乙嘧酚，化学名称为5-丁基-2-乙基氨基-4-羟基-6-甲基嘧啶，分子式为C₁₁H₁₉N\-3O,相对分子质量为209.3。乙嘧酚为杂环类内吸性杀菌剂，对菌丝体、分生孢子、受精丝等均具有极强的杀灭效果，并能强力抑制孢子的形成，阻断孢子再侵染，杀菌效果全面且彻底^[1]。乙嘧酚对番茄白粉病有明显的防治效果^[2]。洪奎贤等^[3]研究表明，在黄瓜白粉病发病初期喷施25%的乙嘧酚混悬剂800倍液，可有效防治白粉病蔓延；郑伟等^[4]研究表明，25%乙嘧酚悬浮剂对苹果白粉病菌菌丝生长有不同程度的抑制作用；但乙嘧酚对蜜蜂、鱼、鸟、家蚕等非靶生物有潜在危害^[1]。

欧盟已制定乙嘧酚在苹果中的最大残留限量(MRL)标准为 0.1 mg/kg^[5]，我国尚未制定其在苹果中的MRL标准。对于乙嘧酚的残留分析方法，目前主要有高效液相色谱-紫外检测法(HPLC-UV)^[6]、高效液相色谱-串联质谱法(HPLC-MS/MS)等^[7]。王蒙岑等^[8]利用高效液相色谱-二极管阵列检测器(HPLC-DAD)建立了乙嘧酚在黄瓜及其土壤中的残留检测方法，但尚未见有关其在苹果中残留及消解动力学方面的研究。笔者选择苹果实地种植区，利用HPLC-UV法研究了乙嘧酚在苹果中的残留及消解行为，旨在为评估乙嘧酚在苹果中的安全使用提供参考。

1 材料与方法 1.1 仪器与药剂

美国Waters 2695型高效液相色谱仪，配2487型紫外检测器,Waters C₁₈固相萃取小柱(MCX)(3 mL，60 mg)；T25BS2型高速分散匀浆机(德国IKA公司);3K30型高速离心机(美国Sigma公司)；Laborota 4000型旋转蒸发仪(德国Heidolph公司)；AE-240型电子天平(瑞士Mettler-Toledo公司)。Atlantis C₁₈色谱柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)。

乙嘧酚(ethirimol)标准品(纯度>95.6%，由惠州市中讯化工有限公司提供)； 70%甲基硫菌灵(50%)·乙嘧酚(20%)可湿性粉剂(由惠州市中讯化工有限公司提供)。甲醇(色谱纯，德国Meck公司)；乙腈(色谱纯，赛默飞世儿科技(中国)有限公司)；其他试剂为市售分析纯；实验用水为去离子水。 1.2 田间试验

分别于2010和2011年的7—9月，在山东临沂、安徽宿州和河北邢台进行了2年3地的田间试验，苹果品种分别是黄金帅、乔金纳和红富士。山东临沂属暖温带大陆性季风气候；邢台属暖温带亚湿润季风气候，四季分明，年内温差大，降水集中；安徽宿州市属暖温带半湿润季风气候，境内气候适宜，四季分明，冬季寒冷，夏季炎热，光照充足，雨量适中。根据厂家推荐，采用70%甲基硫菌灵(50%)·乙嘧酚(20%)可湿性粉剂防治苹果树白粉病，推荐剂量为有效成分233～350 mg/kg。消解动态试验施药1次，最终残留试验施药3次和4次。依据《农药残留试验准则》^[9]设置试验小区，每小区3棵树，每处理重复 3次，小区间设保护带，另设不施药的空白对照小区。采用手动高压喷雾器喷雾施药。分别设置高、低 2个施药剂量，高剂量为70%甲基硫菌灵·乙嘧酚可湿性粉剂用水稀释1 330倍(乙嘧酚有效成分 525 mg/kg)，低剂量为用水稀释2 000倍(有效成分350 mg/kg)(以下剂量未说明时均为有效成分)。试验小区按施药量由低到高顺序排列。根据树冠的大小决定用水量。为保证施药均匀，一般喷施2遍，以树叶滴水为准。 1.3 乙嘧酚在苹果中的消解动态及最终残留试验 1.3.1 消解动态试验

当苹果生长到成熟个体一半大小时，采用高剂量喷雾施药。分别于施药后1 h和1、2、3、5、7、14 d时，随机在小区内15个采样点采集2 kg 生长正常、无病害、半成熟或成熟的苹果果实，采集部位遍及果树上、中、下部，切碎、混匀后采用四分法留样500 g，于-20℃冰柜中贮存。每处理重复3次，处理间设保护隔离区。另设喷施清水处理为空白对照。每小区3棵树，小区边行和每行距离两端0.5 m内不采样。 1.3.2 最终残留试验 分别采用低、高2个剂量进行喷雾施药。生长期间分别施药3次和4次，施药间隔期为10 d。分别于距最后1次施药后7和14 d时采集苹果样品。每处理重复3次，每重复3棵树。设喷施清水处理为空白对照。处理间设保护行。苹果样本的采集方法及采样区域同1.3.1节。 1.4 样品分析方法 1.4.1 样品提取与净化

称取苹果样品10 g于50 mL 离心管中，加入20 mL乙腈、5 g硫酸钠和5 g氯化钠；高速匀浆1 min，在离心机中以 4 000 r/min 的转速离心5 min，取上清液10 mL于圆底烧瓶中，43 ℃水浴旋转蒸发至近干，用2 mL甲醇溶解，待净化。

采用固相萃取法净化。用2 mL质量分数为50%的甲醇水溶液活化MCX固相萃取柱，当溶剂液面流至吸附填料表面时，立即加入样品浓缩液，将样品液全部转移至萃取柱后，再用3 mL质量分数为2%的甲酸水溶液淋洗，弃去淋出液；先用3 mL甲醇洗脱，再用8 mL含 5%氨水的甲醇溶液洗脱，收集溜出液，氮气吹干后用甲醇定容至2 mL，用0.22 μm滤膜过滤，待测。 1.4.2 色谱分析条件

流动相：V(水)∶V(甲醇)∶V(乙腈)＝56∶24∶20；流速1.0 mL/min；波长223 nm；Atlantis C₁₈色谱柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；进样量10 μL。 1.4.3 标准曲线

准确称取乙嘧酚标准品0.05 ｇ(精确至0.001 ｇ)，用甲醇溶解并定容至50.0 mL，配制成 1 000.0 μg/mL的乙嘧酚标准母液，继而用甲醇稀释成10.0、1.0、0.5、0.1、0.05、0.025 μg/mL的系列标准溶液，进行色谱分析。以乙嘧酚质量浓度(μg/mL)为横坐标(X)，峰面积为纵坐标(y)，绘制标准曲线。 1.4.4 添加回收试验

分别在空白苹果样品中添加乙嘧酚标准溶液，添加水平分别为0.02、0.2和2 mg/kg,按照所建方法进行提取、净化和HPLC检测，计算添加回收率和相对标准偏差(RSD)。每个水平重复5次，同时设空白对照。 1.4.5 数据处理

采用一级动力学方程式(c_t＝c₀ｅ^-kt)计算乙嘧酚在苹果中的半衰期(t_1/2)=ln2/k^[10]。 2 结果与讨论 2.1 前处理条件优化

比较了采用Waters Sep-pak C₁₈、Waters Oasis MCX 2种固相萃取小柱及液液分配3种方法的净化效果。结果发现：采用C₁₈小柱的回收率只有18.6%，液液分配法的回收率为78.6%，而MCX小柱的回收率达95.8%。乙嘧酚的结构中含有极性较强的羟基及碱性较强的氨基，而C₁₈固相萃取小柱对极性强的化合物滞留性较差；尽管调节乙腈提取液的酸碱度，通过液液分配法能将乙嘧酚进行纯化分离，但处理方法繁琐，工作量大，效率低；MCX固相萃取小柱采用离子吸附原理，可使乙嘧酚与杂质很好地分离，是方便、快捷的净化方法。 2.2 线性范围及准确度、精密度和灵敏度

结果表明：乙嘧酚在0.025～10 mg/L范围内，峰面积与质量浓度间呈良好的线性关系，回归方程为y=51 023X-854.2，相关系数r=1。乙嘧酚在苹果样品中检测的准确度(平均回收率)和精密度(相对标准偏差)数据见表 1。相关谱图见图 1。该方法仪器的检出限为0.25 ng。在上述色谱条件下，乙嘧酚在苹果中的最低检测浓度(LOQ)为0.02 mg/kg。

图 1

Fig. 1

图 1 乙嘧酚标准品(A)及苹果空白样品添加0.2 mg/kg乙嘧酚(B)的液相色谱图Fig. 1 Chromatogram of ethirimol standard sample (A) and ethirimol (0.2 mg/kg) spiked into apple (B)

表 1(Table 1)

表 1 乙嘧酚在苹果样品的平均回收率及相对标准偏差 Table 1 Average recovery and relative standard deviation of ethirimol in apple sample 添加水平 Spiking level/(mg/kg) 平均回收率 Average recovery/% 相对标准偏差 RSD/% 0.02 84 3.9 0.2 73 0.68 2 73 0.83

表 1 乙嘧酚在苹果样品的平均回收率及相对标准偏差 Table 1 Average recovery and relative standard deviation of ethirimol in apple sample

结果表明，在所选的色谱条件下，乙嘧酚与杂质具有良好的分离效果，且峰形很好。灵敏度及准确性均符合农药残留分析的要求^[9]。 2.3 乙嘧酚在苹果中的消解动态及最终残留 2.3.1 消解动态

70%甲基硫菌灵(50%)·乙嘧酚(20%)可湿性粉剂在525 mg/kg施药剂量下，乙嘧酚在临沂、宿州和邢台3地在苹果中消解动态均符合一级反应动力学方程模式，消解方程、相关系数和半衰期见表 2。消解动态曲线见图 2。随着时间的延长残留量逐渐降低。2010和2011年乙嘧酚在苹果中的半衰期t_1/2分别为1.94～2.65和2.07～2.70 d，施药7 d后消解率达90％以上，该药应属于易降解农药(t_1/2<30 d)^[11]。

表 2(Table 2)

表 2 乙嘧酚在苹果中的消解规律 Table 2 Residue dynamics of ethirimol in apple

表 2 乙嘧酚在苹果中的消解规律 Table 2 Residue dynamics of ethirimol in apple

图 2

Fig. 2

图 2 乙嘧酚在苹果中的消解动态曲线图 Fig. 2 Dissipation dynamics curve of ethirimol in apple

按照最高推荐剂量(350 mg/kg)和最多推荐次数(3次)施药7 d后，苹果中乙嘧酚的残留量均小于0.02 mg/kg；在施药剂量为最高推荐剂量1.5倍(525 mg/kg)及增加1次用药的情况下，施药7 d后苹果中乙嘧酚的残留量也均小于0.02 mg/kg。表明乙嘧酚在苹果中的消解速率较快，不同施药剂量下施药3～4次，间隔期为10 d时，距末次施药间隔7、14 d采集的苹果样品中乙嘧酚的最终残留量均低于0.02 mg/kg,远低于依据欧盟规定乙嘧酚在苹果中的MRL值(0.1 mg/kg)。 3 结论

苹果样品经乙腈提取、MCX固相萃取柱净化后采用HPLC-UV法检测乙嘧酚在苹果中的残留消解动态。结果表明：乙嘧酚在苹果中的最低检测浓度为0.02 mg/kg，在0.02~2 mg/kg添加水平下，其平均回收率为73%～84%，RSD为0.68%～3.9%。

两年3地的田间试验结果表明：乙嘧酚在苹果中的半衰期为1.94～2.70 d；按最高推荐剂量(350 mg/kg)和最多推荐次数3次施药7 d后，苹果中乙嘧酚的残留量均小于0.02 mg/kg；在施药剂量为最高推荐剂量1.5倍(525 mg/kg)及增加1次用药的情况下，施药7 d后苹果中乙嘧酚的残留量也均小于0.02 mg/kg，因此在该剂量下使用乙嘧酚是安全的。根据本研究结果，建议70%甲基硫菌灵·乙嘧酚可湿性粉剂在苹果上使用的乙嘧酚有效成分质量分数为 233～350 mg/kg，每年用药1～2次，安全采收间隔期为7 d。