组合化学起源于1963年R.B. Merrifield提出的多肽固相合成工作^[1]，其是通过构建和筛选化合物库的方法来对活性化合物进行追踪与结构优化。从20世纪80年代末开始应用于医药开发领域，近30年来，组合化学与高通量筛选技术已成为新农药发现和结构优化过程中的一项重要技术^{[2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10]}。常用的液相组合合成策略主要有两种：一种是采用混合物合成的“索引组合库合成”；另一种是含有单一库化合物的“平行合成”。相比较而言，混合物合成的效率可提高数倍，Pirrung等建立了该方法，并通过构建6×9的氨基甲酸酯类化合物库^[11]和6×8的四氢吖啶类化合物库^[12]，成功筛选到了对乙酰胆碱酯酶(AChE)具有高抑制活性的化合物，该方法因其实用性而受到了关注^{[13, 14, 15, 16]}。

芳基磺酰胺类农药大多具有良好的杀菌和除草活性。新型环烷基磺酰胺类化合物在农用杀菌剂的研究中也表现出了很好的应用前景。自从王道全研究组于1997年报道了2-氧代环十二烷基磺酰胺类化合物(1)对小麦赤霉病菌 Gibberlla zeae 和梨黑星病菌 Venturia nashicola 具有较好的抑制活性以来，相继已有多个系列类似物(2～8)的构效关系被研究^{[17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25]}，并成功开发出了候选创制杀菌剂——环己磺菌胺(开发代号CAUWL-2004-L-13)^{[26, 27, 28]}。

在前期研究中，笔者采用传统方法合成了一些2-酰氧基环己烷基磺酰胺类化合物^[29]，而其中所采用的酰氯与醇生成酯的反应非常适用于组合化学研究。为探讨组合化学在先导发现与结构优化中的应用，笔者采用组合合成方法合成了16个2-酰氧基环烷基磺酰胺类化合物组合库，通过气相色谱-质谱联用仪(GC-MS)和红外光谱分析了组合库中化合物的结构和含量；并分别采用菌丝生长速率法及黄瓜离体叶片法测试了组合库中混合物对黄瓜灰霉病菌的杀菌活性；初步探讨了组合库生物活性筛选中化合物的结构、含量和数量对筛选结果的影响。

组合合成路线见Scheme 1 。

Scheme 1

Scheme 1

Scheme 1

Spectrum 65型傅里叶红外光谱仪(溴化钾压片法)。AGILENT 6890-5973N 气相色谱-质谱联用仪[HP-5MS色谱柱(30 m×250 μm，0.25 μm)，含5%苯甲基硅氧烷；载气为氦气，流速1 mL/min；柱温初温100 ℃，升温速率15 ℃/min，终温280 ℃保留2 min；进样口温度230 ℃；分流模式进样，分流比40 ∶1；辅助线温度285 ℃；采集方式为扫描，扫描范围35～520 mAU；四级杆温度150 ℃；离子源温度230 ℃；电离方式为EI]。二氯甲烷、N,N-二甲基甲酰胺(DMF)和N,N,N′,N′-四甲基乙二胺(TMEDA)分别经干燥后使用。氨甲基树脂(aminomethyl resin，简写AM-resin)BR级，95%腐霉利(procymidone)原药，北京绿农科技有限公司。 1.2 供试菌株

黄瓜灰霉病菌Botrytis cinerea Pers.，由沈阳农业大学植物保护学院农药科学教研室采集、分离、培养并保存。 1.3 组合库的合成

按照N-取代苯基-2-羟基环己烷基磺酰胺类化合物结构中苯胺上取代基的类型，分成8个组合原料库，即A₁(苯环上含有给电子基团)、A₂(苯环2-位含有卤素原子)、A₃(苯环4-位含有卤素和三氟甲基)、A₄(苯环上含有两个氯原子)、A₅(苯环含有两个三氟甲基)、A₆(苯环上含有三氟甲基和氯原子)、A₇(苯环上含有3个氯原子)、A₈(苯环上含有给电子和吸电子两种取代基)，每个库中的化合物数目1～5个不等。将每个组合库分别与两种酰氯反应，共生成16个目标组合库。 1.3.1 化合物A的合成

按照文献^[23]的方法合成。 1.3.2 酰氯B的合成 1.3.2.1 2-乙氧基乙酰氯(B₁)的合成

室温下，将20 mL无水乙醇和 4 g 氢氧化钠(0.1 mol)加入到 50 mL 三口瓶中，回流反应30 min，冷却到室温后加入11.7 g(0.1 mol)氯乙酸钠，升温回流反应 4 h。先减压蒸去乙醇，再用甲苯共沸脱水4 h。待水脱尽，冷却到室温，加入20 mL干燥的二氯甲烷和0.1 mL DMF，搅拌下缓慢滴加9.6 mL草酰氯，回流反应2 h，经减压蒸馏得到产物7.1 g，沸点 65～67 ℃/4.4 kPa(33 mmHg)，收率56.3%。 1.3.2.2 4-氟苯甲酰氯(B₂)的合成

按照文献方法^[30]，以草酰氯为氯化试剂，DMF为催化剂，在二氯甲烷中反应得到，收率68.2%。 1.3.3 组合库A_xB_y的合成

以库A₁B₂的合成为例。室温下将干燥的二氯甲烷20 mL、库A₁(含有5个2-羟基环烷基磺酰胺类化合物，每个0.5 mmol)、干燥的TMEDA 0.29 mL和3A分子筛2 g，先后加入到50 mL三口瓶中，搅拌下缓慢加入4-氟苯甲酰氯(3.25 mmol)，加热到25～30 ℃，搅拌反应6 h，然后加入AM-resin 1.4 g，继续搅拌3 h，抽滤，滤液用水(10 mL × 3)洗涤，经无水硫酸镁干燥1 h，抽滤，减压浓缩，得到组合库A₁B₂产物0.91 g，粗收率94.8%，化合物总含量96.1%。

用类似的方法制备得到其他组合库，库中化合物的结构和含量经薄层层析(TLC)、红外光谱(IR)及气相色谱-质谱联用(GC/MS)仪分析确证。 1.4 活性筛选 1.4.1 菌丝生长速率法

采用菌丝生长速率法^[31]测定目标组合库对番茄灰霉病菌的抑菌活性。以腐霉利为对照药剂。按照库中化合物的总含量计算有效浓度，设置n×50 μg/mL和n×10 μg/mL两个梯度，其中n是库中化合物的个数。 1.4.2 黄瓜离体叶片法

将16个组合库分别配制成质量分数为2.5%的乳油，用水稀释得到 n ×200 μg/mL和n×40 μg/mL两个梯度，其中n是库中化合物的个数。在直径9 cm的培养皿中铺上 4层纱布，用无菌水润湿，剪取生长期一致的黄瓜子叶3片铺于纱布上。将配制好的药液喷洒于子叶上，待药液阴干后，于每片子叶中部接种直径5 mm的灰霉病菌菌饼。以腐霉利为对照药剂，每个处理3次重复。置于智能人工气候箱内，在24 ℃±1 ℃、相对湿度90%以上及黑暗 ∶光照=12 h ∶12 h条件下培养，待空白对照充分发病后测量病斑直径，以抑制率大小考察防治效果。

2 结果与分析 2.1 组合合成与结构鉴定

酯化反应是组合合成中最常用的反应类型，考虑到酰氯的稳定性较差，为了避免产生过多副产物，在本研究中采用单个过量的酰氯(B)与2-羟基环己烷基磺酰胺(A)的原料库反应，快速合成了16个目标组合库，共含36个库化合物。采用固相载体氨甲基树脂(AM-resin)除去过量酰氯只需要简单的过滤操作即可，省时省力^[32]。在反应结束时，用TLC检测确认组合库中已无原料A，在IR谱图中，3 400 cm^-1附近的羟基吸收峰完全消失，1 720 cm^-1附近的羰基吸收峰非常明显，说明A和B反应充分。GC-MS的分析结果见表 1。组合库的收率普遍较高，13个库的收率在80%以上，库中化合物含量也普遍较高，其中含量达90%的有12个库。4-氟苯甲酰氯B₂与A₁～A₈反应，生成的组合库化合物含量均达90%，明显好于与2-乙氧基乙酰氯(B₁)反应生成的组合库。库中单个化合物的含量存在较大差异。在16个组合库中预计含有36个库化合物，经GC-MS检查到了28个化合物的分子离子峰。其中含有4-氟苯胺、2-三氟甲基苯胺、3,5-双三氟甲基苯胺的6个库化合物虽未检测到其分子离子峰，但可以通过特征碎片峰来判断其存在。只有含2-溴苯胺的两个库化合物未被检测到。在所有的质谱图中都有环己烷(m/z=81)的碎片峰存在，说明结构中的C—SO₂键和C—O键易发生断裂。库A₄B₁的GC-MS谱图见图 1，质谱裂解原理见图 2。

表 1(Table 1)

表 1 组合库的GC-MS分析数据 Table 1 GC/MS data of the compound libraries 库编号 Library number 库化合物 编号 Compd. No. R1 R2 收率 Yield/ % 总含量 Total content/ % 库化合物含量 Percentage composition of single component/% 分子离子峰 (m/z) A1B1 1 H C2H5OCH2 93.3 68.5 16.4 341(M+),59,93 2 4-CH3 24.7 355(M+),59,107 3 2,4-(CH3)2 9.3 369(M+),59,120 4 2-CH3,6-C2H5 8.4 383(M+),59,135 5 2,5-(OCH3)2 9.7 401(M+),59,153 A2B1 1 2-CF3 85.6 98.3 54.8 359,160,110,59 2 2-Cl 43.5 375(M+),249,185,127,59 3 2-Br 0 / A3B1 1 4-F 89.1 61.9 7.2 315,110,59 2 4-Cl 30.2 375(M+),59 3 4-Br 24.5 421,419(M+),171,59 A4B1 1 2,4-Cl2 83.7 93.4 57.0 409(M+),159,59 2 3,4-Cl2 36.4 409(M+),159,59 A5B1 1 2,5-(CF3)2 80.2 100 61.7 477(M+),228,59 2 3,5-(CF3)2 38.3 409(M+-CF3),228,59 A6B1 1 2-CF3,4-F 79.0 67.1 67.1 443(M+),355,59 A7B1 1 2,4,5-Cl3 75.9 96.0 96.0 445(M+),342,195,59 A8B1 1 2-CH3,4-F 50.3 48.0 48.0 373(M+),125,59 A1B2 1 H 4-FC6H4 94.8 96.2 22.0 377(M+),285,253,123,92 2 4-CH3 18.7 391(M+),285,123,106 3 2,4-(CH3)2 38.9 405(M+),285,221,120 4 2-CH3,6-C2H5 8.5 405(M+-Me),297,135,123,95 5 2,5-(OCH3)2 8.1 437(M+),298,152,139,123 A2B2 1 2-CF3 85.1 100 51.8 395,285,255,221,163,123,95 2 2-Cl 48.2 411(M+),272,126,123 3 2-Br 0 / A3B2 1 4-F 90.3 94.2 20.7 256,139,123,110 2 4-Cl 27.2 411(M+),285,221,126 3 4-Br 46.3 455,457(M+),437,285,171,123 A4B2 1 2,4-Cl2 90.2 89.5 68.6 445(M+),285,221,161,123 2 3,4-Cl2 20.9 445(M+),285,221,161,123 A5B2 1 2,5-(CF3)2 93.5 91.7 61.8 513(M+),285,228,123 2 3,5-(CF3)2 29.9 445(M+-CF3),285,161,123 A6B2 1 2-CF3,4-F 87.6 90.31 90.31 479(M+),339,285,195,123 A7B2 1 2,4,5-Cl3 84.8 100 100 481,479(M+),341,285,193,123 A8B2 1 2-CH3,4-F 93.2 96.1 96.1 409(M+),285,221,124,123,95

表 1 组合库的GC-MS分析数据 Table 1 GC/MS data of the compound libraries

图 1

Fig. 1

图 1 组合库A4B1的GC-MS谱图 Fig. 1 The GC-MS of library A4B1

图 2

Fig. 2

图 2 组合库A4B1中化合物的质谱裂解过程 Fig. 2 The interpretation of mass spectrum for compound in the library A4B1

菌丝生长速率法测定结果(表 2)表明：16个组合库中的混合物对番茄灰霉病菌的抑菌活性均表现出了较好的浓度梯度关系，高浓度下抑制活性明显。从构效关系看：A₁～A₈分别与酰氯B₁ 反应生成的组合库的活性普遍高于其与B₂反应生成的组合库的活性；对于N-取代苯基-2-羟基环己烷基磺酰胺(A)，当苯环上含有多个Cl或CF₃等吸电子基团时，有助于活性的提高，如组合库A₅B₁、A₆B₁和A₇B₁的抑制率均明显高于对照药剂腐霉利；此外，卤素原子在4-位时活性高于在2-位，如A₃B₁的活性明显高于A₂B₁。黄瓜离体叶片法得到了相同的构效关系结果(表 3)。综合两种生物测定结果，确定组合库A₆B₁和A₇B₁为活性库，其活性与腐霉利相当。

表 2(Table 2)

表 2 目标组合库对番茄灰霉病菌的抑菌活性(菌丝生长速率法) Table 2 Fungicidal activity of combinatorial libraries against B. cinerea (Mycelial growth rate method) 库编号 Library number 库中化合物数量 Number of compound (n) 质量浓度1 Concentration 1 (n × 50 μg/mL) 抑制率1* Inhibition rate 1* (± SEM)/% 质量浓度2 Concentration 2 (n × 10 μg/mL) 抑制率2* Inhibition rate 2* (± SEM)/% A1B1 5 250 53.51±2.00 e 50 37.41±2.58 d′ A2B1 3 100 40.59±2.22 g 30 29.70±3.41 e′ A3B1 3 150 59.64±3.51 d 30 53.96±3.49 b′ A4B1 2 100 63.49±1.02 c 20 35.60±2.94 d′ A5B1 2 100 75.96±2.38 a 20 67.34±1.72 a′ A6B1 1 50 79.59±1.21 a 10 69.84±2.34 a′ A7B1 1 50 76.19±2.55 a 10 63.26±1.92 a′ A8B1 1 50 47.17±2.78 f 10 36.73±3.63 d′ A1B2 5 250 26.45±1.33 k 50 14.31±1.73 h′ A2B2 3 100 38.99±1.25 i 30 9.33±2.14 i′ A3B2 3 150 39.59±0.91 i 30 24.26±1.39 g′ A4B2 2 100 28.67±1.42 k 20 23.49±1.39 g′ A5B2 2 100 35.55±1.99 j 20 25.22±2.34 g′ A6B2 1 50 44.65±1.33 h 10 28.85±2.58 f′ A7B2 1 50 46.07±1.42 gh 10 31.15±2.26 f′ A8B2 1 50 12.09±1.79 l 10 3.41±1.34 j′ 腐霉利procymidone 1 50 66.89±2.68 b 10 46.26±2.54 c′ 注：同列数据后不同小写字母表示不同处理组间差异显著(P<0.05)。 Note: Different lowercase letters followed by the data in the same column indicate significant difference between treatments(P<0.05).

表 2 目标组合库对番茄灰霉病菌的抑菌活性(菌丝生长速率法) Table 2 Fungicidal activity of combinatorial libraries against B. cinerea (Mycelial growth rate method)

表 3(Table 3)

表 3 目标组合库对番茄灰霉病菌的防治效果(离体叶片法) Table 3 Control efficacy of combinatorial libraries against B. cinerea (Leaf method) 库编号 Library number 库中化合物数量 Number of compound (n) 质量浓度1 Concentration 1 (n × 200 μg/mL) 抑制率1* Inhibition ratio 1* (±SEM)/% 质量浓度2 Concentration 2 (n × 40 μg/mL) 抑制率2* Inhibition ratio 2* (±SEM)/% A1B1 5 1 000 35.29±3.66 f 200 11.62±1.57 g′h′ A2B1 3 600 23.15±6.15 g 120 11.41±2.45 g′h′ A3B1 3 600 32.99±4.02 f 120 13.50±3.22 f′g′h′ A4B1 2 400 57.92±7.09 c 80 14.13±2.33 e′f′g′ A5B1 2 400 38.24±6.02 def 80 17.89±1.38 e′f′ A6B1 1 200 78.25±5.76 b 40 35.23±2.60 c′ A7B1 1 200 79.89±5.28 ab 40 42.75±1.54 b′ A8B1 1 200 27.42±3.66 g 40 16.63±2.82 d′e′ A1B2 5 1 000 34.01±3.24 i 200 12.96±1.82 i′j′ A2B2 3 600 43.66±2.98 fg 120 12.28±3.85 i′j′ A3B2 2 400 17.14±3.54 k 80 10.93±1.82 j′ A4B2 2 400 35.56±3.93 hi 80 13.97±1.82 g′h′I′j′ A5B2 2 400 40.28±4.39 gh 80 19.87±2.51 e′ A6B2 1 200 46.02±4.90 e 40 15.99±1.30 f′g′h′ A7B2 1 200 52.43±4.39 d 40 24.43±3.06 d′ A8B2 1 200 17.00±4.25 k 40 11.94±2.12 i′j′ 腐霉利procymidone 1 200 84.15±3.39 a 40 50.07±2.33 a′ 注：*同列数据后不同小写字母表示不同处理组间差异显著(P<0.05)。 *Note: Different lowercase letters followed by the data in the same column indicate significant difference between treatments(P<0.05).

表 3 目标组合库对番茄灰霉病菌的防治效果(离体叶片法) Table 3 Control efficacy of combinatorial libraries against B. cinerea (Leaf method)

采用组合合成方法得到的是混合物库，与单个化合物的合成和活性筛选相比，其具有快速、高效的优点。但人们常常对混合物筛选方法的科学性与结果的准确性产生怀疑，对此，笔者就组合合成及生物活性筛选中存在的一些问题进行初步讨论。

笔者认为，对于单一化合物，在同一测试剂量下即可确定其构效关系；而对于混合物库，其生物测定结果与库中化合物的含量、结构和数目均有关系，即存在量效关系、构效关系和数效关系，可概括为“三效关系”，它们之间是相互关联的。从表 2和表 3中的数据可以看出，在本研究中，库中化合物的数量与活性之间并无相关性，而化合物的结构与活性之间却存在比较明显的相关性，由此推断在组合库筛选中构效关系应该是主要的，数效关系是次要的。为了进一步探讨库活性的构效关系和数效关系，笔者又将活性高的库A₆B₁与活性低的库A₂B₁合并，获得了库“A₆B₁+A₂B₁”。在库A₆B₁、A₂B₁和 A₆B₁+A₂B₁中，分别含有1、3、4个库化合物，其对番茄灰霉病菌的杀菌活性测定结果见图 3。可以看出，菌丝生长速率法和离体叶片法测定的趋势完全一致：A₆B₁的活性略低于A₂B₁+A₆B₁，但远远高于A₂B₁，这一结果再次说明混合物库的活性主要是由构效关系决定的。

图 3

Fig. 3

图 3 含有不同数量化合物的组合库之间的活性比较 (质量浓度：n × 50 μg/mL) Fig. 3 Comparison of activity among combinatorial libraries containing different numbers of compounds (concentration: n × 50 μg/mL)

对于上述结果的出现，笔者认为：混合物库筛选的理论基础应是竞争性抑制原理，同系列化合物对于同一菌种应具有相同的作用方式和机制，它们与相同靶点的结合具有竞争性，只有与靶点结合力强的化合物才能与其充分结合，产生直接的抑制效果。所以，混合物库对病原菌的抑制效果主要决定于库中活性最高的化合物的作用，而与库中含有几个化合物关系不大。 另一个重要的关系是量效关系。理论上只有当库中每个化合物的含量相等时才能在相同的作用剂量下获得构效关系，但实际情况是库中化合物的含量高低不同，对此要至少设定一高一低两个筛选浓度，同时为保证库中每个化合物都能达到有效作用浓度，在混合物库筛选中选用了n×m μg/mL(n为库中化合物个数，m为质量浓度值)。杀菌活性测定结果主要取决于单个化合物的质量浓度(m μg/mL)，而不是总质量浓度(n×m μg/mL)，也就是说化合物数量n对库活性的影响不大。

本研究中构建的是非均匀组合库，与文献^[33]中构建的大小相同的组合库相比，更加灵活，不受原料种类的限制。以上“三效关系”的讨论也说明，非均匀组合物库的构建方案是可行的。用该方法获得的活性化合物与文献^[29]中传统方法的研究结果一致，而效率却明显提高。单从数字上看，采用传统的单一化合物的合成方法，需要进行合成与生物测定各36次，而组合方法各16次，工作量节省55.6%，更重要的是省去了大量的对化合物进行纯化与结构鉴定过程，可以更加集中精力对选定的活性库化合物进行研究，明显提高了先导化合物发现的效率。

虽然将组合化学与合理药物设计相结合会加快药物的开发进程^[34]，但近年来其在农药的研发中却一直未得到很好的应用，其原因是多方面的。本研究证明了常规的农药筛选模型是适合组合库筛选的，因此在新农药的先导发现和结构优化过程中合理使用组合化学方法具有重要的应用价值。