农药学学报  2014, Vol. 16 Issue (5): 541-547   PDF    
引用本文
张旦妮, 赵学, 张媚, 朱旭伟, 张璞瑜, 张爽, 林海萍. 球孢白僵菌诱导酶发酵液对其毒力的增效作用[J]. 农药学学报,2014,16(5): 541-547, doi: 10.3969/j.issn.1008-7303.2014.05.08   
ZHANG Danni, ZHAO Xue, ZHANG Mei, ZHU Xuwei, ZHANG Puyu, ZHANG Shuang, LIN Haiping. Synergistic effect of induced enzyme fermented solution on the insecticidal efficacy of Beauveria bassiana[J]. Chinese Journal of Animal Nutrition, 2014,16(5): 541-547, doi: 10.3969/j.issn.1008-7303.2014.05.08  
球孢白僵菌诱导酶发酵液对其毒力的增效作用
张旦妮, 赵学, 张媚, 朱旭伟, 张璞瑜, 张爽, 林海萍    
亚热带森林培育国家重点实验室培育基地, 生物农药高效制备技术国家地方联合工程实验室, 浙江农林大学, 浙江 临安 311300
投稿时间:2014-5-4    最后修改时间: 2014-5-19 .
基金项目：浙江省自然科学基金项目（LY12C14005）；浙江省大学生科技创新活动计划暨新苗人才计划（2014R412033，2014R412049）；国家级大学生创新创业训练计划项目（201310341003）
第一作者简介：张旦妮，女，本科生，E-mail：541965819@qq.com
通讯作者：林海萍，博士，教授，从事生物防治教学与研究，E-mail：zjlxylhp@163.com
摘要：为进一步确认含蛋白酶、几丁质酶、脂肪酶和淀粉酶的诱导酶发酵液对球孢白僵菌（Beauveria bassiana）菌株毒力的影响，将高毒力菌株B5、Bxs与低毒力菌株B11、BZ分别制成1×107个/mL 孢悬液（Ⅰ型）、孢悬液+诱导酶发酵液（V： V=1：1；Ⅱ型）、孢悬液+灭菌诱导酶发酵液（V： V=1：1；Ⅲ型），用浸渍法分别测定Ⅰ型、Ⅱ型与Ⅲ型3种液体对松墨天牛（Monochamus alternatus）幼虫的毒力。结果表明：分别含有蛋白酶、几丁质酶和脂肪酶的诱导酶发酵液Ⅱ型液体，其LT50值与Ⅲ型液体LT50间的差异均为极显著（P<0.01），而含淀粉酶的差异不显著。分别含有4种酶的诱导酶发酵液的Ⅲ型与Ⅰ型液体相比，LT50值之间也存在极显著差异（P<0.01）。可见：含蛋白酶、几丁质酶和脂肪酶的诱导酶发酵液对球孢白僵菌毒力具有极显著的增效作用；经过酶灭活的4种诱导酶发酵液增效作用也极显著。
关键词： 球孢白僵菌     蛋白酶     几丁质酶     脂肪酶     淀粉酶     松墨天牛     毒力     诱导酶发酵液     增效作用    
Synergistic effect of induced enzyme fermented solution on the insecticidal efficacy of Beauveria bassiana
ZHANG Danni, ZHAO Xue, ZHANG Mei, ZHU Xuwei, ZHANG Puyu, ZHANG Shuang, LIN Haiping    
Nurturing Station for the State Key Laboratory of Subtropical Silviculture, Local and National Joint Engineering Laboratory of Biopesticide High Efficient Preparation, Zhejiang A & F University, Lin'an 311300, Zhejiang Province, China
Abstract: In order to evaluate the toxicity effect of induced enzyme fermented solution of protease, chitinase, lipase and amylase from Beauveria bassiana, 3 types of solutions were prepared under laboratory conditions, i.e.,1×107/mLspore suspension (type Ⅰ), spore suspension + induced enzyme fermented solution (V:V=1: 1, type Ⅱ) and spore suspension + sterilized induced enzyme fermented solution (V:V=1:1, type Ⅲ), and microbial virulence against Monochamus alternatus larvae were tested by immersion method. The results showed that the LT50 values of induced protease, chitinase and lipase fermented solution(type Ⅱ)were significantly different from that of type Ⅲ solution (P<0.01). For induced amylase fermented solution, the LT50 values was not significantly different between the two types of solution. Moreover, there were significant difference between type Ⅲ and type Ⅰ fermented solution of 4 kinds of enzyme (P<0.01). The results indicated that induced protease, chitinase and lipase fermented solution had significant synergistic effect on the toxicity of B. bassiana, and the inactivated 4 kinds of fermented solution also showed significant synergistic effect.
Key words: Beaureria bassiana     protease     chitinase     lipase     amylase     Monochamus alternatus     toxicity     induced enzyme fermented solution     synergistic insecticidal efficacy    


随着化学农药大量使用对环境带来的严重污染和人类可持续发展战略的提出,虫生真菌在害虫的持续控制及维护生物多样性方面所发挥的作用越来越受到人们的关注,其中球孢白僵菌Beauveria bassiana 是一类广谱性昆虫病原真菌,可侵染15个目149个科700多种昆虫[1, 2, 3]，其在代谢过程中能合成、分泌一系列胞外水解酶,如蛋白酶、几丁质酶、脂肪酶和淀粉酶等，在穿透昆虫体壁过程中,可溶解昆虫表皮[4, 5, 6, 7]。林海萍课题组长期致力于球孢白僵菌对松墨天牛Monochamus alternatus的致病机理研究，发现球孢白僵菌蛋白酶、几丁质酶、脂肪酶活性与其对松墨天牛毒力间呈极显著正相关[8]。球孢白僵菌在蛋白胨马铃薯葡萄糖琼脂(PPDA)培养基上继代移殖对松墨天牛的毒力呈逐代下降趋势，相应地酶活性也逐代降低；来源于松墨天牛的球孢白僵菌菌株通过松墨天牛幼虫继代移殖后随着其毒力逐代提高，3 种酶活性也逐代上升，而来源于松毛虫的球孢白僵菌菌株逐代之间3 种酶活性与对松墨天牛幼虫的毒力差异均不显著[9, 10, 11]。

为进一步确认蛋白酶、几丁质酶、脂肪酶和淀粉酶对球孢白僵菌菌株毒力的影响，开展了球孢白僵菌诱导蛋白酶、几丁质酶、脂肪酶和淀粉酶发酵液对其毒力的增效作用研究，以期为生产中在球孢白僵菌制剂中加入酶产品作为增效剂提供理论依据。 1 材料与方法 1.1 供试昆虫与菌株来源 1.1.1 供试昆虫及饲养

从浙江余杭锦江木业有限公司的待处理松材线虫疫木中劈出松墨天牛幼虫，在人工饲料(锯木粉520 g，酵母粉25 g，苯甲酸钠4 g，蔗糖40 g，山梨酸2 g，琼脂30 g，蒸馏水800 mL，于121 ℃、30 min高压蒸汽灭菌)上饲养，待幼虫化蛹、羽化后，放在40 cm×40 cm×50 cm铁纱笼里饲养，成虫交配后，让其在松木段上产卵。待木段中的幼虫长到2龄后，移至经灭菌并装有人工饲料的试管中，每管1头，置于25 ℃恒温培养箱里培养，每隔10 d更换新鲜饲料。取4龄幼虫用于试验。 1.1.2 菌株来源及孢子悬浮液的制备

供试球孢白僵菌菌株分别为B5、B11、Bxs和Bz，其中B5、B11、Bxs 分别采自江苏、浙江的松材线虫病疫区，为松墨天牛危害严重区域松墨天牛自然感病球孢白僵菌，在室内用蛋白胨马铃薯葡萄糖琼脂(PPDA)培养基分离纯化获得；Bz源于浙江白僵菌厂生产菌株，是经多年生产筛选的防治松毛虫Dendrolimuss优良菌株。前期研究中对松墨天牛幼虫进行毒力测定，获得B5与Bxs的 LT50分别为5.63和5.46 d，为高毒力菌株；B11与Bz的 LT50分别为11.65和11.59 d，为低毒力菌株[8]。

将球孢白僵菌菌株接种到PPDA斜面培养基上，于27 ℃下培养12 d后，收集分生孢子用无菌水稀释，在磁力搅拌器上充分搅拌2 h后，用2层灭菌纱布过滤，然后用血球计数法配制成浓度为1×108个/mL 的孢子悬浮液。 1.2 供试培养基[9] 1.2.1 PPDA培养基

马铃薯200 g/L、葡萄糖20 g/L、蛋白胨10 g/L、琼脂20 g/L，pH自然。 1.2.2 诱导蛋白酶培养基

明胶10 g/L，K2HPO4、NaCl、MgSO4·7H2O各3 g/L。各组分别加入pH 7.0的0.02 mol/L磷酸缓冲液溶解。 1.2.3 诱导几丁质酶培养基

蛋白胨5 g/L，KH2PO4、KCl、MgSO4·7H2O各0.5 g/L，ZnSO4·7H2O 1%，脱矿几丁质10 g/L，pH 6.0。 1.2.4 诱导脂肪酶培养基

葡萄糖40 g/L、蛋白胨10 g/L、酵母浸膏10 g/L，pH自然。 1.2.5 诱导淀粉酶培养基

可溶性淀粉3 g/L，葡萄糖5 g/L，蛋白胨5 g/L，酵母粉5 g/L，pH自然。 1.3 球孢白僵菌对松墨天牛幼虫毒力测定

采用浸渍法接种[12]：将松墨天牛幼虫头朝上，胸部以下部分浸于浓度为1×108个/mL的孢子悬浮液中3 s进行接种，以浸无菌水为对照。每种菌株接种30头，重复3次。置于装有灭菌人工饲料的试管中于25 ℃培养，每管1头，每日定时观察记录松墨天牛幼虫症状与死亡情况，连续观察记录16 d。一旦发现死虫立即取出，无菌操作移入含1.5%琼脂的培养皿中，于 27 ℃恒温生化培养箱内培养，当虫体表面长出白色菌丝或分生孢子时用显微镜检查，确证是否为球孢白僵菌感染致死，并记录球孢白僵菌致死虫数。

采用DPS软件计算校正死亡率、毒力回归方程、相关系数r、致死中时(LT50)及其95%置信限。 1.4 诱导酶发酵液制备与酶活性测定 1.4.1 诱导蛋白酶发酵液制备与酶活性测定

采用Folin-酚法[13]：将1×108个/mL 的孢子悬浮液按体积分数为1%的量接入诱导蛋白酶培养基中，在旋转式摇床上于25 ℃、150 r/min下培养5 d，3层滤纸过滤，所得滤液即为诱导蛋白酶发酵液。以酪蛋白为底物，用Tris-HCl缓冲液(0.05 mol/L，pH 8.5)配成质量分数为2%的酪蛋白溶液，取1 mL该溶液加入1 mL诱导蛋白酶发酵液中，于40 ℃下反应10 min后，加入2 mL 0.4 mol/L的三氯醋酸溶液终止反应，保温至完全沉淀，反应液经过滤后用Folin试剂检测，以每分钟催化分解生成1μg酪蛋白的酶量为1个活性单位(U/mL)。重复3次。 1.4.2 诱导几丁质酶发酵液制备与酶活性测定

采用DNS (3，5-二硝基水杨酸)法[14]：将1×108个/mL 的孢子悬浮液按体积分数为1%的量接入诱导几丁质酶培养基中，在旋转式摇床上于27 ℃、200 r/min 下培养7 d，3层滤纸过滤，所得滤液即为诱导几丁质酶发酵液。以1.0 mL胶态几丁质为底物，加入0.5 mL诱导几丁质酶发酵液，于50 ℃水浴中振荡反应1 h，测定产生的还原糖。以每分钟产生相当于1 μg NAG(β-N-乙酰葡糖苷)所需的酶量定义为1个酶活力单位(U/mL)。重复3次。 1.4.3 诱导脂肪酶发酵液制备与酶活性测定

采用酸碱滴定法[15]：将1×108个/mL的孢子悬浮液按体积分数为1%的量接入诱导脂肪酶培养基中，在旋转式摇床上于25 ℃、150 r/min下培养5 d，3层滤纸过滤，所得滤液即为诱导脂肪酶发酵液。以4 mL橄榄油为底物，加入1 mL诱导脂肪酶发酵液，于40 ℃水浴中保温30 min，测定产生的脂肪酸。以每分钟水解产生10 μmol脂肪酸的酶量定义为1个脂肪酶单位(U/mL)。重复3次。 1.4.4 诱导淀粉酶发酵液制备与酶活性测定

采用碘显色法[16]：将1×108个/mL的孢子悬浮液按体积分数为1%的量接入诱导淀粉酶培养基中，在旋转式摇床上于25 ℃、150 r/min下培养3.5 d，3层滤纸过滤，所得滤液即为诱导淀粉酶发酵液。以1 mL 0.2%可溶性淀粉溶液为底物，将其置于10 mL试管中，加入0.5 mL磷酸缓冲液(0.02 mol/L，pH 6.0)，于40 ℃水浴中预热5 min后加入0.5 mL诱导淀粉酶发酵液，摇匀后保温15 min。测定催化分解的淀粉的量：反应结束时取0.5 mL反应液先在5 mL稀碘液中显色，再在紫外分光光度仪620 nm下测定吸光度，计算水解淀粉的量。以每分钟水解1 μg淀粉所需的酶量作为1个酶活力单位(U/mL)。重复3次。 1.5 诱导酶发酵液对球孢白僵菌孢子悬浮液毒力的影响

将1.4节中制备的4种诱导酶发酵液，分别经0.22 μm滤膜过滤，按体积比1∶1的比例分别加入1.1.2节制备的孢子悬浮液中，涡旋混合均匀，记为Ⅱ型。 其中，诱导蛋白酶、几丁质酶、脂肪酶和淀粉酶发酵液分别记为Ⅱ型(蛋)、Ⅱ型(几)、Ⅱ型(脂)和Ⅱ型(淀)；将各种诱导酶发酵液于121 ℃下灭菌处理20 min，以检测不到各种酶活性为标准，然后加入上述孢子悬浮液中，记为Ⅲ型；以不加任何发酵液的孢子悬浮液作为空白对照，记为Ⅰ型。按照1.3节的方法分别测定Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ 型液体对松墨天牛4龄幼虫的毒力。以无菌水作为对照(CK)。重复3次。

2 结果与分析 2.1 4种诱导酶发酵液的活性

由表 1可见：4个不同菌株的诱导酶发酵液均具有相应的蛋白酶、几丁质酶、脂肪酶与淀粉酶的活性，表明其制备方法是可行的。其中，4种酶活性在高毒力菌株B5与Bxs间差异不显著，但在低毒力菌株B11和Bz间，除几丁质酶外，其他3种酶活性差异显著或极显著(淀粉酶)。

表 1 4种诱导酶发酵液的活性 Table 1 Activities of 4 kinds induced enzyme fermented solution
2.2 球孢白僵菌对松墨天牛4龄幼虫的校正死亡率

B5、Bxs、B11与BZ菌株的孢子悬浮液(I型)、孢子悬浮液+诱导酶发酵液(II型)和孢子悬浮液+灭菌诱导酶发酵液(III型)3种类型液体对松墨天牛4龄幼虫的校正死亡率测定结果见表 2。

表 2 球孢白僵菌对松墨天牛4龄幼虫的校正死亡率 Table 2 Adjusted mortality of B. bassiana solutions to M. alternatus 4th instar larvae

由表 2可见：无菌水(对照)对松墨天牛4龄幼虫的毒力影响不明显，前4 d的死亡率为0，6～16 d的死亡率为2.2%，可见本研究中松墨天牛人工饲养方法是合理的。对于高毒力菌株B5与Bxs来说，Ⅰ型液体在第10天时的校正死亡率均已达到100%。对于低毒力菌株B11与Bz来说，在处理不同时间后其校正死亡率的顺序是：Ⅱ型＞ Ⅲ型＞ Ⅰ型，但又不尽相同。因此，在校正死亡率规律的基础上，采用半致死时间进一步分析其增效作用。 2.3 球孢白僵菌对松墨天牛4龄幼虫的半致死时间

由表 3可见：4种菌株中分别加入诱导蛋白酶、几丁质酶、脂肪酶和淀粉酶发酵液后的Ⅱ型与Ⅰ型相比，LT50值极显著缩短(P<0.01)，表明球孢白僵菌孢子悬浮液中加入4种诱导酶发酵液后均能极显著地提高其对松墨天牛的毒力。分别加入诱导蛋白酶、几丁质酶和脂肪酶的Ⅱ型发酵液后，与加入相应的Ⅲ型发酵液比，其LT50极显著地缩短(P<0.01)；而对于淀粉酶，其LT50差异不显著。说明这些对高温敏感的蛋白酶、几丁质酶和脂肪酶对相应菌株的毒力具有极显著的增效作用，而淀粉酶则对相应菌株毒力增效作用不明显。此外，与Ⅰ型相比，Ⅲ型的LT50值亦明显缩短，差异均达极显著水平(P<0.01)。

表 3 球孢白僵菌对松墨天牛4龄幼虫的半致死时间 Table 3 LT50 of B. bassiana solutions to M. alternatus 4th instar larvae
3 讨论

本研究表明，球孢白僵菌孢子悬浮液中加入蛋白酶、几丁质酶、脂肪酶和淀粉酶4种诱导酶发酵液均能极显著提高其对松墨天牛的毒力，但该增效作用不排除发酵液中除酶之外还存在其他增效物质。因此，本研究还分析了加入相应高温灭菌诱导酶发酵液的孢子悬浮液(Ⅲ型)的LT50值，结果显示差异性仍为极显著。由于灭菌诱导酶发酵液已经灭活，因此Ⅱ型与Ⅲ型液体的惟一差异在于酶活性，可见蛋白酶、几丁质酶和脂肪酶对球孢白僵菌毒力均有极显著的增效作用，而淀粉酶对相应菌株毒力的增效作用不显著，这一结果与本课题组前期研究结果一致[8]。

与Ⅰ型相比，Ⅲ型的LT50值差异也为极显著。这可能是因为虽然高温处理使发酵液中的酶失活了，但培养液中所含的营养物质仍有利于球孢白僵菌孢子的萌发、菌丝的生长，及芽管和附着胞等结构的形成等，从而加速了其对天牛体表的侵入。

本研究结果与项目组前期研究结果[9]比较发现，在孢子悬浮液中加入诱导酶发酵液提高杀虫的效果与其在寄主虫体上复壮的效果相近，如B11菌株Ⅱ型(几)的LT50为5.56 d，Ⅱ型(脂)的LT50为6.02 d，比该菌株的LT50(H4：连续接种松墨天牛幼虫4代获得的继代移殖菌株)6.45 d 均小。说明对于来源于松墨天牛的球孢白僵菌弱毒力菌株来说，一是可以通过在松墨天牛虫体上的继代培养来复壮，二是可以通过加入诱导酶发酵液来提高杀虫效果。而对于来源于非松墨天牛的球孢白僵菌弱毒力菌株来说，虽然在松墨天牛虫体上的继代培养不能明显提高菌株毒力，但可通过加入诱导酶发酵液提高其杀虫效果。该结果为加工与使用球孢白僵菌杀虫剂时如何增效提供了思路，为开发混合型杀虫制剂奠定了基础。在此基础上，后续应进行田间试验以验证其防治效果的一致性，同时进行环境安全性检测，并进一步探索生产最佳杀虫效果的生产应用剂型与方式。

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