虱螨脲、灭幼脲、氟啶脲和除虫脲均属于苯甲酰脲类杀虫剂，具有抗蜕皮激素的生物活性，通过抑制昆虫表面几丁质的合成而杀死昆虫^{[1, 2, 3]}，主要用于防治棉花、玉米、蔬菜、果树等的潜叶蛾、小菜蛾和菜青虫等多种害虫及螨类^{[4, 5, 6, 7, 8]}。很多国家和地区对其均制定了严格的残留限量标准，如日本的肯定列表中规定，蔬菜中苯甲酰脲类农药残留限量为10 μg/kg^[9]。

目前，主要采用液相色谱、液相色谱-串联质谱法检测蔬菜^{[10, 11, 12]}、茶叶^{[14, 15]}及水果^{[16, 17]}中苯甲酰脲类农药的残留，但其在柑橘中残留的检测方法未见报道。鉴于此，笔者采用超高效液相色谱-串联质谱负离子模式(UPLC-ESI-MS/MS)同时检测柑橘中4种苯甲酰脲类农药的残留，并采用QuEChERS前处理方法，大大缩短了检测时间，提高了检测限。

1 材料与方法 1.1 主要仪器

超高效液相色谱仪(美国Waters公司)；API4000⁺三重四级杆质谱仪(美国AB公司)；IKAT25匀浆机(上海万捷科技有限公司)；SB-400DTY超声波清洗仪(宁波新芝生物科技股份有限公司)；SHZ-B水浴恒温振荡器(常州诺基仪器有限公司)等。 1.2 药剂与试剂

虱螨脲(lufenuron)、灭幼脲(chlorbenzuron)、氟啶脲(chlorfluazuron)和除虫脲(diflubenzuron)标准品[纯度均≥99%，农业部环境质量监督检验测试中心(天津)]；乙腈和甲醇(HPLC级，美国Fisher公司)；乙二胺-N-丙基硅烷(PSA，上海安谱科学仪器有限公司)；其余试剂为市售分析纯。 1.3 标准溶液的配制

分别准确称取0.100 g(精确至0.001 g)各标准品于4个100 mL容量瓶中，用乙腈溶解并定容，得到1 000 μg/mL标准储备液。分别准确移取0.1 mL标准储备液于同一个10 mL容量瓶中，用乙腈定容，得到10 μg/mL混合标准储备液。分别准确移取0.050、0.10、0.25、0.50和1.0 mL的混合标准储备液于50 mL容量瓶中，用乙腈定容分别得到0.01、0.02、0.05、0.1和0.2 μg/mL系列混合标准工作液。 1.4 样品前处理

供试柑橘采自海南岛(经测定不含虱螨脲、灭幼脲、氟啶脲和除虫脲)。取全果样品采用四分法缩分后，用食品料理机搅碎，混匀，留250 g样品。准确称取5.00 g(精确至0.01 g)样品共4份于50 mL离心管中，分别加入乙腈10.0 mL，用匀浆机高速匀浆2 min，超声提取30 min，加入3.0 g 氯化钠，迅速摇匀，振荡15 min，于8 000 r/min下离心10 min。分别称取0.05 g PSA和0.15 g无水硫酸镁于10 mL离心管中，加入5.0 mL上层乙腈提取液，充分混合，于8 000 r/min下高速离心10 min。移取4.00 mL上清液蒸干，用V(乙腈)∶V(水)=1∶1 的溶液定容至2.0 mL，待测。4次重复。 1.5 UPLC-MS/MS条件

色谱条件：Waters ACQUITY UPLC BEH C₁₈ 色谱柱(50 mm×2.1 mm，粒径1.7 μm)；流速0.40 mL/min；流动相乙腈-水洗脱梯度见表 1；进样量2 μL。

表 1(Table 1)

表 1 梯度洗脱条件 Table 1 Gradient elution parameters 时间 Time/ min 流速 Flow rate/ (mL/min) 流动相 Mobile phase 乙腈Acetonitrile/% 水Water/% 0.0 0.4 30 70 0.2 0.4 80 20 2.0 0.4 80 20 2.2 0.4 30 70 5.0 0.4 30 70

表 1 梯度洗脱条件 Table 1 Gradient elution parameters

质谱条件：电喷雾负离子扫描(ESI^-)，多反应检测(MRM)模式进行检测。碰撞气(CAD):6；气帘气(CUR)：137.9 kPa；雾化气(Gs1，Gs2)：344.75 kPa；喷雾电压(IS)：-4 500 V；离子源温度(TEM)：600.0 ℃。选择性离子监测参数见表 2。

表 2(Table 2)

表 2 离子对及其优化参数 Table 2 Optimized parameters of ion pair 农药 Pesticide 保留时间 Retention time/min 定性、定 量离子对 Q1/Q3,m/z 锥孔 电压 DP/V 碰撞 电压 CE/V 虱螨脲 lufenuron 1.03 508.9/338 508.9/325* -77 -16.6 -22.8 灭幼脲 chlorbenzuron 0.84 307/126 307/154* -76 -28.1 -15.1 氟啶脲 chlorfluazuron 1.22 538/446 538/355* -86 -21 -26 除虫脲 diflubenzuron 0.82 309/126 309/93* -70 -39 -59 注：*表示定量离子。 Note: * indicate quantitative ion.

表 2 离子对及其优化参数 Table 2 Optimized parameters of ion pair

4种农药的混合标准溶液按1.5节的色谱条件连续进样6次，记录4种农药的峰面积，根据峰面积计算相对标准偏差(RSD)。

分别称取1.4节制备的样品各5.00 g，每组5个重复。在空白样品中分别添加质量分数为0.01、0.05和0.1 mg/kg的虱螨脲、灭幼脲、氟啶脲和除虫脲的混合标准品溶液，按照1.4节提取方法和1.5节色谱条件进行分析，计算添加回收率和RSD。 2 结果与分析 2.1 色谱条件的确定

分别对比了以甲醇/水、乙睛/水作流动相的分离效果。结果表明：用乙腈/水作流动相洗脱分离效果较好。按表 1中的梯度洗脱条件，4种农药均有保留，仪器响应信号较高，灵敏度和分辨率较好。 2.2 质谱条件的优化

采用0.1 mg/L的虱螨脲标准溶液，以10 μL/min 的流速进行Q1扫描，确定母离子，在电喷雾正负离子(ESI^+/-)模式下分别进行全扫描。结果发现：在ESI⁺模式下，响应值在10⁴数量级；在ESI^-模式下响应较好，响应值在10⁵数量级，相差1个数量级。 故选择在ESI^-模式下检测，可满足灵敏度要求。用蠕动泵仪10 μL/min的流速连续注射，对4种农药进行一级质谱分析(Q1扫描)，得准确分子离子峰；对准确分子离子峰进行二级质谱分析(子离子扫描)得碎片离子信息，优化碰撞能量(见图 1)。

图 1

Fig. 1

图 1 多反应监测模式下4种农药的标准品(a)、柑橘空白样品(b)及样品添加(0.01 mg/kg) (c)总离子及定量离子流(d、e、f、g)谱图Fig. 1 Total and daughter ion chromatograms of standard(a),blank(b) and spiked samples (0.01 mg/kg)(c) under multiple reaction monitoring(MRM)mode(d,e,f,g)

对0.01～0.2 μg/mL系列浓度的混合标准工作液进行分析测定，以各农药的定量离子峰面积(y)为纵坐标，以其质量浓度(x)为横坐标绘制标准曲线，得到4种农药的线性方程及相关系数(见表 3)。 结果表明：在0.01～0.2 μg/mL范围内，方程的线性关系良好。在此条件下，除虫脲、灭幼脲、虱螨脲和氟啶脲的保留时间分别为0.81、0.84、1.01和1.20 min。

表 3(Table 3)

表 3 4种农药的线性方程及其相关系数* Table 3 Linear equations and determination coefficient for the tested pesticides 农药 Pesticide 线性方程 Linear equations 相关系数 Correlation coefficient(r) 虱螨脲lufenuron y =6.48×106x +2.2×104 0.999 5 灭幼脲chlorbenzuron y=5.18×106x+2.06×103 0.999 9 氟啶脲chlorfluazuron y=7.13×105x+3.49×103 0.999 4 除虫脲diflubenzuron y=4.2×105x+1.1×103 0.999 8 * 线性范围(Linear):0.01~0.2 μg/mL。

表 3 4种农药的线性方程及其相关系数* Table 3 Linear equations and determination coefficient for the tested pesticides

根据3倍信噪比计算，柑橘中虱螨脲、灭幼脲、氟啶脲和除虫脲的仪器检出限(LOD)分别为7.82×10^-5、3.34×10^-5、3.16×10^-4和6.06×10^-4 ng，通过实际添加回收试验确定柑橘中4种农药的定量限(LOQ)为0.01 mg/kg。 2.3.3 精密度和准确度

精密度测定结果表明：该方法精密度良好，相对标准偏差(RSD)为0.86%。准确度试验结果(表 4)表明：4种供试药剂在3个添加水平下，平均回收率在92%～105%之间，RSD在0.4%～3.3%之间，均满足定量分析要求。

表 4(Table 4)

表 4 4种农药的平均添加回收率及相对标准偏差(n＝5) Table 4 Average recovery and the relative standard deviation (RSD) for the tested pesticides(n＝5) 农药 Pesticide 添加水平 Spiked level/ (mg/kg) 平均回收率 Average recovery/% 相对标准偏差 RSD/% 虱螨脲lufenuron 0.01 98 1.8 0.05 105 0.4 0.1 104 1.0 灭幼脲 chlorbenzuron 0.01 99 2.5 0.05 101 2.7 0.1 101 2.1 氟啶脲 chlorfluazuron 0.01 92 3.0 0.05 96 0.8 0.1 93 1.2 除虫脲 diflubenzuron 0.01 94 3.3 0.05 94 1.5 0.1 101 1.0

表 4 4种农药的平均添加回收率及相对标准偏差(n＝5) Table 4 Average recovery and the relative standard deviation (RSD) for the tested pesticides(n＝5)

3 结论及讨论

本研究采用QuEChERS/UPLC-ESI-MS/MS，以ESI^-扫描和MRM模式，建立了同时检测柑橘中虱螨脲、灭幼脲、氟啶脲和除虫脲4种苯甲酰脲类农药残留量的方法。该方法对4种供试农药的定量限LOQ均为0. 01 mg/kg，低于张清明等^[17]报道的采用液相色谱法测定梨中除虫脲、氟虫脲和氟啶脲的LOQ 0.05 mg/kg。4种农药在1.40 min内可完全出峰，检测时间为5 min，与张清明等^[17]的17.3 min相比，大大缩短了检测时间，同时减少了溶剂用量，提高了分析的选择性和检测的灵敏度。该方法的线性、灵敏度、准确度和精密度均能满足残留分析的要求。