炭疽属真菌(Colletotrichum spp.)主要分布于热带及亚热带地区，寄主范围十分广泛，可侵染多种草本和木本植物^{[1, 2, 3, 4]}，是全球十大重要病害之一^[5]。其可危害草莓果实、叶片、叶柄、匍匐茎和根颈^{[6, 7, 8, 9]}，严重时可导致80%的草莓苗在移栽前带菌^[10]或因根颈处感病死亡^[6]。炭疽病已成为全球草莓产业发展的主要问题之一^[11]，也是我国夏季草莓育苗期的主要病害。该病在我国草莓种植区发生普遍，且近年来有危害愈发严重的趋势^{[12, 13]}，2012年湖北省草莓炭疽病的平均发病率为41.7%，严重的田块发病率高达69%^[14]。一般认为，可引起草莓炭疽病的病原有3种，分别为胶孢炭疽菌C.gloeosporioides、尖孢炭疽菌C.acutatum和草莓炭疽菌C.fragariae^{[15, 16, 17]}。最新的病原菌分类研究发现，胶孢炭疽菌与草莓炭疽菌同属于胶孢炭疽复合种(C.gloeosporioides species complex)，该复合种内能侵染草莓的为C.theobromicola、C.siamense和C.fructicola^{[3, 9]}；尖孢炭疽菌也是复合种，其中能侵染草莓的为C.nymphaeae、C.simmondsii、C.fioriniae、C.godetiae和C.salici^[18]。

目前植物炭疽病的防治主要依靠化学农药。咪鲜胺属于咪唑类杀菌剂，可与14α-脱甲基酶P450(在真菌中称为CYP51)的血红素-铁活性中心以配位键结合，抑制真菌麦角甾醇的生物合成^[19]。咪鲜胺对子囊菌及半知菌引起的多种作物病害有特效，已广泛应用于芒果炭疽病、葡萄炭疽病、稻曲病、稻瘟病、花生褐斑病及油菜菌核病等多种真菌病害的防治^{[20, 21, 22, 23]}，近年来也开始被用于防治草莓苗期炭疽病。由于咪鲜胺在我国已有近20年的用药史，随着药剂使用时间的延长或剂量的提高，炭疽菌对咪鲜胺的敏感性可能下降，甚至出现抗药性菌株^{[24, 25]}。但目前尚未建立草莓炭疽病菌对咪鲜胺的敏感基线，田间菌株是否已产生抗药性、抗性水平如何等情况也均未见报道。笔者从湖北省主要草莓育苗基地采集了103株草莓炭疽病菌，测定了其对咪鲜胺的敏感性，以期为草莓炭疽病菌对咪鲜胺敏感基线的建立及咪鲜胺在草莓炭疽病防治中的科学合理使用提供参考。 1 材料与方法 1.1 供试菌株

分别于2012和2013年从湖北省各主要草莓育苗基地采集草莓炭疽病害样本，在室内进行病原菌的分离纯化，共得到103个炭疽属菌株，采用斜面(4 ℃)保存于湖北省农业科学院经济作物研究所生物技术研究室。所得菌株均通过形态学和基于部分肌动蛋白基因(ACT)、β-维管蛋白基因(TUB2)、钙调蛋白基因(CAL)、甘油醛-3-磷酸脱氢酶基因(GAPDH)及几丁质合成酶基因(CHS-1)序列的多位点系统进化分析^[3]进行鉴定。 1.2 药剂与培养基

咪鲜胺(prochloraz)原药(有效成分质量分数为97%)购自江苏辉丰农化股份有限公司，用丙酮稀释，分别配制成1 000和100 μg/L的母液，再用无菌水梯度稀释成10、1和0.1 μg/mL的系列浓度溶液，存于4 ℃冰箱，备用。向融化后的马铃薯葡萄糖琼脂(PDA)培养基中添加不同体积的咪鲜胺母液，分别制成药剂质量浓度为0.001 6、0.008 1、0.016 2、0.080 8、0.162 0和0.808 0 μg/mL的含药PDA培养基。 1.3 草莓炭疽病菌对咪鲜胺的敏感性测定

采用菌丝生长速率法^[24]。将草莓炭疽病菌菌株接种至PDA平板中央，于28 ℃避光培养4 d后，沿菌落边缘截取直径5 mm的菌丝块，接种于含药PDA平板中央，以加入等体积丙酮或无菌水的处理为空白对照，每处理设3次重复。将接种后的平板置于28 ℃、黑暗条件下培养4 d，待对照平板中菌落快长满时，采用十字交叉法测量菌落直径。 1.4 数据统计分析

比较处理组与对照组的菌落直径，计算菌丝生长抑制率，并将其转换为几率值。采用Excel程序，以几率值为纵坐标、药剂浓度对数为横坐标绘制毒力回归曲线，计算有效抑制中浓度(EC₅₀)。在该EC₅₀值范围内，从0.014 2 μg/mL 开始，以0.022 4 μg/mL为截距，将EC₅₀值等分为9个阶段，以每阶段EC₅₀的中值为横坐标，统计每个阶段的菌株数和发生频率，绘制草莓炭疽病菌株敏感性频率分布图。

按分离采集地点和种类，分别对各菌株进行划分，并计算各处理的平均EC₅₀值及标准差(SD)。应用IBM SPSS软件，通过ANOVA方法对不同地理来源菌株对咪鲜胺的敏感性进行方差分析，同时采用IBM SPSS软件对来源于不同地区或不同种类的草莓炭疽病菌株进行聚类，分析草莓炭疽病菌对咪鲜胺的敏感性与菌株来源地理位置或病原菌种类的相关性。 2 结果与分析 2.1 草莓炭疽病菌对咪鲜胺的敏感性

测定了供试103株草莓炭疽病菌株对咪鲜胺的敏感性，结果(表 1)显示：咪鲜胺对湖北省草莓炭疽病菌的EC₅₀平均值为(0.093 8±0.029 9)μg/mL，其中EC₅₀最小值为0.014 2 μg/mL，最大值为0.215 6 μg/mL，相差14倍。供试菌株对咪鲜胺的敏感性分布呈单峰曲线，Shapiro-Wilk检验结果显示：W值为0.98，P值为0.101 1(＞0.05)，说明供试103个菌株对咪鲜胺的敏感性频率符合正态分布(图 1)。参照野生菌株敏感性呈正态分布的原理^[26]，该平均EC₅₀值(0.093 8±0.029 9) μg/mL可作为湖北省草莓炭疽病菌对咪鲜胺的敏感基线的参考值，用于田间草莓炭疽病菌对咪鲜胺的抗药性监测。

图 1

Fig. 1

图 1 草莓炭疽病菌株对咪鲜胺的敏感性(A)及其频率分布(B)Fig. 1 Sensitivity(A) and distribution of EC50 values (B) of 103 isolates of Colletotrichum spp. from strawberry

表 1(Table 1)

表 1 湖北省不同地区草莓炭疽病菌株对咪鲜胺的敏感性 Table 1 Sensitivity of Colletotrichum spp. in strawberry from different locations of Hubei Province to prochloraz 采样地点 Locations 菌株数 Number of isolates EC50/(μg/mL) 范围 Range 平均值 Mean value 标准差 SD 嘉鱼，鱼跃(Yuyue,Jiayu) 14 0.052 5～0.145 2 0.095 0 ab 0.024 2 麻城，潘塘(Pantang,Macheng) 26 0.042 8～0.148 9 0.095 2 ab 0.016 0 沙市，锣场(Luochang,Shashi) 14 0.016 6～0.135 1 0.081 1 b 0.028 1 沙市，高阳(Gaoyang,Shashi) 6 0.050 1～0.109 2 0.081 5 ab 0.016 4 沙市，三板桥(Sanbanqiao,Shashi) 6 0.014 2～0.215 6 0.082 5 ab 0.061 2 武汉，洪山(Hongshan,Wuhan) 10 0.038 5～0.199 5 0.111 8 a 0.039 9 武汉，郑店(Zhendian,Wuhan) 6 0.087 9～0.163 5 0.122 6 a 0.025 6 注: 表中相同字母表示采用Duncan 氏新复极差法检验数值间差异不显著(P>0.05)。 Note: Data followed by the same letters are not significantly different by Duncans new multiple range test(P>0.05) ．

表 1 湖北省不同地区草莓炭疽病菌株对咪鲜胺的敏感性 Table 1 Sensitivity of Colletotrichum spp. in strawberry from different locations of Hubei Province to prochloraz

咪鲜胺对来源于湖北省10个地区(菌株数为 5个及以上的地区，低于5个者未统计)的草莓炭疽病菌群体的EC₅₀平均值在(0.081 1～0.122 6) μg/mL之间。方差分析结果表明：来源于荆州市沙市区锣场镇的草莓炭疽病菌株对咪鲜胺的敏感性显著低于来源于武汉市洪山区和武汉市郑店镇的菌株 (表 1)，不同地区之间的平均EC₅₀值相差约0.5倍。聚类分析结果显示，不同地理来源的菌株出现在同一聚类组中(图 2)。 2.3 不同病原菌种类对咪鲜胺的敏感性比较

从湖北省不同地区分离到的103株草莓炭疽病菌株共包含C.siamense、C.gloeosporioides、C.aenigma、C.fructicola和 C.nymphaeae 5个种。聚类分析结果显示：不同种类的菌株出现在同一聚类组中(图 2)。咪鲜胺对C.siamense、C.gloeospo-rioides、C.aenigma、C.fructicola和 C.nymphaeae的平均EC₅₀值分别为：0.098 5、0.048 3、0.102 9、0.039 6和0.094 9 μg/mL(表 2)。虽然咪鲜胺对C.fructicola的平均EC₅₀值最低，对C.siamense的平均EC₅₀值最高，但是由于除C.siamense外，其他种类的菌株均较少，因此无法统计不同病原菌种类对咪鲜胺的敏感性差异。

图 2

Fig. 2

图 2 咪鲜胺对草莓炭疽病菌的EC50值系统聚类分析Fig. 2 System clustering analysis on EC50 values of prochloraz to Colletotrichum spp.

表 2(Table 2)

表 2 从草莓上分离的5种炭疽病菌株对咪鲜胺的敏感性 Table 2 Senstitivity of five species of anthracnose pathogens in strawberry to prochloraz 病原菌种类 Pathogen species 菌株数 Number of isolates EC50/(μg/mL) 范围 Range 平均值Mean value 标准差 SD C.siamense 90 0.014 2～0.215 6 0.098 5 0.026 6 C.gloeosporioides 5 0.022 4～0.096 5 0.048 3 0.023 3 C.aenigma 2 0.038 5～0.167 3 0.102 9 0.064 4 C.fructicola 4 0.016 6～0.074 6 0.039 6 0.019 9 C.nymphaeae 2 0.043 6～0.146 3 0.094 9 0.051 4

表 2 从草莓上分离的5种炭疽病菌株对咪鲜胺的敏感性 Table 2 Senstitivity of five species of anthracnose pathogens in strawberry to prochloraz

3 小结与讨论

从1993年法国安万特作物科学公司在我国临时登记施保克25%乳油^[27]至今，咪鲜胺在我国已有近20年的用药历史。目前在水稻上已检测到高抗咪鲜胺的水稻恶苗病菌Fusarium moniliforme菌株^{[24, 25]}。建立敏感基线是抗药性监测及抗性治理策略制定中的重要内容。由于草莓主要靠匍匐茎进行无性繁殖，在生产过程中，草莓种苗在各地区之间调运频繁，病原菌可通过种苗调运进行远距离传播，因此无法准确分析某个地方的具体用药情况。从整体上看，咪鲜胺尚未获准登记在草莓上使用，较少用于防治草莓炭疽病，目前尚处于使用初期，但考虑到其他DMIs杀菌剂可能与咪鲜胺存在交互抗性，假如这些药剂在草莓炭疽病防治中已有应用，也可能会导致田间草莓炭疽病菌群体对咪鲜胺的敏感性降低。

本研究中从湖北省17个地区分离获得的103株草莓炭疽病菌株对咪鲜胺的敏感性分布呈单峰曲线，且符合正态分布，说明田间尚未出现敏感性明显下降的抗性菌体，但由于其用药背景不是特别清晰，尚不具备建立敏感基线的条件，因此可将其平均EC₅₀值(0.093 8±0.029 9)μg/mL作为湖北省草莓炭疽病菌对咪鲜胺敏感基线的参考值，用于监测田间草莓炭疽病菌对咪鲜胺的抗药性。聚类分析结果显示，不同地理来源或种类的菌株出现在同一聚类组中，说明草莓炭疽病菌对咪鲜胺的敏感性与菌株的地理来源及种类之间无显著相关性。

覃丽萍等测定了海南地区芒果炭疽病菌对咪鲜胺的敏感性，结果显示，咪鲜胺对芒果炭疽病菌的平均EC₅₀值为0.091 6 μg/mL^[28]，与本研究中咪鲜胺对草莓炭疽病菌的平均EC₅₀值相近。可引起芒果炭疽病的病原菌有：C.gloeosporioides、C.asianum、C.fructicola、C.tropicale、C.karstii和C.dianesei^{[3, 29]}，本研究中分离到的草莓炭疽病菌株主要有：C.siamense、C.gloeosporioides、C.aenigma、C.fructicola和 C.nymphaeae 5种。可以看出，虽然草莓和芒果上炭疽病的病原菌种类存在差异，但在未使用咪鲜胺前或其使用初期，咪鲜胺对草莓和芒果炭疽病菌的平均EC₅₀值较为相近。

虽然咪鲜胺已在多种作物上登记使用了多年，但目前尚未在草莓上进行登记，因此并未在草莓炭疽病防治中大面积推广应用，同时咪鲜胺具有较低的抗性风险^[22]，这些可能是咪鲜胺在我国使用近20年后，草莓炭疽病菌对其的敏感性依然较高的原因。