豇豆中主要虫害有蓟马、斑潜蝇和豆荚螟等^[1]，在种植过程中需要频繁使用化学农药，而且豇豆属连续开花、结果和采收的蔬菜作物，导致其农药残留超标的风险很大。因此，低毒易降解农药受到青睐。溴氰虫酰胺、乙基多杀菌素、噻虫嗪、呋虫胺和啶虫脒均为低毒易降解农药。其中，呋虫胺和啶虫脒是传统农药，而溴氰虫酰胺、乙基多杀菌素和噻虫嗪，是近年来才在豇豆上使用。我国食品中农药残留标准规定：乙基多杀菌素在豇豆中的最大残留限量(MRL)为0.1 mg/kg；噻虫嗪和啶虫脒在黄瓜中的MRL分别为0.5和1 mg/kg，而在豇豆中未规定其MRL值；对溴氰虫酰胺和呋虫胺尚未规定其在食品中的MRL值^[2]。这5种农药虽属低毒易降解农药，但若使用不合理，仍有农药残留超标的风险。

利用超高效液相色谱-串联质谱(UPLC-MS/MS)检测豇豆中溴氰虫酰胺等5种农药残留的报道还很少，如对乙基多杀菌素、呋虫胺和噻虫嗪残留的研究，多采用液相色谱法或高效液相色谱法，存在前处理过程繁琐的问题^{[3, 4, 5]}。啶虫脒的检测方法虽相对多样，如气相色谱法、液相色谱法等，但同样存在前处理步骤繁琐的弊端^{[6, 7]}。国外对于呋虫胺和噻虫嗪的残留检测常采用液相色谱或高效液相色谱法^{[8, 9]}。对动物源性食品中啶虫脒的残留检测采用液相色谱-串联质谱法较为常见^{[10, 11]}。Park等^[12] 采用QuEChERS萃取和LC-MS/MS法检测了香菜中乙基多杀菌素的残留，其最低检出浓度为0.01 mg/kg，相关系数大于0.993。Zhang等^[13] 采用QuEChERS萃取和LC-MS/MS检测稻米中溴氰虫酰胺的残留，定量限为18 μg/kg。关于溴氰虫酰胺的检测方法尚未见报道。本研究采用QuEChERS/UPLC-MS/MS方法，同时测定了豇豆中5种农药的残留量，并且兼顾简化前处理和满足5种农药的限量标准的要求。

1 材料与方法 1.1 主要仪器、药剂与试剂

H-Class超高效液相色谱仪(美国Waters Acquity公司)；AB SCIEX API4000⁺三重四级杆质谱仪(美国AB SCIEX公司)，配电喷雾离子源(ESI)；EB-280-12电子天平(日本岛津公司)；SB-400 DTY超声波扫频清洗机(宁波新芝生物科技股份有限公司)；Anke TDL-40B离心机(上海安亭科学仪器厂)；QL-901旋涡混合器(江苏海门其林医用仪器厂)；Milli-Q超纯水仪(美国Millipore 公司)；0.22 μm 有机系滤膜(天津美瑞泰克公司)。

乙基多杀菌素(spinetoram，纯度95.0%，m(乙基多杀菌素-J)∶m(乙基多杀菌素-L)=4∶1)、呋虫胺(dinotefuran，纯度98.0%)和噻虫嗪(thiamethoxam，纯度98.5%)，德国Dr. Ehrenstorfer公司；啶虫脒(acetamiprid，纯度≥99%)，农业部环境质量监督检验测试中心(天津)；溴氰虫酰胺(cyantraniliprole，纯度98.4%)，杜邦公司。乙腈、甲醇(HPLC级)，美国Fisher公司；超纯水、N-丙基乙二胺吸附剂(Bondesil-PSA)和甲酸，美国Sigma-Aldrich公司；其余试剂均为国产分析纯。

豇豆样品采自海南省万宁市豇豆种植基地，采收前14 d停用本试验所用农药。称取10.0 g豇豆样品于80 mL离心管中，加入20 mL乙腈，于25 Hz下超声萃取30 min。加入10.0 g氯化钠，涡旋1 min，于4 000 r/min下离心10 min。取5 mL上清液于10 mL离心管中，先后加入0.050 g PSA和0.50 g 无水硫酸镁，涡旋1 min，于4 000 r/min下离心10 min。取上清液，过0.22 μm滤膜，待测。

取豇豆样品，按1.2节的方法处理，用上清液代替甲醇分别溶解各相应的标准品，配制成各农药质量浓度分别为0.01、0.05、0.1、0.2和1 μg/mL的混合标准溶液，涡旋混匀，过0.22 μm滤膜，待用。

色谱条件：Acquity UPLCBEH C₁₈色谱柱(50 mm×2.1 mm,1.7 μm )；柱温40 ℃；进样量4 μL；流速0.3 mL/min；运行时间7 min。梯度洗脱条件见表 1。在此条件下溴氰虫酰胺等5种农药的保留时间见表 2。

表 1(Table 1)

表 1 梯度洗脱条件Table 1 Gradient elution conditions 时间 Time/min 流速 Velocity/(mL/ min) 流动相Mobile phase 乙腈 Acetonitrile/% 0.2%乙酸铵-0.05%甲酸水 0.2%Ammonium acetate-0.05%Formic acid/% 0 0.3 10 90 2.50 0.3 60 40 3.00 0.3 65 35 4.00 0.3 90 10 4.50 0.3 90 10 5.00 0.3 65 35 6.00 0.3 60 40 7.00 0.3 10 90

表 1 梯度洗脱条件 Table 1 Gradient elution conditions

表 2(Table 2)

表 2 5种农药质谱采集参数Table 2 Mass spectrum acquisition parameters of 5 pesticides 农药 Pesticides 保留时间 Retention time/min 定量离子对 Quantitative ion pair,m/z 定性离子对 Qualitative ion pair,m/z 去簇电压 Declustering potential/V 碰撞能量 Collision energy/eV 乙基多杀菌素-J spinetoram-J 4.84 748.6/142.3 748.6/203.2 50.96 39.88/41.89 乙基多杀菌素-L spinetoram-L 5.12 760.6/142.3 760.6/203.1 149.01 38.89/41.86 溴氰虫酰胺 cyantraniliprole 2.59 473.1/284.0 473.1/441.8 64.25 18.93/22.54 呋虫胺 dinotefuran 0.94 203.1/129.0 203.1/113.0 71.07 16.17/15.79 噻虫嗪 thiamethoxam 1.37 292.0/211.0 292.0/132.1 69.41 17.01/24.78 啶虫脒 acetamiprid 1.72 223.4/126.1 223.4/56.2 98.20 28.00/30.74

表 2 5种农药质谱采集参数Table 2 Mass spectrum acquisition parameters of 5 pesticides

质谱条件：离子源为ESI(+)；正离子扫描模式；离子源温度600 ℃；气帘气压力137.9 kPa；离子源雾化气压力344.75 kPa；检测方式为多反应监测扫描模式(MRM)。各农药的采集数据见表 2。

在正离子模式测定条件下，分别将豇豆样品溶液和基质匹配混合标准溶液(质量浓度分别为0.01、0.05、0.1、0.2和1 μg/mL)注入液相色谱-串联四极杆质谱仪进行测定。外标法定量，以定性离子对为依据定性，以定量离子对的峰面积计算样品中待测物的含量。

乙基多杀菌素中含有乙基多杀菌素-J和乙基多杀菌素-L 两种成分，标准品中二者的质量比为4∶1，在计算乙基多杀菌素含量时将这两种成分相加计算。

取1.3节配制的混合标准溶液，按1.4节的条件测定。以标准溶液的质量浓度(x)为横坐标，以监测离子峰面积(y)为纵坐标绘制标准曲线。

向豇豆空白样品中添加0.01、0.1和1.0 mg/kg的3个水平的5种农药混合标准溶液，按照1.2节的前处理方法和1.4节的条件测定，每个水平重复 5次，计算添加回收率和相对标准偏差。

本试验以乙腈为提取溶剂。采用QuEChERS净化方法，简单易行。样品溶液采用PSA+无水硫酸镁净化，无水硫酸镁在吸水的同时会放热，可以进一步将农药洗脱下来。离心后得到的上清液即可用于检测。与传统的前处理方法比，QuEChERS方法省去了过柱、旋蒸和定容步骤，既简化了前处理方法，也降低了农药残留量损失的可能性，检测结果更接近真实值。

根据5种农药的化学结构^{[3, 14, 15, 16, 17]}，均采用在ESI(+)模式下形成的 [M + H]⁺作为母离子，取质量浓度为1.0 μg/mL的 5种农药的混合标准溶液进行相关参数的优化。先通过母离子扫描确定待用的母离子；再进行去簇电压(DP)的优化，使待测农药分子离子的丰度达到最佳；然后对母离子进行子离子的扫描，选择丰度较高的2个特征碎片离子，用于母离子定性和定量的优化；优化碰撞能量，使这2个特征碎片离子的响应最大，最后得到5种化合物相应的MRM离子对以及质谱参数。

当流动相中的水相使用超纯水时，质谱对乙基多杀菌素的灵敏度较低。向水相中加入0.05%的甲酸则可以极大地提高其对乙基多杀菌素的灵敏度(灵敏度为不加甲酸时的10倍)。通过试验最终确定流动相为乙腈和0.2%乙酸铵-0.05%甲酸溶液，可以同时满足5种农药的灵敏度和较好的峰形要求。

采用QuEChERS的样品前处理方法虽然能够很好地净化样品，但不能完全消除基质效应。基质效应主要是基质成分和目标化合物在电喷雾离子源进行离子化时相互竞争的结果，包括基质增强效应和基质抑制效应^[18]。本研究表明：不采用基质匹配混合标准溶液的方法得到的回收率仅为50%～60%，不能达到检测要求^[19]。采用基质匹配混合标准溶液后，添加回收率可达到70%～110%，可满足检测需要。5种农药的MRM色谱图见图 1和图 2。

图 1

Fig. 1

图 1 5种农药混合标准溶液的MRM色谱图(10 μg/L) Fig. 1 Chromatograms of 5 pesticides mixed standard solutions(10 μg/L)

图 2

Fig. 2

图 2 豇豆中分别添加5种农药回收试验的MRM色谱图(10 μg/L) Fig. 2 Chromatograms of 5 pesticides (10 μg/L)

结果(见表 3)表明：在0.01～1 μg/L范围内，5种药剂的线性关系良好，决定系数为0.997 6～0.999 9，定量限(S/N=10)为0.01μg/L。

表 3(Table 3)

表 3 5种农药的标准曲线方程和决定系数Table 3 Standard regression equations and coefficient determination 农药名称 Pesticides 线性范围 Linear range(0.01~1 μg/L) 标准曲线方程 Standard curve equations 决定系数 Coefficient of determination/R2 溴氰虫酰胺 cyantraniliprole y=3.45×108 x 0.999 6 乙基多杀菌素-J spinetoram-J y=3.10×107 x 0.995 4 乙基多杀菌素-L spinetoram-L y=4.74×107 x 0.996 0 呋虫胺 dinotefuran y=1.97×106 x 0.999 8 噻虫嗪 thiamethoxam y=6.89×106 x 0.999 2 啶虫脒 acetamiprid y=3.51×106 x 0.996 8

表 3 5种农药的标准曲线方程和决定系数 Table 3 Standard regression equations and coefficient determination

结果见表 4。5种农药的平均回收率均在71%~129%，相对标准偏差在0.90%～20.8%(n=5)，符合农药残留检测的要求。

表 4(Table 4)

表 4 5种农药的添加回收率和相对标准偏差(n=5) Table 4 Recoveries and RSDs for 5 pesticides(n=5) 农药 Pesticides 添加水平 Spiked level/(mg/kg) 平均回收率 Average recovery/% 相对标 准偏差 RSD/% 溴氰虫酰胺 cyantraniliprole 0.01 90 2.3 0.1 89 1.5 1 78 0.9 乙基多杀菌素 spinetoram 0.01 88 20.8 0.1 109 10.8 1 73 4.7 呋虫胺 dinotefuran 0.01 72 4.0 0.1 79 1.1 1 79 0.9 噻虫嗪 thiamethoxam 0.01 87 2.1 0.1 85 2.4 1 76 2.7 啶虫脒 acetamiprid 0.01 97 2.7 0.1 87 1.7 1 80 2.3

表 4 5种农药的添加回收率和相对标准偏差(n=5) Table 4 Recoveries and RSDs for 5 pesticides(n=5)

于2014年4月29日，采自海南省万宁市和儋州市豇豆种植基地的2个批次样品，采用本研究所建立的方法对样品中的溴氰虫酰胺等5种农药的残留量进行了检测。结果表明：万宁样品中的溴氰虫酰胺、乙基多杀菌素、呋虫胺、噻虫嗪和啶虫脒的残留量分别为0.165、0.008 94、0.079 4、0.044 0和0.089 8 mg/kg，儋州样品5种农药均未检出。调查发现：万宁市豇豆基地于4月25日施用了这5种农药，儋州市豇豆基地未施用溴氰虫酰胺、呋虫胺和噻虫嗪，乙基多杀菌素和啶虫脒曾于1个月前施用，与检测结果吻合。

本研究采用QuEChERS的样品前处理方法，操作步骤简单且杂质干扰较小，添加回收率均在允许范围内，且具有较好的重复性，保证了分析的可行性，能够准确定性和定量分析溴氰虫酰胺、乙基多杀菌素、呋虫胺、噻虫嗪和啶虫脒在豇豆中的残留量。