水稻恶苗病是一种常见种传真菌性病害，在世界各稻区均有发生，主要靠带菌种子传播，发病率高，对水稻生产威胁很大，一般可减产10%～20%，严重的达50%以上^[1]。Amatulli等^[2]研究发现，藤仓赤霉复合种与水稻恶苗病有关，其中Fusarium fujikuroi被认为是主要致病菌。近年来，水稻恶苗病在江苏省的发病率快速上升，发生程度也呈加重趋势，尤以机插稻和旱田直播稻发病较重，重病田块病株率超过35%。生产上主要采用咪鲜胺和氰烯菌酯浸种防治该病^[3]。咪鲜胺属于麦角甾醇生物合成抑制剂，用作水稻浸种剂防治水稻恶苗病已超过20 a，检测其抗药性对保护我国粮食安全生产意义重大。赵志华等^[4]研究表明，水稻恶苗病菌对咪鲜胺具有潜在的抗性风险；刘永锋等^[5]研究表明，田间恶苗病菌对咪鲜胺已有一定的抗性；陈夕军等^[6]分离到了8株抗咪鲜胺的恶苗病菌，且具有很高的抗性水平。氰烯菌酯(JS3992-19)是由国家南方农药创制中心江苏基地首次报道的新型2-氰基丙烯酸酯类杀菌剂，对镰刀菌属引起的病害防治效果良好，常用于防治小麦赤霉病、棉花枯萎病、香蕉枯萎病、水稻恶苗病和西瓜枯萎病等^[7]。研究发现，氰烯菌酯能很好地防治水稻恶苗病，且其与咪鲜胺无交互抗药性^{[8, 9, 10]}。鉴于此，笔者测定了江苏省水稻恶苗病菌对咪鲜胺和氰烯菌酯抗药性，以期明确生产上恶苗病菌对咪鲜胺的抗性水平，并拟建立氰烯菌酯的敏感性基线，以便科学使用不同的浸种剂减缓恶苗病菌菌株抗性群体的产生。 1 材料与方法 1.1 供试药剂及样品

97%咪鲜胺原药(prochloraz)和91.2%氰烯菌酯(JS399-19)均由江苏辉丰农化股份有限公司提供，均用甲醇配成1.00×10⁴ μg/mL的母液，于 4 ℃冰箱贮存，备用。

供试水稻恶苗病病株采自江苏省靖江、常州和姜堰地区，共91份。采样水稻品种为武运粳24、南粳5055、南粳44、宁9108、扬粳4038、南农粳7号、镇稻14、宁9108和镇稻681等。采集地长期使用咪鲜胺及其制剂作为浸种剂，但未用过氰烯菌酯。 1.2 试验方法 1.2.1 菌株的分离与鉴定

水稻恶苗病菌采用PSA培养基(马铃薯200 g，琼脂12 g，蔗糖20 g)在28 ℃条件下培养，单孢分离，得到的菌株按地区首字母缩写加数字进行编号^[11]。

将分离到的菌株置于摇床上于28 ℃条件下培养5 d，过滤获得菌丝。利用CTAB法提取菌株DNA，以真菌通用引物^{[12, 13]}ITS1(5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′)和ITS4(5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′)进行PCR扩增^[12]。总反应体系为30 μL(1 μL 10～100 ng的DNA，1 μL 10 pmol/mL的ITS1，1 μL 10 pmol/mL的ITS4，0.3 μL 5 U/μL的DNA 聚合酶，3 μL 10×buffer(+Mg²⁺)，2.4 μL 2.5 mmol/L的DNTPs，21.3 μL的无菌水)。扩增程序为：94 ℃预变性3 min，94 ℃变性1 min，55 ℃退火1 min，72 ℃延伸2 min，共35个循环；最后72 ℃延伸10 min。PCR产物经琼脂糖凝胶电泳检测后，送英潍捷基贸易有限公司测序。登录GenBank将所得到的序列进行相似性比对，记录比对结果，利用Mega软件进行序列比对并统计分离到的水稻恶苗病菌菌株数量。 1.2.2 水稻恶苗病菌对咪鲜胺的敏感性测定 根据菌丝生长速率法^[14] 测定。分别在含咪鲜胺质量浓度为0、0.01、0.1、1、5和10 μg/mL的PSA平板中心处接种4 mm菌碟，每个处理重复3次。在28 ℃下培养5 d(以不加药剂的PSA平板为对照)，用十字交叉法测量菌落直径，根据公式(1)计算抑制率，并计算EC₅₀值^[15]。

抑制率/%=[(对照菌落直径-处理菌落直径)/(对照菌落直径-菌碟直径)]×100(1)

依据陈夕军等^[6]的研究结果，确定病原菌对咪鲜胺的敏感性基线为0.000 75 μg/mL。根据公式(2)计算抗性倍数。将菌株对咪鲜胺的抗性水平分为低抗：5<抗性倍数≤10；中抗：10<抗性倍数≤100；高抗：抗性倍数>100^[6]。

抗性倍数=测定菌株EC₅₀值/敏感性基线(2)

测定方法按1.2.2节进行。氰烯菌酯质量浓度为0、0.01、0.1、1、10和100 μg/mL。从氰烯菌酯0.05 μg/mL开始，以0.3 μg/mL为截距，按照EC₅₀值将恶苗病菌分为6区间，统计每个区间菌株的个数和发生频率，绘制水稻恶苗病菌敏感性频率分布图，比较不同地区水稻恶苗病菌对氰烯菌酯敏感性水平^[16]。 2 结果与分析 2.1 菌株分离和鉴定

分离的菌株利用ITS通用引物经PCR扩增后，获得1段长约550 bp的DNA片段。将此片段在NCBI数据库进行序列对比和BLAST分析，经系统发育分析得到77株水稻恶苗病菌株Fusarium fujikuroi。其中，靖江15株，常州43株，姜堰19株，分别占分离菌株总数的19.48%、55.84%和24.68%。 2.2 水稻恶苗病菌对咪鲜胺的抗药性分布

结果(表 1)表明：来自靖江的菌株对咪鲜胺的抗性水平最低，其EC₅₀值在0.025 5～0.736 5 μg/mL之间，平均为0.158 9 μg/mL；常州的菌株抗性水平最高，EC₅₀值在0.019 6～1.332 9 μg/mL之间，平均为0.252 9 μg/mL；姜堰的菌株介于两者之间，EC₅₀值在0.023 0～0.639 3 μg/mL之间，平均为0.202 1 μg/mL。EC₅₀最小值(0.019 6 μg/mL)与最大值(1.332 9 μg/mL)相差67倍。中抗菌株18株，占23.38%，高抗菌株59株，占76.62%。

表 1(Table 1)

表 1 江苏省不同地区水稻恶苗病菌对咪鲜胺的抗性 Table 1 Resistance of Fusarium fujikuroi isolates to prochloraz from different areas in Jiangsu Province 来源 Origin EC50值范围 Range of EC50 value/ (μg/mL) EC50平均值 Average EC50 value/ (μg/mL) 抗性倍数 Resistance ratio 靖江Jingjiang 0.026～0.737 0.159 34.0～982 常州Changzhou 0.020～1.333 0.253 26.1～1777 姜堰Jiangyan 0.023～0.640 0.202 30.7～852

表 1 江苏省不同地区水稻恶苗病菌对咪鲜胺的抗性 Table 1 Resistance of Fusarium fujikuroi isolates to prochloraz from different areas in Jiangsu Province

在检测的3个地区，水稻恶苗病菌对咪鲜胺抗性差别较大，但高抗菌株比例均在60%以上。其中，常州35株，占81.40%；姜堰15株，占78.95%；靖江9株，占60.00%。说明水稻恶苗病菌对咪鲜胺产生了抗药性，与杨红福等的结果一致^[17]。 2.4 水稻恶苗病菌对氰烯菌酯的敏感性

结果(图 1)表明：77株水稻恶苗病菌中有 76株对氰烯菌酯的敏感性频率分布呈单峰曲线，近似正态分布。EC₅₀值最小为0.012 μg/mL，最大为2.040 μg/mL。EC₅₀值在0.65～0.95 μg/mL间的菌株出现的频率最高。氰烯菌酯对76株水稻恶苗病菌的平均EC₅₀值为(0.684±0.265) μg/mL。参照FAO划分标准，抗性菌株的EC₅₀值比敏感菌株的高5～10倍^[18]，本研究中虽然出现了一株对氰烯菌酯敏感性较低的菌株(CZ17)，但是该菌株的EC₅₀值与敏感菌株比值为2.98，表明其仍对氰烯菌酯表现敏感。建议将其平均EC₅₀值作为江苏省水稻恶苗病菌对氰烯菌酯的敏感性基线。

图 1

Fig. 1

图 1 水稻恶苗病菌对氰烯菌酯的敏感性频率分布 Fig. 1 Sensitivity frequency distribution of Fusarium fujikuroi to JS399-19

3个地区水稻恶苗病菌对氰烯菌酯的敏感性差异不显著(表 2)，其EC₅₀平均值在0.651～0.727 μg/mL之间。氰烯菌酯对姜堰菌株的平均 EC₅₀值最低，为0.651 μg/mL；对于常州的菌株，氰烯菌酯的平均 EC₅₀值最高，为0.727 μg/mL。

表 2(Table 2)

表 2 江苏省不同地区水稻恶苗病菌对氰烯菌酯的敏感性 Table 2 Sensitivity of Fusarium fujikuroi to JS399-19 from different areas in Jiangsu Province 来源 Origin EC50值范围 Range of EC50 value/ (μg/mL) EC50平均值 Average EC50 value/ (μg/mL) 靖江Jingjiang 0.235 ～1.142 0.677 a 常州Changzhou 0.012 ～2.040 0.727 a 姜堰Jiangyan 0.333 ～1.137 0.651 a 注: 同列数据后不同字母表示经邓肯氏新复极差法检验在P<0.05水平差异显著。 Note: Data in the same column followed by different lowercase letters mean significantly different by Duncan′s new multiple range test at P<0.05 level.

表 2 江苏省不同地区水稻恶苗病菌对氰烯菌酯的敏感性 Table 2 Sensitivity of Fusarium fujikuroi to S399-19 from different areas in Jiangsu Province

聚类分析结果(图 2)表明：氰烯菌酯对77株水稻恶苗病菌的EC₅₀值可分为5组，其中4组均包含不同地区的菌株，说明水稻恶苗病菌对氰烯菌酯的敏感性差异与菌株来源的地理位置无明显相关性，这与邓肯氏新复极差法的分析结果一致。采自常州地区的对氰烯菌酯敏感性较低的菌株CZ17的EC₅₀值聚类自成一组。

图 2

Fig. 2

图 2 氰烯菌酯对水稻恶苗病菌EC50值的系统聚类结果 Fig. 2 System clustering analysis on EC50 values of JS399-19 to Fusarium fujikuroi

镰刀菌在自然界中分布广泛、种类多样，种内的生理分化非常明显，形态学分类很难科学地反映其系统发育和亲缘关系^[19]。通过分子生物学方法减少了鉴定过程中主观因素的影响，使鉴定结果更准确^[20]。在发育过程中ITS片段具有很好的适应性，能经受更多的变异位点，具有序列多态性的特点，其序列不同可以用来对近缘的种属加以鉴别^[21]。在本研究中，经过ITS序列比对和系统发育分析得到77株水稻恶苗病菌Fusarium fujikuroi。江苏省从1995年开始使用咪鲜胺制剂取代多菌灵，用于防治水稻恶苗病。随着水稻种植面积的迅速扩大以及旱育秧技术的推广，加重了水稻恶苗病的发病趋势，因此咪鲜胺类药剂浸种得到了大规模应用^[2,22]。本研究发现，常州和姜堰地区的高抗菌株占本地区分离菌株的80%左右，高于靖江地区的(60%)，未发现敏感和低抗菌株，全部是中高抗性的菌株，这说明对咪鲜胺产生抗性的水稻恶苗病菌已经成为优势种群，利用咪鲜胺浸种防控恶苗病存在很大风险。杨红福等^[17]在江苏和上海的水稻上分离到33株水稻恶苗病菌，其对咪鲜胺的抗性频率达82.14%，这也是江苏省2012年水稻恶苗病大爆发的重要原因之一。

本研究中，通过离体测定江苏省未使用过氰烯菌酯的水稻种植区的77株水稻恶苗病菌对氰烯菌酯的敏感性，发现恶苗病菌对氰烯菌酯敏感性较高，且不同地区间差异不显著，但氰烯菌酯对不同水稻恶苗病菌的EC₅₀值跨度较大，这可能与病原菌自身差异性以及群体组成的多样性有关。刁亚梅等^[23] 和祝燕丽等^[8]推荐使用25%氰烯菌酯悬浮剂浸种防治水稻恶苗病，王龙根等^[6]也认为氰烯菌酯对水稻恶苗病菌具有较好的抑制作用。鉴于本研究中咪鲜胺抗性菌株均对氰烯菌酯表现敏感，且与李恒奎等的研究结果一致^[10]，建议在恶苗病菌对咪鲜胺抗性水平较高的地区使用氰烯菌酯替代咪鲜胺防治水稻恶苗病，以达到较好的防治效果。