农药在有效防治病、虫、草害的同时，对环境也造成了不同程度的污染^[1]，尤其是对水体的污染，可能导致鱼类等水产品中毒，进而危害人类健康^[2]。因此研究农药与鱼类受体的作用靶标及结合情况对绿色农药的研发具有重要意义。

γ-氨基丁酸(γ-aminobutyric acid，GABA)是一种天然非蛋白质类氨基酸，由谷氨酸脱羧酶控制合成，作为一种主要的抑制性神经递质，存在于非脊椎动物的周缘系统和脊椎动物的中枢神经系统中^{[3, 4]}。自2009年GABA被中国批准为新资源食品后，其在功能饮料、苏打水及保健品中已得到广泛应用^{[5, 6]}。GABA受体(GABAR)主要存在于神经细胞的突触后膜上，其与GABA结合后可调控偶联的氯离子通道，使氯离子流入细胞内部，从而抑制生物体的神经活动^[7]。GABAR可分为A、B、C 3个药理学亚型，其抑制作用主要通过A型GABAR介导，以下简称为GABA_AR^[8]。已有研究表明，巴比妥类和苯二氮卓类(BZ) 等药物正是作用于GABA_AR而发挥其镇静、催眠及抗惊厥等药理作用的，并且GABA_AR是氟虫腈、狄氏剂、硫丹、阿维菌素等多种杀虫剂的作用靶点之一^{[9, 10]}。已知GABA_AR与常见药物如氨基丁酸、蝇蕈醇、荷包牡丹碱和苯二氮类、地西泮、弗马西尼的识别位点是在胞外区，而其他一些药物如巴比妥类药物、神经甾体和酒精的识别位点可能主要是在TM区^[11]，一些非BZ的抑制剂结合位点仍然未知。因此，开展GABA_AR的结构及其与配体间相互作用的研究十分重要。不仅有助于了解其结构和功能，也可为GABA_AR与药物的作用机制研究打下基础。

1982年松村等^[12]通过电生理学和分子生物学方法，证明了GABA_AR上有林丹的作用位点，自此引发了农药学领域对GABA_AR抑制剂的研究。试验发现，由缬草中提取的缬草烯酸对小鼠有良好的抗焦虑作用,但对于β₃点突变的小鼠无抗焦虑作用^[13]，这说明GABA_AR β₃亚基受体是缬草烯酸发挥抗焦虑作用的靶点。GABA_AR β亚单位也是许多全麻药物影响其发挥麻醉功能的重要作用区域，巴比妥类和依托咪酯可直接激活同源组合的β亚单位受体^[14]。昆虫体内的RDL亚基是环戊二烯类杀虫剂的作用靶点，而RDL亚基与脊椎动物的β₃亚基高度相似^[15]，因此β₃亚基在近年来得到了广泛的重视和研究^{[16, 17]}。

鲫鱼是我国淡水养殖的重要经济鱼。为了阐明农药滥用对常见稻田鱼的影响，本研究以鲫鱼为对象，克隆了GABA_ARβ₃亚基基因，并对其进行了生物信息学和荧光定量PCR分析。通过多序列同源比对得到了该基因的高度保守区，采用RACE PCR技术克隆了鲫鱼GABA_AR β₃亚基基因序列并测序,进而分析了基因结构信息，旨在为进一步研究GABA_AR β₃亚基的功能提供参考。 1 材料和方法 1.1 供试材料与试剂

纯种黑鲫鱼Carassius auratus(由河北省保定市振民特种水产养殖有限公司提供)，性情活泼，年龄1～2 a，1 000 g左右，雌性，原产地天津，按常规方法饲养备用。从活体中取不同组织器官在液氮中冷冻后置于-80 ℃保存备用。

大肠杆菌DH5α由河北大学生命科学学院保存；TRIzol试剂为Invitrogen公司产品；Tris、X-gal、IPTG 等购自Sigma公司；RACE试剂盒、pMD-19T载体、DNA Marker DL2000、各种限制性内切酶、T₄ DNA 连接酶、DNA凝胶回收试剂盒以及氨苄青霉素等抗生素均为Takara公司产品。Gold View 及PCR试剂：Taq DNA聚合酶(5 U/μL)、10x PCR Buffer(Mg²⁺ Free)、dNTP(0.01mol/L each)、MgCl₂、6x Loading Buffer 购自上海生工生物技术有限公司；其他试剂除特别注明以外，均为国产分析纯试剂。PCR 引物由上海生物工程公司合成，测序由华大基因公司完成。 1.2 鲫鱼GABA\-AR β₃基因的简并引物设计

从NCBI(National Center for Biotechnology Information)下载GABA_AR β₃的基因组序列,以斑马鱼的GABA_AR β₃基因的DNA序列作为输入序列,利用BLAST 软件对数据库进行比对搜索。对得到的序列作比对验证后,选取相似性较高的同原序列，包括人、小鼠、原鸡、斑马鱼、罗非鱼、非洲爪蟾和牛等的β₃亚基序列做同源比对，寻找高度保守区，在保守区内设计简并引物^[18]，扩增鲫鱼β₃亚基的保守区。 1.3 鲫鱼总RNA 提取、引物设计和cDNA 模板合成

使用Invitrogen TRIzol试剂盒提取鲫鱼各组织器官的总RNA,以鲫鱼总RNA为模板,在M-MLV逆转录酶的作用下，利用Oligo(dT)18合成cDNA的第1条链，并以此为模板进行PCR扩增,所有步骤均按照试剂的使用说明书进行。根据同源比对得到的GABA_AR β₃基因核酸序列的高度保守区，用Primer Premier 5.0 软件设计引物。引物序列为: 正向引物F: 5-ACATGGTBTCHGARGTYAACAT-3； 反向引物R: 5-ACCAYCKRTCDATGGCRTTCAC-3,Tm值为58 ℃。 1.4 鲫鱼β₃亚基基因的克隆和序列测定

简并PCR引物用于扩增鲫鱼GABA_AR β₃亚基的保守区域，PCR所用模板为按1/20比例稀释的cDNA。使用以下PCR程序:1) 94 ℃，5 min； 2) 94 ℃，30 s； 3) 60 ℃，2 min； 4) 72 ℃，1 min； 5)重复步骤2～4，30个循环； 6)72 ℃，10 min； 7)保持 4 ℃。用琼脂糖凝胶电泳分析PCR结果，用凝胶回收试剂盒回收目的条带，将纯化回收的DNA连接至pET载体上，使用T7测序引物检查插入片段的大小是否正确，转入大肠杆菌中BL21中，所有操作步骤均按照试剂盒说明进行。挑取单克隆基因进行测序，拼接测序结果并用BLAST验证其准确性。 1.5 快速扩增cDNA 末端反应

末端反应^[19](rapid amplification of cDNA ends,RACE)是通过PCR进行cDNA末端快速克隆的技术。是基于PCR技术由已知的一段cDNA片段通过往两端延伸扩增而获得完整的3′端和5′端的方法。根据得到的鲫鱼保守区的结果设计巢式引物,3′RACE GSP Outer Primer: TCACCACCAGCGTTAGCGAGACCCGA,GSP Inner Primer: CCACAGCATGGGCAGGACCACGCAG；Tm值为60 ℃。5′RACE GSP Outer Primer: TGGTTGTGATTCTTAGTCCATAAA,GSP Inner Primer: CAGGCGGATCATGCGGTTCTTCAC,Tm值为56 ℃。结合RACE试剂盒的接头引物，反应按照Invitrogen 公司试剂盒说明书进行。扩增产物经琼脂糖凝胶电泳回收目的片段,做TA 克隆并测序。 1.6 鲫鱼GABA_AR β₃ cDNA全长验证及ORF扩增

以DNAman拼接鲫鱼β₃亚基的保守区、3′端和5′端序列，截掉接头引物以及重叠部分，得到2 765 bp的全长序列，设计引物验证全长序列的准确性。全长扩增引物F: TCAGTTTTCAATTTCCACGT,R: ATGTACTGAAGCACTTTACA，Tm值为54 ℃；ORF扩增引物F：CGGAATTCATGTTTGGCATACAGAAACGAAGGC,R：GCTCTAGACTAATTCACATAATACAGCCAGTAG，Tm值为为58 ℃。 1.7 基因功能预测、分析及研究

用MEGA 4.0构建系统进化树，查看各物种之间的亲缘关系；通过GO注释阐明β₃亚基的信号通路；用TMHMM 2.0预测β₃亚基的跨膜区，寻找存在于第2跨膜区的高度保守区，在昆虫体内应是氟虫腈等药物的作用靶标^[20]；用DNATool 6.0等软件预测编码蛋白质氨基酸序列的二级结构、分子质量、等电点及修饰位点等信息。 1.8 荧光定量PCR

试验中各部位组织样品均取自同一条鲫鱼，于-80 ℃下保存。以管家基因β-actin 为内参基因，根据荧光定量PCR引物设计原理，用Primer Premier设计鲫鱼β₃、β₂、γ₃亚基及内参基因的引物。使用3 mL TRIzol按试剂盒说明书自150 mg鲫鱼脑、眼、心等组织中提取高纯度、高浓度的总RNA，采用紫外-可见分光光度计定性、定量检测RNA，并结合琼脂糖凝胶电泳检测RNA纯度。在M-MLV酶作用下结合Oligo(dT)18反转录RNA成单链cDNA，并用去RNA酶处理的去离子水稀释10倍作模板。在ABI荧光定量PCR仪上进行反应，预热荧光定量PCR仪，使用SYBR染料，两步法上机进行荧光定量PCR扩增^[21]。每个样品设3个平行，重复3次，记录平均C_t值(C\-t 值：是指每个反应管内的荧光信号到达设定域值时所经历的循环数)。观察扩增曲线和溶解曲线，结合琼脂糖凝胶电泳检测PCR结果，以确保试验结果可信。计算相对表达量，用SPSS 17.0处理数据。 2 结果与分析 2.1 简并引物设计

对NCBI数据库里已公布的各物种的GABA_AR β₃亚基基因序列进行归纳，用斑马鱼的β₃序列作为输入序列，自BLAST同源序列中选取相似度高的7种物种的β₃序列，用ClustalX 软件进行多序列CDS比对，选取高度保守区。由图 1中可以看出，该基因的同源性较高，总一致性达84.18%。在高度保守区设计简并引物，扩增鲫鱼GABA_AR β₃亚基保守区的基因序列。

图 1

Fig. 1

图 1 7物种GABAAR β3亚基的序列局部比对图Fig. 1 The partial of sequence alignment map about GABAAR β3 subunit of seven kinds of species

以成年鲫鱼脑部总RNA反转录得到的cDNA为模板,用简并引物进行PCR 扩增,得到1条约1 179 bp 的扩增带(图 2a)，与预期片段大小一致。用琼脂糖凝胶电泳回收目的条带，凝胶回收后连接到pMD 18-TVector 上并进行序列测定。将测序结果进行BLAST比对及同源性分析,结果发现，其与斑马鱼β₃ CDS的相似性为92%，初步断定所获得的片段是鲫鱼GABA_AR β₃亚基基因的一部分。根据该片段设计巢式PCR特异性引物,进行5′端和3′端RACE 反应,回收RACE PCR扩增产物并克隆测序,用DNAman拼接序列，得到全长基因2 767 bp(GenBank ID: KC964110)，设计引物验证全长序列(图 2b)，分别在175位和2405位设计上下游引物进行PCR扩增，结果见图 2b中 1号条带，理论长度为2 230 bp；分别在53位和2 703位设计上下游引物进行PCR扩增，结果见图 2b中 2号条带，理论长度为2 650 bp，理论长度与实际大小相符合。回收目的条带并进行TA克隆测序，通过BLAST比对进一步验证无误，并且在序列的5′ 端发现TATA框和启动子，在3′ 端有加尾信号PLOY(A)尾以及终止子(图 5)。说明通过RACE法获得的鲫鱼GABA_AR β₃亚基为正确的全长序列,鲫鱼β₃亚基全长扩增成功。将该基因序列提交到NCBI并释放序列，利用BLASTx和DNAstar 软件结合NCBI ORF Finder进行分析，发现532 bp 位点为正确翻译阅读框的起始密码子，鲫鱼GABA_AR β₃亚基基因编码序列位于532～2 040 bp处,共1 509 bp,翻译成含502个氨基酸残基的蛋白质(图 3)。

图 2

Fig. 2

图 2 鲫鱼GABAAR β3亚基保守区扩增琼脂糖凝胶电泳图(2a)和全长基因的验证电泳图(2b)Fig. 2 The agarose gel electrophoresis of conservative of GABAAR β3 subunitof C.auratus(2a) andagarose gel electrophoresis map of the full-length gene(2b)

图 3

Fig. 3

图 3 鲫鱼GABAAR β3亚基ORF预测图Fig. 3 The prediction of ORF of GABAAR β3 subunit of C.auratus

脊椎动物间的GABA_ARβ₃亚基的结构存在高度保守性，具备相似的结构框架：即均有4个横跨细胞膜的疏水区(M1～M4)，一般由400～500个氨基酸残基组成^[22]。用TMHMM 2.0等软件对鲫鱼β₃亚基基因进行功能预测，结果(图 4和图 5)表明，其存在4个跨膜区，其编码的蛋白质可能由502个氨基酸组成，分子质量为57.072 6 ku，等电点为9.26。第1跨膜区的氨基酸数从245位到267位，第2跨膜区从274位到293位，第3跨膜区从308位到330位，第4跨膜区从483位到500位。根据第3跨膜区与第4跨膜区之间存在一个较长的loop，跨膜区和N端细胞外域为最保守的区域，预测N端细胞外域含有激动剂GABA等及BDZ类的结合位点，而一些药物如巴比妥类药物、神经甾体和酒精的作用靶点也可能主要是在TM区^{[23, 24]}。通过多重序列比对得知，各物种β₃亚基的第2跨膜区高度保守，在第2跨膜区下游，存在一个高度保守区TTVLTMTT，它是在蚊、蜜蜂等昆虫，乌贼、钉螺等软体动物及牛、大鼠、智人等哺乳动物中均存在的高度保守区^[25](图 6)。对第2跨膜区的研究是有关药物作用靶标研究的热点^[26]，如小鼠中GABA_AR β₃亚基中参与戊巴比妥结合的氨基酸残基位于TM2区中部的下游^[27]。

图 4

Fig. 4

图 4 鲫鱼GABAAR β3亚基跨膜结构域的预测结果图 Fig. 4 The predictions of transmembrane domain of GABAAR β3 ubunit of C.auratus

图 5

Fig. 5

图 5 鲫鱼GABAAR β3亚基CDS序列和推导的核苷酸及氨基酸序列 Fig. 5 The CDS sequence of GABAAR β3 subunit of C.auratus and its amino acid sequence 第1个黑框表示该蛋白质的信号肽，TATA框、启动子、终止子、酶切位点用粗体标明； 第2～5个黑框分别表示4个跨膜区，第6个黑框表示3′端加尾信号PLOY(A)尾。 The first box represents the signal peptide of the protein,the TATA box，promoter，and restriction sites indicated in bold. The boxes from 2 to 5 represents the four transmembrane domains， The box 6 represents the ending signal of PLOY(A).

图 6

Fig. 6

图 6 GABAAR β3亚基第2跨膜区比对图 Fig. 6 Multiple sequence alignments of protein sequences of several species

采用NJ法^[28]，用MEGA4.0结合Clustalx对人、小鼠、牛、原鸡、非洲爪蟾、鲫鱼、斑马鱼、罗非鱼和果蝇的GABA_AR β₃亚基制作了系统发育树，结果见图 7。可以看出：鲫鱼GABA_AR β₃亚基与斑马鱼和罗非鱼等水生脊椎动物间存在较近的亲缘关系；而人、小鼠和牛等高等哺乳动物之间存在较近的亲缘关系；哺乳动物、脊椎动物与昆虫在β₃亚基进化上存在明显差异。

图 7

Fig. 7

图 7 多物种GABAAR β3亚基的系统发育树 Fig. 7 The phylogenetic tree of GABAAR β3 subunit in several species that have been reported

将不同来源的cDNA调整至相同的质量浓度(20 ng/μL)并以其作为模板，采用引物梯度浓度法制作标准曲线，计算出引物的扩增效率(斜率)，并确保引物的扩增效率一致性^[29]。重复试验次数记录C_t值，计算相对表达量=2^{-△△C\-t[30]}。结果(表 1)表明，鲫鱼GABA_AR β₃在鲫鱼体内各组织器官有表达，相对表达量为脑>眼>心>皮>肝(图 8)。由于GABA受体作为最主要的神经递质受体主要存在于中枢神经系统，所以脑部表达量远远大于其他部位；眼部也存在视神经传递，眼部其次。

表 1(Table 1)

表 1 鲫鱼GABAAR β3亚基在不同器官中的Ct值 Table 1 C\-t values of GABAAR β3 subunit from different organs of Crassius crassius 器官 Organs Ct平均值 Average Ct values β3 β-actin 眼睛Eye 皮肤Skin 肝脏Liver 脑Brain 心脏Heart 28.45 31.65 32.62 26.44 30.56 28.09 30.14 30.68 27.30 29.62

表 1 鲫鱼GABAAR β3亚基在不同器官中的Ct值 Table 1 C\-t values of GABAAR β3 subunit from different organs of Crassius crassius

图 8

Fig. 8

图 8 GABAAR β3亚基基因在鲫鱼不同 器官的 相对表达量比较Fig. 8 The relative expression levels of GABAAR β3 subunit in different organs of C.crassius

随着绿色农药的不断开发，作为多种药物作用靶标的GABAR研究得到越来越多的关注，而在已报道的文献中，关于GABAR的研究主要集中在哺乳动物和昆虫类，对于水生动物的研究相对较少。笔者通过生物信息学方法结合RACE PCR技术，成功地克隆出我国常见稻田鲫鱼C.auratus 的GABA_AR β₃亚基序列(GenBank ID: KC964110)。对鲫鱼GABA_AR β₃亚基基因的跨膜区域、理论分子质量、等电点以及蛋白质功能位点等进行研究，对受体蛋白的结构和功能研究具有重要意义。通过荧光定量PCR技术研究了鲫鱼不同组织的GABA_AR β₃亚基相对表达量。张晓敏^[31]采用本实验室制备的特异性亲和柱，结合超滤法、聚乙二醇透析法以及DEAE-sephacel离子交换层析法，纯化得到了鱼脑中的GABAR，但存在获取的蛋白量较少、有杂蛋白污染等缺点。相比之下，生物方法获取目的蛋白量具有可控、提取效率高和容易复性等优点。本研究是首次克隆出鲫鱼的GABA_AR β₃亚基基因全长，与Lo等^[32]采用自动计算分析预测的方法预测出的斑马鱼GABA_AR β₃亚基序列相比，序列更加完整准确，这将对克隆其他水生生物以及脊椎动物、昆虫等的GABAR亚基基因具有指导作用。

笔者初步研究了鲫鱼GABA_AR β₃亚基基因的结构特征，在后续的研究中，希望能成功表达、纯化、复性鲫鱼GABA_AR β₃亚基蛋白，进而得到其蛋白结晶体，然后结合计算机模拟(Discovery Studio)构建鲫鱼GABA_AR β₃亚基的三维结构和同源五聚体模型，研究受体蛋白与配体氟虫腈等农药的作用模式和结合能力，以及二者在结合过程中的亲和力与亲和系数。通过原位杂交法研究GABA_AR β₃基因在鲫鱼全身表达量的差异。阐明药物与包括鲫鱼在内的水生动物之间的作用机理，对于研发新农药和开展GABA受体的研究均具有重要意义。