咪唑啉酮类除草剂是继磺酰脲类除草剂之后由美国氰胺公司研发和生产的一类高效、广谱和低毒的除草剂，在国际市场上占有绝对优势^[1]。随着咪唑啉酮类除草剂的广泛使用，其缺点也越来越突出，主要是在土壤中残留期过长，易影响后茬作物的正常生长，因此研究建立快速检测土壤中咪唑啉酮类除草剂残留的方法具有重要意义。

目前，有关咪唑啉酮类除草剂的检测方法主要有气相色谱-质谱联用法^[2]和液相色谱法^[3]，费时费力，工作效率低，且有机溶剂用量大，易污染环境。土壤基质复杂，易干扰仪器检测的灵敏度。固相萃取(SPE)技术因具有回收率稳定、净化时间短、富集倍数高以及消耗有机溶剂少等优点，可降低样品基质干扰，提高检测灵敏度，因此被广泛应用于样品前处理中^[4,5,6,7,8]。本研究以SAX固相萃取柱净化结合高效液相色谱分析，实现了同时对土壤中咪唑烟酸(imazapyr)、甲基咪草烟(imazapic)、咪草酸甲酯(imazamethabenz-methyl)和咪唑乙烟酸(imazethapyr)4种咪唑啉酮类除草剂(结构式如 Scheme 1)残留的快速、简便和准确检测。

Scheme 1

Scheme 1

Scheme 1

Alliance-E2695高效液相色谱仪(带二极管阵列检测器，DAD)和Empower 3.0工作站(美国Waters公司)；十二孔固相萃取装置(美国Supelco公司)；Agilent ZORBAX Eclipse XDB-C₁₈(250 mm×4.6 mm，5 μm，美国安捷伦公司)；Bond Elut SAX固相萃取小柱(500 mg/3 mL，VARIAN公司)；Milli-Q超纯水仪[美国Millipore(法国)公司]；MODEL868酸度计(美国Orion公司)。

咪唑烟酸(imazapyr)、甲基咪草烟(imazapic)、咪草酸甲酯(imazamethabenz-methyl)和咪唑乙烟酸(imazethapyr)标准品(德国Dr. Ehrenstorfer公司，纯度均为98.0 %)；乙腈和甲醇均为色谱纯，氯化钠、磷酸和无水硫酸镁均为分析纯(无水硫酸镁于650 ℃灼烧4 h，氯化钠于450 ℃灼烧4 h，冷却后于密闭干燥器中保存，备用)。

分别称取咪唑烟酸、甲基咪草烟、咪草酸甲酯和咪唑乙烟酸标准品0.025 51 g于 4 个25 mL容量瓶中，用乙腈定容，配制成质量浓度为1 000 mg/L的标准储备液。再用乙腈分别稀释成各药剂质量浓度分别为10、5、1、0.5、0.1、0.05 mg/L的系列混合标准溶液。

Agilent ZORBAX Eclipse XDB-C₁₈色谱柱(250 mm×4.6 mm,5 μm)；柱温为25 ℃，流动相为V(0.01%磷酸-乙腈)∶V(0.02%磷酸-水)=30∶70，流速为1.0 mL/min，紫外检测波长为257 nm；进样量20 μL，采用等度洗脱15 min。在此检测条件下，咪唑烟酸、甲基咪草烟、咪草酸甲酯和咪唑乙烟酸的保留时间分别为3.7、4.9、6.6和7.8 min。标准品色谱图见图 1。

图 1

Fig. 1

图 1 4种咪唑啉酮类除草剂标准品(0.1 mg/L)色谱图 Fig. 1 Chromatogram of four imidazolinone herbicides standards (0.1 mg/L) 1.咪唑烟酸； 2.甲基咪草烟； 3.咪草酸甲酯； 4.咪唑乙烟酸 1.imazapyr； 2.imazapic； 3.imazamethabenz-methyl； 4.imazethapyr

土壤采集地：A)广西南宁农田(TR1)；B)河南新乡农田(TR2)；C)吉林长春农田(TR3)。每个采样地合理选取5个点，采集表层0~10 cm土壤，混匀，经自然风干后研磨，过1 mm孔径筛后测定土壤理化性质，结果见表 1。

表 1(Table 1)

表 1 土壤理化性质 Table 1 Physical-chemical properties of soils 土壤样品编号 Sample No. 采集地 Source 土壤类型 Soil type pH 有机质含量 Organic matter/% 阳离子交换量 Cation exchange capacity/(mol/kg) TR1 广西南宁农田 Farmland in Nanning,Guangxi 赤红壤Red earth 6.7 8.84 5.60 TR2 河南新乡农田 Farmland in Xinxiang,Henan 黄土Loess 8.3 6.78 10.23 TR3 吉林长春农田 Farmland in Changchun,Jilin 黑土Black soil 7.1 9.53 29.81

表 1 土壤理化性质 Table 1 Physical-chemical properties of soils

准确称取土壤样品(10.0 ± 0.1) g 加入100 mL离心管中，依次加入6 mL去离子水、10 mL乙腈和25 μL磷酸，使混合体系的pH 值为3左右。振荡混匀，涡旋3 min，加入1.0 g氯化钠，涡旋1 min，再加入4.0 g无水硫酸镁，剧烈振荡30 s，涡旋2 min，在4 500 r/min条件下离心5 min，待净化。

SPE小柱依次用3 mL甲醇、3 mL去离子水和2 mL甲醇活化，移取6 mL上清液加入柱中，以20 滴/min的速度流出，收集流出液，用6 mL甲醇洗脱SPE小柱，合并流出液，浓缩至近干，用甲醇定容至1 mL，过0.22 μm有机滤膜，待HPLC分析。

分别吸取0.05、0.1、0.5、1、5、10 mg/L的系列混合标准溶液于进样瓶中，按1.3节的色谱条件分析。以峰面积为纵坐标、进样浓度为横坐标绘制标准曲线。

采用所建立的方法对空白样品进行添加回收试验，添加水平分别为0.02、0.2和0.5 mg/kg ，每个添加水平重复5次。

通过检测器全扫描发现，咪唑烟酸在200、241 nm，甲基咪草烟在201、257 nm，咪草酸甲酯在201 nm，咪唑乙烟酸在200、257 nm处有较强吸收峰，但低波段对目标峰有干扰，故本研究选择257 nm作为检测波长。

由于咪唑烟酸、甲基咪草烟、咪草酸甲酯和咪唑乙烟酸极性较强且呈弱酸性^[9]，pKa≤2,因此流动相呈酸性时可有效抑制待测组分的解离，并且可增加各组分在固定相中的保留时间，同时还可改善峰形。考察了pH 2~7对标准溶液分离度及响应值的影响，发现pH＞4或pH＜3时分离效果均很差，故选择pH 3~4，此时4种除草剂均能很好分离且响应值符合要求。

考察了乙腈、甲醇、二氯甲烷以及V(乙腈)∶V(水)=5∶3 和V(甲醇)∶V(水)=5∶3 的混合溶剂对质量分数为1 mg/kg的4种咪唑啉酮类除草剂的提取效果。结果发现：用单一溶剂提取时效果很差，以V(甲醇)∶V(水)=5∶3作为提取剂时，由于甲醇极性较强，提取杂质较多且不易浓缩；而乙腈极性较弱且不易提取亲脂性物质(如蜡质、脂肪和一些亲脂性色素)，提取液中杂质少，故选用V(乙腈)∶V(水)=5∶3 作为提取剂。

咪唑啉酮类除草剂属弱酸性化合物，在酸性条件下以分子形态存在^[5]。故本研究用磷酸或氢氧化钠调节提取溶液pH至pKa附近，以提高检测的灵敏度。在1.0 mg/kg添加水平下，考察了pH 2~10对回收率的影响。结果表明： pH＜4 时回收率符合要求，在pH=3条件下，4种待测物的峰面积最大，且目标峰附近无干扰，分离度高，故本研究选择pH值为3。

对比了C₁₈、弗罗里硅土和SAX柱的净化效果。结果发现：3种净化柱中，强阴离子交换柱SAX柱的净化效果最好，对羧基有较好保留，且可以去除其他杂质。

考察了不同体积甲醇对质量浓度为1.0 mg/L的4种除草剂混合标准溶液(1 mL)的洗脱效果。结果(见图 2)发现：采用6 mL 甲醇洗脱时，4种除草剂的回收率已达到最高，故选用6 mL甲醇为洗脱液。

图 2

Fig. 2

图 2 甲醇洗脱体积与回收率的关系 Fig. 2 The relationship between elution volume and recovery

结果(见表 2)表明：在0.05~10 mg/L范围内，4种除草剂的质量浓度和峰面积之间呈良好的线性关系。咪唑烟酸、甲基咪草 烟和咪唑乙烟酸在土壤中的定量限(LOQ)为0.01 mg/kg，咪草酸甲酯的LOQ为0.02 mg/kg。

表 2(Table 2)

表 2 待测4种咪唑啉酮类除草剂的标准曲线 Table 2 The standard curves of the four imidazolinone herbicides 除草剂 Herbicides 线性范围 Linear range(0.05～10 mg/L) 线性方程Linear equation R2 咪唑烟酸 imazapyr y=35 784x-701.05 1.000 0 甲基咪草烟 imazapic y=45 365x-474.91 1.000 0 咪草酸甲酯 imazamethabenz-methyl y=31 034x-1 074.6 0.999 9 咪唑乙烟酸 imazethapyr y=50 121x-1 250.2 1.000 0

表 2 待测4种咪唑啉酮类除草剂的标准曲线 Table 2 The standard curves of the four imidazolinone herbicides

供试4种咪唑啉酮类除草剂在空白土壤中均未检出。添加回收结果见图 3和表 3。从表 3中可看出： 4种除草剂的平均添加回收率在 86%~109%之间，相对标准偏差(RSD)为1.2%~3.3%，符合土壤中农药残留检测的要求。

图 3

Fig. 3

图 3 土壤空白样品(A)和添加4种咪唑啉酮类除草剂(0.2 mg/kg，B)回收的谱图Fig. 3 Chromatograms of control blank soil sample(A) and blank soils spiked with four imidazolinone herbicides standards at 0.2 mg/kg(B) 1.咪唑烟酸(imazapyr)； 2.甲基咪草烟(imazapic)； 3.咪草酸甲酯(imazamethabenz-methyl)； 4.咪唑乙烟酸(imazethapyr)

表 3(Table 3)

表 3 待测4种咪唑啉酮类除草剂在土壤中的添加 回收率和相对标准偏差(n=5) Table 3 Recoveries and RSDs of the four imidazolinone herbicides in soil (n=5) 除草剂 Herbicides 添加水平 Spiked level/(mg/kg) 平均回收率 Average recovery/% RSD/% 咪唑烟酸imazapyr 0.02 109 2.3 0.2 92 2.6 0.5 89 1.5 甲基咪草烟imazapic 0.02 89 2.8 0.2 87 1.3 0.5 88 2.8 咪草酸甲酯 0.02 95 3.3 imazamethabenz-methyl 0.2 103 1.5 0.5 101 1.2 咪唑乙烟酸imazethapyr 0.02 95 2.7 0.2 86 1.6 0.5 89 2.0

表 3 待测4种咪唑啉酮类除草剂在土壤中的添加 回收率和相对标准偏差(n=5) Table 3 Recoveries and RSDs of the four imidazolinone herbicides in soil (n=5)

按照本研究所建立的方法对3种类型的土壤进行了4种待测农药的检测。结果(见表 4和图 4)表明：在3种土壤中均未检出4种咪唑啉酮类除草剂；不同土壤的添加回收率在79%~110%之间，相对标准偏差在1.3%~6.1%之间。

表 4(Table 4)

表 4 不同类型土壤样品中添加4种咪唑啉酮类除草剂的平均回收率和相对标准偏差 (n=5) Table 4 Recoveries and RSDs of the four imidazolinone herbicides in three soils (n=5) 除草剂 Herbicides 添加水平 Spiked level/ (mg/kg) TR1 TR2 TR3 平均回收率 Average recovery/% RSD/ % 平均回收率 Average recovery/% RSD/ % 平均回收率 Average recovery/% RSD/ % 咪唑烟酸 imazapyr 0.02 110 5.8 101 5.3 99 4.7 0.2 85 3.7 89 3.6 85 1.5 0.5 81 3.4 93 1.7 82 1.9 甲基咪草烟 imazapic 0.02 87 2.8 83 6.1 79 5.2 0.2 85 3.1 87 4.3 83 3.2 0.5 90 1.9 90 2.5 87 3.6 咪草酸甲酯 imazamethabenz- methyl 0.02 97 3.5 104 4.1 89 3.6 0.2 106 2.0 105 2.1 83 2.9 0.5 102 2.1 103 1.3 85 1.5 咪唑乙烟酸 imazethapyr 0.02 89 4.3 90 2.4 95 3.5 0.2 81 2.7 93 2 92 2.4 0.5 86 2.1 95 1.9 86 2.5 注：TR1采自广西南宁农田；TR2采自河南新乡农田；TR3采自吉林长春农田。 Note: TR1. Farmland in Nanning,Guangxi; TR2.Farmland in Xinxiang,Henan；TR3. Farmland in Changchun,Jilin.

表 4 不同类型土壤样品中添加4种咪唑啉酮类除草剂的平均回收率和相对标准偏差 (n=5) Table 4 Recoveries and RSDs of the four imidazolinone herbicides in three soils (n=5)

图 4

Fig. 4

图 4 实际土壤样品色谱图(以TR3为例)Fig. 4 Chromatograms of soil samples(TR3) A.TR3空白土样； B.TR3空白土样中添加0.2 mg/kg混合标准溶液 A.Control blank soil sample of TR3； B.Spiked herbicides (0.2 mg/kg) in soil sample of TR3 1. 咪唑烟酸(imazapyr)； 2.甲基咪草烟(imazapic)； 3.咪草酸甲酯(imazamethabenz-methyl)； 4.咪唑乙烟酸(imazethapyr)

建立了一种以SAX固相小柱萃取和高效液相色谱(HPLC)法同时检测土壤中咪唑烟酸、甲基咪草烟、咪草酸甲酯和咪唑乙烟酸4种咪唑啉酮类除草剂残留的方法。该方法快速、简便、准确，在0.02~0.5 mg/kg添加水平下，4种除草剂的平均添加回收率在86%~109%之间，相对标准偏差(RSD)≤3.3%，符合农药残留检测要求。