1-氨基环丙烷-1-羧酸(1-aminocyclopropane-1-carboxylate,简称ACC)是植物激素乙烯的合成前体，许多植物根际土壤细菌均可产生ACC脱氨酶，以将植物根际分泌物中的ACC分解为氨和α-丁酮酸，从而为细菌生长提供必需的氮源和碳源^[1]。根据这种植物与土壤微生物之间相互依赖的生态关系，上海交通大学许煜泉教授团队^[2] 首先将采自上海郊区的甜瓜根际土壤样品悬浮于绿脓荧光素测定用液体培养基(PAF)中，以富集其中的假单胞菌；再将其转到以ACC为唯一氮源的基本培养基(ADF)上进一步筛选，获得了具有AAC脱氨酶活性的菌株；将筛选到的菌株接种至马铃薯葡萄糖琼脂培养基(PDA)平板上，测定其对黄瓜枯萎病菌的抑菌活性，从中筛选出了1株具有强烈抑菌活性的菌株，命名为M18(图 1A)。将M18菌株悬浮液涂抹在初发蔓枯病的甜瓜植株上，能有效治愈蔓枯病。比较图 1C和图 1D可以发现，感染甜瓜蔓枯病的甜瓜叶片变黄，而经M18涂抹治愈的甜瓜叶片又恢复绿色。

尽管M18菌株和铜绿假单胞菌PAO1的16s rRNA基因序列相似度高达99.0%，但由于二者的表型在许多方面存在差异，故将M18菌株暂命名为荧光假单胞菌M18生防株(Pseudomonas sp. M18)^[2]。最近，吴大强等^[3]利用第二代高通量测序技术，完成了M18菌株的全基因组测序：该基因组由一条长为6 327 754个碱基的环状染色体构成，已初步注释鉴定了其中5 684个蛋白质编码基因和80个RNA基因；与其他已测序的铜绿假单胞菌基因组(PAO1、PA14、LESB58)一样，M18菌株基因组中也包含一个共同的核心基因组，占该基因组全部基因的90%以上；全基因组比对分析、进化树分析和COG基因分类比较分析结果均表明，M18菌株确实属于铜绿假单胞菌，故将其进一步定名为铜绿假单胞菌M18生防株(Pseudomonas aeruginosa strain M18)^[3]。

M18菌株在PPM(pigment production medium)液体培养基中培养48 h后可产生多种代谢物，其中之一经鉴定为吩嗪-1-羧酸(phenazine-1-carboxylic acid，简称PCA)^[2](图 1B)。PCA是许多植物根际假单胞菌均可产生的一种重要次生代谢产物^[4]，结构比较稳定，具有广谱的抗菌活性，对人畜和环境无害，是研发绿色农药的理想候选化合物。之后PCA由沈阳化工研究院定名为申嗪霉素：“申”源于上海的简称，“嗪”源于其化学名称吩嗪。申嗪霉素也可通过化学方法合成，但合成效率很低，且在合成过程中需用到有毒的合成前体和催化剂^[5]，因此不符合现代绿色农药的生产要求。微生物发酵是目前农用抗生素生产的常用方法，有效且环保，但由于M18野生型菌株申嗪霉素的发酵效价仅为0.2 g/L，远达不到大规模工业化生产的要求，因此，相关团队开展了申嗪霉素生物合成机理及其调控机理的研究，并在此基础上对M18菌株进行遗传和代谢改造，以期提高其发酵效价。

图 2

Fig. 2

图 2 申嗪霉素生物合成基因簇及生物合成机理 Fig. 2 The phz gene clusters and the biosynthetic mechanism of Shenqinmycin in Pseudomonas sp. M18 A. M18 contains two highly homologous phz clusters; B. Proposed biosynthetic pathway for Shenqinmycin; C. Putative biosynthetic roles of enzymes encoded by phz cluster in Shenqinmycin biosynthesis. DHAP:3-deoxy-D-arabinoheptulosonate-7-phosphate; ADIC:2-amino-2-deoxychorismate; DHHA:trans-2,3-dihydro-3-hydroxyanthranilate; PCA: phenazine-1-carboxylic acid. Fig. 2C was originally from Pierson Ⅲ et al[6] with modification.

莽草酸途径的终产物分支酸是申嗪霉素生物合成的前体；从分支酸到申嗪霉素的转化，由申嗪霉素合成基因簇phzABCDEFG(简称phzA-G)编码的7种酶(PhzA、PhzB、PhzC、PhzD、PhzE、PhzF和PhzG)协作完成(图 2A～2B)^[6]。phzC编码3-脱氧阿拉伯庚酮糖酸-7-磷酸(DHAP)合酶，在莽草酸合成途径中催化4-磷酸赤藓糖(E4P)和磷酸烯醇式丙酮酸(PEP)形成DHAP，从而使代谢流转向申嗪霉素的合成；phzE编码甲酸酯合酶，负责将分支酸转变成2-氨基脱氧分支酸(ADIC)，随后，ADIC通过PhzD转变为2,3-二氢-3-羟基邻氨基苯甲酸(DHHA)；PhzF、PhzA、PhzB通过形成醇、酮等步骤进一步将DHHA转化为5-氢-吩嗪-1-羧酸；PhzG是一种FMN-吡哆胺氧化酶，催化底物形成 5，10-二氢-吩嗪-1-羧酸，再通过还原性电子穿梭形成吩嗪-1-羧酸(PCA)(图 2C)^[6,7]。

M18基因组编码2个高度同源的申嗪霉素合成基因簇：phzA1B1C1D1E1F1G1(简称phzA1-G1)和phzA2B2C2D2E2F2G2(简称phzA2-G2)(图 2A)，它们位于M18基因组上不同的位点，大小分别为6 280 bp和6 274 bp。李雅乾等^[8]的研究结果显示:在细菌生长过程中phzA2-G2的表达量较低，其所合成的申嗪霉素仅作为一种信号分子诱导phzA1-G1的表达，促使M18大量产生申嗪霉素。即M18菌株通过2个基因簇之间这种独特的诱导机制，形成一个级联放大系统，在生长后期或在特定的外界环境刺激下大量产生申嗪霉素。

为了提高申嗪霉素的发酵效价，上海交通大学相关研究团队就发酵条件优化和遗传改造2个方面进行了系统深入的研究工作：一方面，通过反复补料分批培养^[21]、响应面发酵成分优化^[22]以及分批发酵和连续发酵^[23]等方法，确立了适宜申嗪霉素生产的最佳培养基和培养条件；另一方面，基于申嗪霉素合成和调控机理的研究结果，先后对M18野生菌株进行了多代遗传改造。首先，Li等^[24]利用同源重组法敲除gacA基因后得到突变体M18G，可将申嗪霉素的产量提高到2.0 g/L；在此基础上，苏静江等^[25]进一步敲除了M18G突变体中的qscR基因，获得了双突变体M18GQ，其申嗪霉素的产量可达到4.0 g/L；周泉等^[26]在M18GQ菌株中，利用质粒pME6032过量表达phzA1-G1基因簇的方法，可使申嗪霉素的产量提高到6.3 g/L。最近，Du等^[27]通过无痕敲除技术，敲除了phzM、 phzS和phzA1-G1基因簇上游的5’-非翻译区，得到3-突变体M18MSU1，其发酵条件经优化后，申嗪霉素的产量可高达4.7 g/L。2009年，上海交通大学将可生产申嗪霉素的高产工程菌株成功转让给上海农乐生物制品有限公司，后者利用该高产工程菌株先后完成小试、中试及大罐生产，并进行了大罐生产工艺、培养基配方的优化。为了避免在提取申嗪霉素过程中使用有毒的有机溶剂氯仿，上海农乐生物制品有限公司还研究出了申嗪霉素水相提取新工艺，降低了生产成本，提高了清洁生产水平和环保等级^[28]；同时，采用超细研磨法及特定助剂，研制出了水基化环保剂型——1%申嗪霉素悬浮剂，其悬浮率可达90%以上，10 μm以下的颗粒比例达95%以上，具有粒度细、附着力强、分散性好等特点^[29]。目前，该公司在上海市奉贤星火开发区设立生物农药产业化基地，已经规模化生产申嗪霉素。

1%申嗪霉素悬浮剂大鼠急性经口喂食的半致死剂量(LD₅₀)大于5 g/kg体重，属低毒农药^[30]。1%申嗪霉素悬浮剂对大鼠、家兔等动物无毒或低毒，对鱼、蜜蜂、鹌鹑和家蚕等4种环境生物低毒或无毒，但对大型蚤为中毒^[30]。申嗪霉素可被环境中的微生物降解，在土壤中的半衰期为8.0～8.7 d。申嗪霉素发酵生产所用培养基的主要成分为黄豆粉和玉米粉，发酵后的废液可回收，因此，不会对环境造成污染。

M18本身也是一株生防菌株，将其接种到上海市浦东锦园园艺温室大棚的黄瓜苗上，可有效防治黄瓜枯萎病和霜霉病^[31]；但在大田试验中，大规模喷洒M18细菌悬浮液对黄瓜枯萎病和霜霉病的防治效果却不佳，这可能与M18菌株不能在植物表面有效定殖有关。M18菌株属于铜绿假单胞菌，是一种潜在的人类条件致病菌，不宜扩散到环境中，因此，利用M18菌株的代谢产物防治植物病害成为首选。许煜泉教授团队首先选择在上海郊区的经济作物上开展申嗪霉素的防病试验，结果表明：1%申嗪霉素悬浮剂能有效防治黄瓜枯萎病^[31]、甜瓜蔓枯病^[32]和辣椒疫病^[33]。2008—2010年间，农业部全国农业技术推广服务中心分别在上海、湖南、湖北、安徽、江苏和福建等地水稻主产区开展了1%申嗪霉素悬浮剂防治水稻纹枯病的大田试验，结果显示：1%申嗪霉素悬浮剂对水稻纹枯病的防治效果与当前使用的主导农药井冈霉素相当，但申嗪霉素的有效成分用量只有井冈霉素的五分之一^[34]。与井冈霉素相比，申嗪霉素的防治范围更广，不仅能防治水稻纹枯病，还能防治西瓜枯萎病和甜椒疫病。2011年3月，申嗪霉素原药及其1%悬浮剂获得中国农业部农药登记证(编号：PD20110314、PD20110315)。

申嗪霉素属于芳香杂环族吩嗪类化合物，该类化合物具有抗菌、抗肿瘤和抗寄生虫活性^[7]。其抗菌活性至少有2方面的机理：一是此类化合物在病原菌细胞内被还原的过程中会产生有毒的超氧离子和过氧化氢，能够氧化谷胱甘肽和转铁蛋白，产生高细胞毒性的羟自由基^[35]； 二是由于吩嗪类化合物能够被NADH还原，成为电子传递的中间体，扰乱了细胞内正常的氧化还原稳态(NADH/NAD+比率等)，影响能量的产生，从而抑制微生物的生长^[36]。目前有关申嗪霉素更深入的抗菌作用机理尚不明确，上海交通大学正与国内多所大学合作，对申嗪霉素的抗菌作用机理进行深入研究。

申嗪霉素是我国自主研发的又一个微生物源绿色农药，具有安全、环保、高效和广谱等特点，具有广阔的应用前景。与我国目前防治水稻纹枯病的主导农药井冈霉素相比，申嗪霉素生产的发酵效价偏低，致使其生产成本偏高，从而影响了其推广应用，因此，提高生产申嗪霉素的发酵效价，降低其生产成本势在必行。笔者等正尝试运用最新的分子生物学和组学技术研究方法，全面探索申嗪霉素生物合成的机理和调控网络，对M18菌株进行遗传和代谢改造，以提高申嗪霉素生产的发酵效价。此外，有关申嗪霉素的施药方法及其与其他农药的复配技术等也正在研究中，以便进一步拓宽其防治对象和应用范围。