4.2节衍生化反应得到待测液，分别放置0、48和72 h后取样测定代森锰锌或代森联质量浓度。标准工作曲线同1.5节。 1.7 数据处理

上述所有试验均重复3次，取平均值。以3倍于噪音高度峰值(S/N=3)所对应的浓度为检出限(LOD)。

所有试验中杀菌剂的质量浓度变化均采用相对含量来表示，以初始含量为100%进行计算。

2 结果与讨论 2.1 1,2-BDT的适宜浓度

1,2-BDT的用量及使用条件是该方法中最重要的影响因素，其用量须过量于代森锰锌，但又必须低于一定浓度，否则会对衍生化反应产生干扰。1,2-BDT浓度对代森锰锌测定结果的影响见表 1。当代森锰锌质量浓度≤50 mg/L时，1,2-BDT的适宜浓度为12 mmol/L；若1,2-BDT 浓度低于此值，可能会导致二硫代氨基甲酸酯类化合物衍生化不充分；若其浓度高于12 mmol/L，则待测液稳定性变差，放置24 h后会出现明显的乳白色浑浊(可能是1,2-BDT和/或 1,3-BDTT被氧化为单质乳状硫所致)，对测试结果影响较大。代森联的测试结果与代森锰锌类似，1,2-BDT的浓度在12 mmol/L最为适宜，待测液在24 h内可保持稳定(数据未列出)。

表 1(Table 1)

表 1 不同浓度 1,2-苯二硫酚对代森锰锌标准溶液(50 mg/L)测定相对含量变化的影响 Table 1 Effect of 1,2-BDT concentration on the analysis quality of mancozeb(50 mg/L) 1,2-苯二硫酚浓度 Conc.of 1,2-BDT/(mmol/L) 相关系数 Correlation coefficients，r 代森锰锌相对含量 Relative concentration of mancozeb/% 0 h 24 h 0 h 24 h 8 0.991 1 0.987 6 100.0 99.5 10 0.992 5 0.995 5 100.0 99.7 12 0.999 8 0.999 6 100.0 101.0 14 0.998 8 0.972 1 100.0 94.4 16 0.999 2 0.764 3 100.0 85.9

表 1 不同浓度 1,2-苯二硫酚对代森锰锌标准溶液(50 mg/L)测定相对含量变化的影响 Table 1 Effect of 1,2-BDT concentration on the analysis quality of mancozeb(50 mg/L)

对 1,2-苯二硫酚衍生化方法而言，二硫代氨基甲酸酯类化合物的解络合是十分重要的步骤，解络合是否完全，以及是否会对后续检测产生影响，都与络合剂的类型及pH值密切相关。需要特别指出的是，由于代森联较难溶解，针对不同种类的络合剂，其pH值需调节至高于某一数值才能完全解络合及溶解。本研究选用3种络合剂，比较了它们在不同pH条件下对代森锰锌和代森联的解络合效果，结果见表 2。当pH值相同时，加入3种络合剂对代森锰锌的稳定性无明显影响，48 h时其测定结果的相对标准偏差(RSD)分别为3.7%、3.6%和4.4%；代森联在3种络合剂条件下所要求的pH值不同，其稳定性变化与代森锰锌也有所不同，随静置时间延长(48 h内)及pH值升高，代森联的相对含量下降越明显。这可能是由于在碱性条件下亚硫酰基更容易发生氧化反应所致。因此，为确保待测液有足够的稳定时间，在保证充分解络合的前提下应尽量降低体系的pH值。建议代森锰锌可采用EDTA进行解络合，维持pH为9.3，代森联则可采用DTPA解络合，pH保持在10.0为宜。

表 2(Table 2)

表 2 不同络合剂和pH条件下代森锰锌和代森联标准溶液(50 mg/L)在48 h内的相对含量变化 Table 2 Change of relative concentrations of mancozeb and metiram(50 mg/L) within 48 h as affected by complexants and pH value 化合物 Chemicals 络合剂 Complexant pH 相对含量Relative concentration/% 0 h 24 h 48 h 代森锰锌mancozeb 乙二胺四乙酸二钠 EDTA 9.3 96.9 98.2 103.5 柠檬酸钾 Potassium citrate 9.3 96.2 98.7 102.8 二乙基三胺五乙酸 DTPA 9.3 96.9 99.7 105.9 代森联metiram 柠檬酸钾 Potassium citrate 10.5 97.6 100.6 91.9 二乙基三胺五乙酸 DTPA 10.0 98.8 97.2 96.3 乙二胺四乙酸二钠 EDTA 11.0 102.0 94.2 85.4 柠檬酸钾 Potassium citrate 11.0 103.0 95.2 89.9 二乙基三胺五乙酸 DTPA 11.0 101.4 97.9 88.8

表 2 不同络合剂和pH条件下代森锰锌和代森联标准溶液(50 mg/L)在48 h内的相对含量变化 Table 2 Change of relative concentrations of mancozeb and metiram(50 mg/L) within 48 h as affected by complexants and pH value

由衍生化反应机理可知，二硫代氨基甲酸酯类化合物待测液的不稳定性可归因于1,2-BDT和/或 1,3-BDTT易氧化产生乳状单质硫，从而对反应产生干扰，因此，尽管降低体系pH值可在一定程度上提高待测液的稳定性，但其效果尚难以达到理想水平，还需添加抗氧化剂来进一步提高其稳定性(图 3)。

图 3

Fig. 3

图 3 添加3种抗氧化剂后代森锰锌相对含量(A)及其相对标准偏差(B)在120 h内的变化 Fig. 3 Change of the concentrations(A) and relative standard deviation(B) of mancozb mixed with three anti-oxidents within 120 h

从图 3中可看出：经1,2-苯二硫酚衍生化48 h后，对照组(CK)代森锰锌的相对含量为96.5%，且RSD小于5%，仍能满足测定要求^[14]，但在48 h后，其相对含量明显下降，RSD明显增大，60 h时RSD已远远高于5%；单独添加四氢呋喃时，待测液的稳定性并无明显改善，相对含量及RSD总体变化趋势和对照相似；单独添加40 mg/L抗坏血酸则可明显提高待测液的稳定性，72 h内相对含量在91.8%～100.1%之间，且RSD低于5%；同时添加四氢呋喃和抗坏血酸组待测液稳定性最好，72 h内代森锰锌的相对含量在93.0%～100.7%之间，且RSD小于3%，满足测定要求。因此，利用1,2-苯二硫酚衍生-高效液相色谱法测定二硫代氨基甲酸酯类化合物时，同时添加抗氧化剂四氢呋喃和抗坏血酸可明显提高待测样品的稳定性。 2.4 方法的线性范围及检出限

表 3中结果显示，在0.5～3.5和20～70 mg/L线性范围内，代森锰锌和代森联检测的线性关系良好。其中代森锰锌的检出限(LOD)为0.15 mg/L，代森联则为0.20 mg/L。

表 3(Table 3)

表 3 代森锰锌和代森联标准曲线的线性方程及检出限 Table 3 Linear equation and limit of detection of mancozeb and metiram 化合物 Chemicals 线性方程 Linear equation 线性范围 Linear range/(mg/L) 相关系数 Correlation coefficients,r 检出限 LOD/(mg/L) 代森锰锌mancozeb y=1.715x-0.078 1 0.5～3.5 0.999 4 0.15 y=1.687x- 0.022 5 20～70 0.999 9 0.15 代森联metiram y=0.762x-0.032 3 0.5～3.5 0.998 4 0.20 y=0.789x-0.065 2 20～70 0.999 8 0.20

表 3 代森锰锌和代森联标准曲线的线性方程及检出限 Table 3 Linear equation and limit of detection of mancozeb and metiram

表 4中结果表明，优化后的1,2-苯二硫酚衍生法较好地保证了二硫代氨基甲酸酯类杀菌剂待测液的稳定性，且结果重现性良好，在0.1和25 mg/L添加水平下，4种商品杀菌剂的添加回收率在96.1%～103.7%之间，RSD均小于3%。

表 4(Table 4)

表 4 4种二硫代氨基甲酸酯类杀菌剂的平均添加回收测定结果(n=3) Table 4 Recoveries of four ethylenebisdithiocarbamate fungicides(n=3) 杀菌剂 Fungicides 质量浓度范围 Concentration range/(mg/L) 添加水平 Spiked Level/(mg/L) 平均回收率 Avg. recovery/% 相对标准偏差 RSD/% 70%代森锰锌可湿性粉剂 0.5～3.5 1.0 98.2 2.1 70% mancozeb WP 20～70 25 97.2 1.9 68%精甲霜锰锌水分散粒剂 0.5～3.5 1.0 98.8 1.1 68% metalaxyl-m mancozeb WG 20～70 25 103.7 2.5 68%霜脲锰锌水分散粒剂 0.5～3.5 1.0 96.8 2.8 68%cymoxanil mancozeb WG 20～70 25 96.1 3.0 55%唑醚代森联水分散粒剂 0.5～3.5 1.0 102.9 2.0 55% pyraclostrobin metiram WG 20～70 25 100.3 0.8

表 4 4种二硫代氨基甲酸酯类杀菌剂的平均添加回收测定结果(n=3) Table 4 Recoveries of four ethylenebisdithiocarbamate fungicides(n=3)

采用优化后的方法，对不同质量浓度范围4种商品杀菌剂的有效成分含量进行了检测，结果见表 5。48 h内，除55%唑醚代森联水分散粒剂外，其他3种杀菌剂的相对含量为98.1%～105.7%，且RSD小于5%，满足测试要求；72 h 时，4种杀菌剂的相对含量在86.1%～105.7%之间，且RSD明显大于5%，已达不到准确测定的要求。对比前面抗氧化剂选择部分的试验结果(图 3)发现，测定实际商品杀菌剂中代森锰锌含量时，待测液的稳定性低于代森锰锌标准品，其原因可能是由于商品杀菌剂中含有的助剂对测试产生了一定的影响。因此，采用该方法测定二硫代氨基甲酸酯类商品杀菌剂时，宜在衍生化后48 h内进样检测。

表 5(Table 5)

表 5 优化后的 1,2-苯二硫酚衍生-高效液相色谱法对4种二硫代氨基甲酸酯类商品制剂的检测结果(n=3) Table 5 Results of four ethylenebisdithiocarbamate fungicides as measured by 1,2-benzenedithiol derivatization-HPLC method(n=3) 杀菌剂 Fungicides 质量浓度范围 Concentration range/(mg/L) 相对含量(相对标准偏差)Relative concentration(RSD)/% 0 h 48 h 72 h 70%代森锰锌可湿性粉剂 0.5～3.5 100.0(2.1) 101.6(3.7) 101.8(7.9) 70% mancozeb WP 20～70 100.0(1.8) 98.1(2.8) 103.7(4.7) 68%精甲霜锰锌水分散粒剂 0.5～3.5 100.0(1.3) 105.3(2.5) 105.7(6.9) 68% metalaxyl-m mancozeb WG 20～70 100.0(2.3) 102.7(4.5) 96.4(8.3) 68%霜脲锰锌水分散粒剂 0.5～3.5 100.0(2.7) 105.7(5.0) 90.9(11.2) 68% cymoxanil mancozeb WG 20～70 100.0(2.5) 105.7(1.7) 100.1(5.8) 55%唑醚代森联水分散粒剂 0.5～3.5 100.0(3.5) 98.9(7.9) 80.5(25.3) 55% pyraclostrobin metiram WG 20～70 100.0(3.2) 105.3(7.9) 86.1(18.2)

表 5 优化后的 1,2-苯二硫酚衍生-高效液相色谱法对4种二硫代氨基甲酸酯类商品制剂的检测结果(n=3) Table 5 Results of four ethylenebisdithiocarbamate fungicides as measured by 1,2-benzenedithiol derivatization-HPLC method(n=3)

对测定二硫代氨基甲酸酯类杀菌剂含量的 1,2-苯二硫酚衍生-高效液相色谱法进行了优化：确定了1,2-BDT的适宜浓度为12 mmol/L，代森锰锌和代森联分别用EDTA(pH 9.3)和DTPA(pH 10.0)解络合，同时添加体积分数为4%的四氢呋喃和 40 mg/L 的抗坏血酸作为抗氧化剂。采用4种常见的二硫代氨基甲酸酯类商品杀菌剂(质量浓度在0.5～70 mg/L之间)对优化后的方法进行了验证。结果表明，优化后的方法操作简便，省时，样本稳定性明显提高。相对于繁琐的甲基衍生化法，优化后的 1,2-苯二硫酚衍生化法检出物针对性强，不受二硫代氨基甲酸酯类常见代谢物乙撑硫脲及二硫化碳的影响，更适用于单一二硫代氨基甲酸酯类杀菌剂或只需确定二硫代氨基甲酸酯类化合物总量时的批量样本测试。