2014, Vol. 16
植物内生菌(endophyte)是指那些在其生长的一定阶段或全部阶段生活于健康植物各种组织和器官内部或细胞间隙的真菌或细菌[1,2]。植物内生真菌是一类代谢产物丰富、应用前景广阔的微生物资源，目前已报道从内生真菌中得到的生物活性物质包括抗生素、抗肿瘤化合物、抗氧化化合物等[3]。
球毛壳菌Chaetomium globosum是子囊菌中毛壳菌属的模式种，分布普遍，且广泛存在于土壤、植物残体和食草动物粪便等多种基物中，具有产生纤维素酶、分解纤维素的能力。1973年Sekita首次从球毛壳菌代谢产物中分离获得球毛壳菌素 A 和 B(chaetoglobosin A，B)[4]。此后一系列球毛壳菌素类化合物及类似物被相继发现，如chaetoglobosin U[5]、chaetoglobosin Vb[6]、chaetoglobosin Y[7]、cytoglobosins A-G[8]和MBJ-0038～MBJ-0040[9]等，其中chaetoglobosin U、cytoglobosins C 和 cytoglobosins D 表现出明显的抗癌活性，chaetoglobosin Y对多种植物病原真菌有一定的抑菌活性，但活性并不突出。球毛壳菌素A在球毛壳菌素家族中最早被分离得到，对其研究主要集中在抗肿瘤活性上[10]。
农用抗生素是目前生物农药中商品化程度最高的类型，但与化学农药相比，其品种依然较少，且大都来自土壤放线菌。本课题组以植物内生菌为研究对象，在筛选新型农用抗生素的研究中，从侧柏Platycladus orientalis中分离出一株内生真菌(编号ZH-32)，经初步鉴定为球毛壳菌C.globosum ZH-32。初步研究表明，ZH-32菌株发酵液对多种病原菌有强烈的抑制作用，为明确其发酵液的抑菌活性成分，本研究采用大孔树脂吸附、硅胶柱层析及反相高效液相色谱等技术，从ZH-32菌株发酵液中分离出其主要抑菌活性成分WH-01，并对其进行了结构鉴定及抑菌活性评价。
1 材料与方法 1.1 供试材料 1.1.1 内生真菌ZH-32，从侧柏叶中分离得到，初步鉴定为球毛壳菌C.globosum ZH-32，保存于西北农林科技大学农药研究所。
1.1.2 培养基马铃薯葡萄糖液体培养基(马铃薯200 g、葡萄糖10 g、蔗糖10 g、蛋白胨0.5 g、乙酸钠1.66 g、MgSO4·7H2O 1.02 g、纯净水1 000 mL)，用于ZH-32菌株摇瓶发酵；PDA培养基(马铃薯200 g、葡萄糖20 g、琼脂15 g、纯净水1 000 mL)，用于内生真菌分离纯化及病原真菌培养；牛肉膏蛋白胨培养基(牛肉膏3 g、蛋白胨10 g、氯化钠 5 g、琼脂粉20 g、纯净水1 000 mL)和Mueller-Hinton肉汤培养基(杭州大和微生物试剂有限公司)，用于病原细菌培养。所有培养基在121 ℃、1×105 Pa高压灭菌30 min 备用。
1.1.3 种子液制备将ZH-32菌株接种于PDA培养基上，于25 ℃下培养7 d，在无菌条件下制成 3 cm×3 cm菌饼，接种于100 mL马铃薯葡萄糖液体培养基中，于180 r/min、28 ℃下振荡培养16 h。
1.1.4 发酵液制备将20 mL种子液接种于80 mL 马铃薯葡萄糖液体培养基中，于180 r/min、28 ℃下振荡培养12 d。
1.1.5 病原真菌番茄灰霉病菌Botrytis cinerea、小麦赤霉病菌Fusarium graminearum、苹果炭疽病菌Colletotrichum gloeosporioides、玉米弯孢病菌Curvularia lunata、烟草赤星病菌Alternaria alternate、茄子黄萎病菌Verticillium dahliae、西瓜枯萎病菌Fusarium oxysporum和油菜菌核病菌Sclerotinia sclerotiorum由西北农林科技大学农药研究所保存并提供。将病原真菌接种于PDA培养基，于25 ℃下培养3～7 d。
1.1.6 病原细菌枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis、蜡状芽孢杆菌Bacillus cereus、铜绿假单孢菌Pseudomonas aeruginosa、金黄色葡萄球菌Staphylococcus aureus和大肠埃希氏菌Escherichia coli，购自中国普通微生物菌种保藏管理中心。将病原细菌接种于牛肉膏蛋白胨琼脂培养基，于37 ℃下培养1 d。
1.1.7 试剂及仪器HPD100大孔吸附树脂(河北宝恩树脂科技有限公司)；甲醇(HPLC级)(美国Tedia公司)；200～300目 (粒径54～74 μm)硅胶(青岛海洋化工厂)；氨苄青霉素(USP级)(购自上海国药集团化学试剂有限公司)；石油醚、乙酸乙酯均为市售分析纯。 制备型高效液相色谱(HPLC)系统：Waterers 600E高效液相色谱仪，配UV检测器(美国Waters公司)；分析型HPLC系统：Shimadzu LC-6AD高效液相色谱仪，配二极管阵列检测器(日本岛津公司)；Bruker RPX 500MHz核磁共振仪(德国Bruker公司)。
1.2 ZH-32菌株发酵液抑菌活性测定 1.2.1 对病原细菌的抑菌活性采用张继文[11]和Sbrana[12]报道的管碟法测定。以清水为空白对照，每处理3次重复。于37 ℃恒温箱中培养12 h后观察抑菌圈的透明程度，并用十字交叉法测量抑菌圈直径。
1.2.2 对病原真菌菌丝生长的抑制作用采用菌丝生长速率法[13]。每处理3次重复。于25 ℃恒温箱中培养72～96 h，用十字交叉法测量菌落生长直径，按(1)式计算菌丝生长抑制率。
菌丝生长抑制率/%=[(对照菌落直径-处理菌落直径)/(对照菌落直径-菌饼直径)]×100(1)
1.3 活性成分的分离及结构鉴定将20 L发酵液用多层纱布过滤后经大孔吸附树脂HPD-100(1.0 kg)吸附，甲醇(3.0 L)解析，将甲醇解析液减压浓缩，得80 g浸膏；浸膏用适量甲醇溶解后与100 g硅胶拌匀，晾干研磨成粉状。以硅胶500 g为吸附剂，石油醚湿法装柱(5.0 cm×100 cm)，干法上样。依次用V(石油醚)∶V(乙酸乙酯)=7∶1、5∶1、3∶1、1∶1，乙酸乙酯，V(乙酸乙酯)∶V(甲醇)=7∶1、5∶1、3∶1、1∶1及甲醇梯度洗脱，每100 mL收集1份，经TLC检测后合并相同组分，共得到6个组分，分别为组分I(207 mg)、Ⅱ(578 mg)、III(436 mg)、IV(359 mg)、V(271 mg)和VI(368 mg)。以蜡状芽孢杆菌和大肠埃希氏菌为指示菌，活性追踪试验结果表明，组分Ⅱ具有较强的抑菌活性。采用制备型HPLC对活性组分Ⅱ进行分离纯化，得化合物WH-01，共计406 mg。分别采用 1H NMR、13C NMR和ESI-MS等技术，结合相关文献对化合物WH-01进行结构解析。HPLC色谱条件如下：
Hypersil ODS2 C18色谱柱(20 mm×250 mm，10 μm)；流动相：V(甲醇)∶ V(水)=70∶30；流速 7.0 mL/min；检测波长254 nm。
1.4 活性化合物WH-01抑菌活性测定 1.4.1 对病原细菌的抑制作用采用微量稀释法[14]。从琼脂培养基中挑取4～5个相同形态的供试菌菌落，接入1.0 mL灭菌的Mueller-Hinton肉汤中，于35 ℃培养至轻度混浊后转入0.9%生理盐水中，调整到麦氏浊度为0.5，再用Mueller-Hinton肉汤稀释200倍，其接种量相当于7.5×105 CFU/mL。将稀释好的接种液转入96孔板中，每孔加接种液100 μL，再分别加入100 μL不同质量浓度的WH-01，使最终浓度分别为50、25、12.5、6.25、3.13、1.56和0.78 μg/mL，每板另设不加药剂的空白对照、氨苄青霉素(Ampicillin)阳性对照和加药不接菌阴性对照。每处理3次重复。于35 ℃培养20 h，记录药剂对供试细菌的最低抑菌浓度(MIC)。
1.4.2 对病原真菌的抑制作用测定方法同1.2.2节。准确称取4.0 mg化合物WH-01，先用200 μL二甲基亚砜(DMSO)溶解后，加入3.8 mL无菌水配制成质量浓度为1.0 mg/mL的WH-01母液，活性测定时用无菌水稀释至相应的质量浓度。
2 结果与分析 2.1 ZH-32菌株发酵液抑菌活性 2.1.1 对病原细菌的抑制作用内生真菌ZH-32菌株发酵液对枯草芽孢杆菌、蜡状芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌和大肠埃希氏菌均有强烈的抑菌活性，其抑菌圈直径分别为22、20、20和23 mm，对铜绿假单孢菌无明显抑菌活性。清水对照均未见抑菌圈。
2.1.2 对病原真菌菌丝生长的抑制作用由表1可以看出：ZH-32发酵液对番茄灰霉病菌菌丝生长的抑制作用最强，其抑制率为85.35%；对烟草赤星病菌和油菜菌核病菌菌丝生长抑制作用次之；对小麦赤霉病菌、苹果炭疽病菌、玉米弯孢病菌、茄子黄萎病菌和西瓜枯萎病菌菌丝生长无明显抑制作用。
 | 表1 ZH-32菌株发酵液对8种病原真菌菌丝生长的抑制作用Table 1 Inhibition of C.globosum ZH-32 fermentation broth against the mycelia growth of eight pathogenic fungi |
WH-01，淡黄色粉末，熔点：168.2～169.7 ℃(文献值：168～170 ℃[4])；UV(λMeOH)：218 nm；IR(KBr),νmax：3 440，3 255，2 966，1 689，1 620，1 433，1 240，1 050，983，971，759；ESI-MS：[M+H]+：m/z 529，[M-H]-：m/z 527。1H NMR和 13C NMR数据(数据已略去)与Sekita等[4, 15]报道的chaetoglobosin A(球毛壳菌素A)基本一致，其分子式为C32H36N2O5，相对分子质量为528。故将化合物WH-01鉴定为球毛壳菌素A，结构式见Scheme 1。
 | Scheme 1 |
结果(表2)表明，WH-01对枯草芽孢杆菌、蜡状芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌和大肠埃希氏菌具有强烈的抑制作用，其MIC值分别为3.13、3.13、1.56和3.13 μg/mL，而对铜绿假单孢菌无明显抑制作用。空白对照均表现为浑浊，阴性对照为澄清透明。
| 表2 化合物WH-01对5种病原细菌的MIC值Table 2 MIC values of WH-01 against five strains of bacteria |
由表3可以看出，WH-01对番茄灰霉病菌和油菜菌核病菌菌丝生长具有强烈的抑制作用，在50 μg/mL下其抑制率分别为94.85%和88.89%。进一步毒力测定结果表明，其对这两种病原真菌的EC50值分别为5.36和12.19 μg/mL(表4)。
| 表3 化合物WH-01在50 μg/mL下对8种病原真菌菌丝生长的抑制作用Table 3 Inhibition of WH-01 under 50 μg/mL against the mycelial growth of eight pathogenic fungi |
| 表4 化合物WH-01对番茄灰霉病菌和油菜菌核病菌的毒力Table 4 Toxicity of WH-01 against B. cinerea and S. sclerotiorum |
自Sekita于1973年从球毛壳菌C.globosum代谢产物中首次分离获得了球毛壳菌素A后，我国张玲琪于2002年从云南西双版纳州美登木内生真菌C.globosum 98M-6发酵物中分离鉴定出球毛壳菌素A[16]，此后倪志伟[17]和秦建春[18]分别从美登木和银杏内生球毛壳菌的发酵液中分离鉴定出球毛壳菌素A。Ishiuchi等[19]对球毛壳菌素A的生物合成途径进行了研究，确定了参与从原球壳菌素prochaetoglobosin I到chaetoglobosin A转化的3种酶和4个中间体，及其相关基因簇的功能，为研究其他球毛壳菌素的生物合成途径奠定了基础。
目前关于球毛壳菌素A的生物活性报道大多集中在抗癌活性上[10, 20]。有关其农用活性，Yang等发现其对南方根结线虫Meloidogyne incognita 的2龄幼虫具有驱避及毒杀活性[21]，但其抗菌活性尤其是对农业植物病原菌的抑菌活性鲜有报道。本课题组首次从侧柏内生真菌球毛壳菌C.globosum ZH-32的次生代谢物中分离鉴定出球毛壳菌素A，发现其对多种病原细菌及农业上危害严重的植物病原真菌具有强烈的抑制作用。本研究结果表明，球毛壳菌素A对供试的病原细菌枯草芽孢杆菌、蜡状芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌和大肠埃希氏菌均有强烈的抑制作用，对供试植物病原真菌菌丝生长均有不同程度的抑制作用，其中对番茄灰霉病菌和油菜菌核病菌菌丝生长抑制作用尤为突出。
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