多粘类芽孢杆菌Paenibacillus polymyxa属芽孢杆菌科类芽孢杆菌属，是一种非致病性细菌^[1]，已被美国环境保护署(EPA)和加拿大食品质量监督局认定为安全和可商业化的菌株^{[2, 3]}，具有固氮^[4]、溶磷^[4]、促进植物生长^[5]以及防治植物病害^{[6, 7, 8, 9]}等功能，可应用于农业、工业、环境和医药等多个领域。笔者所在课题组以多粘类芽孢杆菌HY96-2作为有效成分，成功研制出多粘类芽孢杆菌可湿性粉剂，田间试验表明其对多种植物叶部病害和土传病害具有较好的防治效果^[10]。进一步利用多粘类芽孢杆菌多糖的助悬浮性质^[11]，提高了该可湿性粉剂的悬浮率(数据未发表)，但发现其润湿时间较长，达不到国家关于农药可湿性粉剂的质量要求。

微生物农药可湿性粉剂常用的载体包括高岭土^[12]、轻质碳酸钙^[13]、硅藻土^[14]、淀粉^[15]、滑石粉^[16]、膨润土^[17]和白炭黑^[18]等，关于载体对制剂润湿性、悬浮率和pH等性质的影响未见报道。白炭黑(主要成分为多孔二氧化硅)具有比表面积大、吸附能力强、分散性能好等特点，特别适宜作为可湿性粉剂和高浓度粉剂的载体^[19]。本课题组的预试验结果表明，在供试载体中，轻质碳酸钙制剂活菌含量最高，因此，本研究以轻质碳酸钙、白炭黑和高岭土为研究对象，利用混料试验设计，将白炭黑和轻质碳酸钙以一定比例组成复合载体，再和多粘类芽孢杆菌发酵液混合后喷雾干燥制成可湿性粉剂，重点研究了白炭黑对多粘类芽孢杆菌可湿性制剂性能的影响，并对所得制剂的悬浮率和pH进行了考察，以期通过优化复合载体配方，提高制剂的润湿性。

1 材料与方法 1.1 供试材料及仪器

高岭土(10～15 μm，水洗高岭土)，广东邦乐化工原料有限公司；轻质碳酸钙(10～13 μm)及380型白炭黑(10～15 μm，亲水性)，上海立至化工科技发展有限公司；多粘类芽孢杆菌发酵液，上海泽元海洋生物技术有限公司；SY6000实验室小型高速喷雾干燥仪，上海世远生物设备有限公司。 1.2 试验方法

在轻质碳酸钙中加入白炭黑，使白炭黑的质量分数分别为0(CK)、5%、10%、20%和40%，然后加入一定比例的多粘类芽孢杆菌发酵液，混合均匀后过250 μm筛，得到料液；将各料液喷雾干燥(进风口温度180 ℃，出风口温度80 ℃)，收集干燥样品；根据文献^{[20, 21, 22]}测定各样品的润湿时间、悬浮率和pH值，重复3次。

在上述筛选结果基础上，运用试验设计软件Minitab15(Minitab Inc.)中的混料试验设计方法，进行可湿性粉剂配方优化及数据分析。具体步骤为：先将高岭土、轻质碳酸钙和白炭黑按混料试验设计中极端顶点设计的质量比例混合，然后加入少量水使之分散均匀，再加入一定比例的发酵液，经搅拌、过筛、喷雾干燥，制得多粘类芽孢杆菌可湿性粉剂。 2 结果与分析 2.1 白炭黑对多粘类芽孢杆菌可湿性粉剂润湿时间、悬浮率和pH的影响

由表 1可看出，轻质碳酸钙和白炭黑按不同质量比组成复合载体，所得各制剂润湿时间之间差异显著(P＜0.05)：对照(CK)润湿时间为416 s，而在轻质碳酸钙中按5%、10%、20%和40%的质量分数加入白炭黑后，制剂的润湿时间分别缩短为354、54、45和55 s，表明加入白炭黑可明显缩短制剂的润湿时间。多重比较表明，当载体中白炭黑的质量分数为5%时，所得制剂的润湿时间与对照相比差异显著，但大于120 s，因此，载体中白炭黑的质量分数应不低于5%。之后随白炭黑添加量的增加，对制剂润湿时间影响不明显(P＞0.05)，因此，复合载体中白炭黑的适宜质量分数为5%～10%。

此外，由表 1还可看出，白炭黑对制剂悬浮率影响不明显(P=0.79＞0.05)，各处理的悬浮率在67.4%～71.4%之间；但白炭黑对制剂pH有明显影响(P＜0.05)，且随其添加量的增加，制剂pH呈下降趋势，这可能是由于白炭黑的pH值比轻质碳酸钙低造成的。

由上述试验结果可知，要大幅缩短制剂的润湿时间，载体中白炭黑的适宜质量分数应在5%～10%范围内。由于白炭黑价格较高，因此有必要进一步优化配方，尽可能降低其质量分数以降低制剂生产成本。

表 1(Table 1)

表 1 白炭黑对多粘类芽孢杆菌可湿性粉剂润湿时间、悬浮率和pH的影响 Table 1 Effects of precipitated silica addition on wetting time,suspensibility and pH of P. polymyxa wettable powders 白炭黑在载体 中的质量分数 Precipitated silica mass fraction in carrier/% 悬浮率 Suspensi- bility/% 润湿时间 Wetting time/s pH 0(CK) 69.3±2.4 a 416±14 a 8.91±0.01 a 5 71.4±1.0 a 354±64 b 8.91±0.01 a 10 68.3±2.4 a 54±6 c 8.84±0.03 b 20 67.4±9.2 a 45±2 c 8.85±0.01 b 40 67.4±2.1 a 55±9 c 8.74±0.01 c 方差分析 ANOVA F4,10=0.421， P=0.79 F4,10=117.951， P＜0.05 F4,10=62.692 P＜0.05 注：采用Ducans多重比较，同列中相同字母表示差异不显著。 Note: Ducan multiple comparison,there is no significant difference between the columns with same letter.

表 1 白炭黑对多粘类芽孢杆菌可湿性粉剂 润湿时间、悬浮率和pH的影响 Table 1 Effects of precipitated silica addition on wetting time,suspensibility and pH of P. polymyxa wettable powders

表 1中各制剂的pH较高(8.7～8.9)，而高岭土具有接近中性的pH值。因此，本研究进一步将轻质碳酸钙、高岭土和白炭黑混配组成复合载体，以 润湿时间、悬浮率和pH值为指标，对多粘类芽孢杆菌可湿性粉剂载体配方进行了优化。在混料设计试验中，如果某种成分的比例限定在一定范围内，则这类试验采用极端顶点设计^[23]比较合适。本研究将多粘类芽孢杆菌可湿性粉剂载体中白炭黑的质量分数限定在5%～10%内，采用Minitab软件进行了试验设计，如图 1所示(每个点代表 1种配方，共13个配方，即13个试验)，配方比例及制剂性能见表 2。

图 1

Fig. 1

图 1 多粘类芽孢杆菌可湿性粉剂载体配方极端顶点设计 Fig. 1 Extreme vertex design of carrier constitute for P. polymyxa wettable powder

表 2(Table 2)

表 2 多粘类芽孢杆菌可湿性粉剂载体配方试验设计和结果 Table 2 Experiment design and results of carrier constitute for P. polymyxa wettable powder 轻质碳酸钙质量分数* Ratio of light calcium carbonate in carrier 高岭土质量分数 Ratio of kaolinite in carrier 白炭黑质量分数 Ratio of precipitated silica in carrier 制剂润湿时间 Wetting time of formulation/s 制剂悬浮率 Suspensibility of formulation /% 制剂pH值 pH value of formulation 0.231 25 0.706 25 0.062 5 268 53.62 8.58 0.450 00 0.450 00 0.100 0 92 50.46 8.63 0.475 00 0.475 00 0.050 0 150 52.97 8.82 0.925 00 0.000 00 0.075 0 122 70.45 9.02 0.950 00 0.000 00 0.050 0 157 73.86 9.09 0.000 00 0.925 00 0.075 0 200 56.20 8.23 0.462 50 0.462 50 0.075 0 107 52.25 8.71 0.231 25 0.681 25 0.087 5 168 51.35 8.56 0.900 00 0.000 00 0.100 0 61 71.91 9.04 0.000 00 0.950 00 0.050 0 300 53.69 8.25 0.706 25 0.231 25 0.062 5 120 57.03 8.86 0.000 00 0.900 00 0.100 0 206 48.64 8.23 0.681 25 0.231 25 0.087 5 78 57.13 8.92 注：*表示轻质碳酸钙在载体中的质量分数，即0.23125表示载体中轻质碳酸钙质量分数为23.125%，其余类同。 Note:* implies ratio of light calcium carbonate in carrier. 0.23125 implies the ratio of light calcium carbonate in carrier is 23.125%. The rest is similar.

表 2 多粘类芽孢杆菌可湿性粉剂载体配方试验设计和结果 Table 2 Experiment design and results of carrier constitute for P. polymyxa wettable powder

结果(见图 2)表明：在轻质碳酸钙质量分数(图中用比值表示，其他图类同)相同或相近的情况下，随白炭黑含量增加，制剂的润湿时间逐渐缩短，如点M与点P相比，点N与点Q相比；同理，在白炭黑质量分数相同或相近的情况下，增加轻质碳酸钙含量，也有利于缩短制剂的润湿时间，如点P和点Q相比，点M和点N相比。由于在白炭黑质量分数不变时，轻质碳酸钙质量分数增加意味着高岭土质量分数的降低，因此上述结果同时表明高岭土质量分数降低有利于缩短制剂的润湿时间，即高岭土不利于制剂的润湿。将图 2中试验数据进行回归，得到润湿时间与3种组分含量的经验方程(1)。

图 2

Fig. 2

图 2 多粘类芽孢杆菌可湿性粉剂润湿时间等值线图 Fig. 2 Contour map of wetting time for P. polymyxa wettable powder 注：轻质碳酸钙在载体中的比值即为轻质碳酸钙质量分数，如轻质碳酸钙在载体中的比值为0.3，表示其在载体中的质量分数为30%。 Note: Ratio of light calcium carbonate in carrier implies mass fraction of light calcium carbonate in carrier. 0.3 implies the mass fraction of light calcium carbonate in carrier is 30%.

(1)式中，A、B和C分别代表载体中轻质碳酸钙、高岭土和白炭黑的质量分数，y₁为制剂润湿时间(s)，R²=0.862 2。

轻质碳酸钙对制剂悬浮率影响最大，其质量分数增加有利于制剂悬浮率的升高，如图 3中白炭黑质量分数相同时各点的比较。当轻质碳酸钙质量分数为90%以上时，制剂的悬浮率可达到70%以上(区域四)。此外，当载体中含有轻质碳酸钙时，增加白炭黑的质量分数对制剂悬浮率无明显影响(如图中区域二和区域四中各点之间比较)，但当载体中不含轻质碳酸钙时，增加白炭黑质量分数不利于制剂悬浮率的提高(如图 3 中轻质碳酸钙质量分数为0时3个点的比较)。3种成分质量分数与制剂悬浮率间的关系可用方程(2)表示。

(2)式中，A、B和C分别为轻质碳酸钙、高岭土和白炭黑在载体中的质量分数，y₂为制剂悬浮率(%)，R²=0.953。

图 3

Fig. 3

图 3 多粘类芽孢杆菌可湿性粉剂悬浮率 等值线图 Fig. 3 Contour map of suspensibility for P. polymyxa wettable powder Note: Ratio of light calcium carbonate in carrier implies mass fraction of light calcium carbonate in carrier. 0.3 implies the mass fraction of light calcium carbonate in carrier is 30%.

由图 4可以看出：白炭黑对制剂pH值无明显影响，但高岭土质量分数的增加可明显降低制剂的pH值，这是由于载体中pH接近中性的高岭土代替了pH较高的部分轻质碳酸钙之缘故。但当高岭土质量分数在80%～100%(即比值在0.8～1.0,图 4区域五中各点)时，制剂的pH值虽然可降至8.4以下，但其悬浮率在50%～60%之间(图 3中区域二)，不符合农药可湿性粉剂质量要求。3种成分质量分数与制剂pH值间的关系可用方程(3)表示。

(3)式中，A、B和C分别为轻质碳酸钙、高岭土和白炭黑在载体中的质量分数，y₃为制剂pH值，R²=0.980 2。

图 4

Fig. 4

图 4 多粘类芽孢杆菌可湿性粉剂pH等值线图 Fig. 4 Contour map of pH for P. polymyxa wettable powder 注：轻质碳酸钙在载体中的比值即为轻质碳酸钙质量分数，如轻质碳酸钙在载体中的比值为0.3，表示其在载体中的质量分数为30%。 Note: Ratio of light calcium carbonate in carrier implies mass fraction of light calcium carbonate in carrier. 0.3 implies the mass fraction of light calcium carbonate in carrier is 30%.

根据我国农药制剂质量要求，设定多粘类芽孢杆菌可湿性粉剂润湿时间期望值范围为50～120 s，悬浮率期望值范围为70%～80%，pH值期望值范围为7.5～9.5，本研究通过Minitab软件优化得到了1个最优的载体组成配方范围(图 5中优化区域)：轻质碳酸钙质量分数为90%～92%(即含量比值为0.90～0.92)，高岭土质量分数为0～2%(即含量比值为0～0.02)，白炭黑质量分数为7.5%～9.0%(即含量比值为0.075～0.09)，此时制剂润湿时间在85～117 s之间，悬浮率在70.5%～71.7%之间，pH在9.01～9.05之间。尽管高岭土对降低制剂pH有一定的作用，但因其质量分数不能超过10%，致使其作用非常有限。因此表 3中制剂的pH值高于表 1的，这可能是由于高岭土的质量分数太低(仅为1.5%)，或不同批次产品的pH检测结果存在误差所致。

图 5

Fig. 5

图 5 多粘类芽孢杆菌可湿性粉剂多指标配方优化区域 Fig. 5 Optimum region of multiple indexes for P. polymyxa wettable powder

在图 5的优化区域内任取1个点，作为1个供验证的载体配方。该配方组成(质量分数)为：轻质碳酸钙90%，高岭土1.5%，白炭黑7.5%，所得制剂各项性能指标的预测值和实测值见表 3。从中可看出，预测值和实测值比较接近，表明图 5所预测的优化区域内的载体配方是可行的，且白炭黑的含量为优化后得到的最低值，可达到降低成本之目的，所得制剂的润湿时间(99 s)和悬浮率(71.7%)均达到合作企业内部质量控制要求。因此，将该配方确定为多粘类芽孢杆菌可湿性粉剂载体配方。

表 3(Table 3)

表 3 优化载体配方的试验验证 Table 3 Experimental verification of the selected formulation in the optimum region of multiple indexes 项目 Item 制剂性能指标Formulation performance 润湿时间 Wetting time/s 悬浮率 Suspensibility/% pH 预测值 Predicted value 105 71.0 9.03 实测值 Experimental value 99 71.7 9.11

表 3 优化载体配方的试验验证 Table 3 Experimental verification of the selected formulation in the optimum region of multiple indexes

本研究结果表明，白炭黑可明显缩短多粘类芽孢杆菌可湿性粉剂的润湿时间，这可能与其物化性质有关。白炭黑的主要成分为二氧化硅，其分子表面含有羟基，是一种亲水性物质；此外，白炭黑具有多孔性结构，比表面积大，也导致其容易吸水。这种较强的亲水性和吸水性可能是白炭黑容易提高多粘类芽孢杆菌可湿性粉剂润湿性的主要原因。

农药可湿性粉剂的润湿性能包括两个方面，一方面是指制剂与水混合时的易混合程度，另一方面是指制剂配成药液后在植物表面的易浸湿程度。本研究虽然提高了制剂与水的易混合程度，但在后续试验中，还需进一步通过添加合适的表面活性剂如有机硅等，以提高药液在植物表面的润湿性或铺展性。

悬浮率也是衡量农药可湿性粉剂质量的重要指标。本研究结果表明，轻质碳酸钙有利于提高制剂的悬浮率，这可能与其密度小且吸附能力较弱有关；但增加轻质碳酸钙质量分数会使制剂的pH值升高，则可能与其中含有氢氧化钙有关。较高的pH可能不利于制剂中生防菌的生长。由于高岭土不利于制剂的润湿，因此通过用部分高岭土代替轻质碳酸钙以达到降低制剂pH的做法意义不大。后续试验中，可以尝试采用其他pH调节剂(如柠檬酸)，以降低多粘类芽孢杆菌可湿性粉剂的pH值。

农药配方研究是典型的多组分配比问题，配方的性质与各组分的含量关系密切。马超等利用三角坐标法对水分散粒剂配方进行了优化，表明三角坐标法可以很好地应用于农药配方优化^[24]。但该法只适用于3种组成成分的配方，从而限制了其应用。本研究表明，应用混料试验设计可以直观地反映各组分含量对制剂性能指标的影响，并可借助计算机对配方进行优化，从而极大地提高配方优化的效率。

4 结论

轻质碳酸钙有利于提高多粘类芽孢杆菌可湿性粉剂的悬浮率，但容易导致制剂pH升高；用高岭土代替部分轻质碳酸钙有助于降低制剂pH，但不利于制剂润湿性的提高；白炭黑可以明显缩短制剂的润湿时间，但过量的白炭黑不利于制剂悬浮率的提高。混料试验设计优化结果表明，多粘类芽孢杆菌可湿性粉剂载体配方中合适的轻质碳酸钙质量分数为90%～92%，白炭黑质量分数为7.5%～9.0%，Minitab软件预测此条件下多粘类芽孢杆菌可湿性粉剂的润湿时间为85～117 s，悬浮率为70.5%～71.7%，pH为9.01～9.05。验证试验结果和预期结果能够较好地吻合。