剂型加工是当前制约生物农药发展的关键因素，特别是在贮存及使用过程中，制剂中各组分对活菌生防活性的影响，是生物农药剂型加工中尤为重要的因素。目前市场上生物农药的剂型主要有可湿性粉剂、乳油、悬浮剂、水剂等^[1]。其中可湿性粉剂在助剂性能不良时，在水中不易均匀分散，易堵塞喷头或出现喷雾不匀等问题^[2]；乳油受环境因素影响较大，如苏云金芽胞杆菌(Bt)乳油，温度过高可能破坏其晶体毒素结构，使杀虫活性下降，因此Bt在室温下贮存时间一般不超过半年；而生物农药液体剂型的稳定性也较差^[3]。生防微生物的固体发酵产物一般可直接施用，后处理简单，但若将其大规模用于植物病害的防治还存在活菌含量低、用量大、成本高等问题^[4]。总之，以活体微生物为有效成分的农药，目前还存在很大的局限性。为了研制生物农药新剂型，提高生物农药的储存期限，延长其使用寿命，保证其防治效果，本文以对棉花黄萎病具有很好防治效果的解淀粉芽孢杆菌X-278为对象，研究了其片剂的加工及应用。

解淀粉芽孢杆菌X-278(以下简称X-278)分离自河北省辛集市棉田健康植株，室内和田间药效试验均已证明，其不仅对棉花黄萎病具有很好的防治效果，而且对棉花具有很好的促生效果^[5]。本文根据X-278的作用特点，通过对载体、粘合剂、碳源和氮源等的筛选，研发了一种可在棉花根部施用并便于运输的X-278片剂，对其特性及贮存稳定性进行了研究，并研究了其在棉花根、茎内和土壤中的定殖能力，以及其对棉花黄萎病的田间防效和对棉花的增产作用。

X-278菌株和X-278发酵液(2×10⁷ cfu/mL)，由河北农业大学植物保护学院生物防治实验室提供。将4℃保存的X-278菌种转接到NA平板培养基上，28℃下培养24 h后配制菌悬液；取2 mL菌悬液接入到含有100 mL BPY发酵培养基(牛肉膏0.5%，蛋白胨1%，酵母浸膏0.5%，葡萄糖0.5%，氯化钠0.5%)的500 mL三角瓶中，30 ℃、200 r/min下培养48 h，得到种子液。

以每克枯草芽孢杆菌中含10亿活芽孢的可湿性粉剂为对照药剂，由河北省农林科学院植物保护研究所提供。利福平(纯度>98%)购于从上海生工生物工程服务公司; 其余试剂均为市售分析纯。

分别以硅藻土、白炭黑和高岭土为载体，将其与种子液以不同配比混合，于28 ℃下培养48 h后测定其活菌含量，以筛选出最适载体及配比。共设3个处理：m(硅藻土)∶V(种子液)=1∶0.5、1∶1、1∶1.5；m(白炭黑)∶V(种子液)=1∶1、1∶2、1∶2.5；m(高岭土)∶V(种子液)=1∶0.3、1∶0.5、1∶0.6。 1.2.2 碳源、氮源及其最佳配比的筛选

先取2 g硅藻土加入到适量种子液中，再分别加入1 g蔗糖、玉米淀粉、乳糖、果糖、淀粉、麦芽糖、葡萄糖作为碳源，28 ℃下培养48 h后测定活菌含量。以不加碳源者为空白对照。共8个处理，各重复3次。

先将2 g硅藻土加入到适量种子液中，再分别加入1 g硫酸铵、氯化铵、硝酸钾、酵母粉、花生饼、蛋白胨作为氮源，28 ℃培养48 h后测定活菌含量。以不加氮源者为空白对照。共7个处理，各重复 3次。

选择最适碳源，按质量分数分别为15%、20%和25% 3个添加量及最适氮源30%、35%和40% 3个添加量进行双因素方差分析，以确定片剂中营养成分的最佳配比。 1.2.3 粘合剂筛选

根据压片效果及菌在片剂中的存活量选择粘合剂。 1.2.4 片剂性能指标检测

采用中国药典中片剂和微生物农药双重国家标准中的测定方法进行^[6]，检测指标包括外观、水分、质量差异、活菌含量、杂菌率及贮存稳定性等。 1.3 X-278在棉花根、茎及土壤中的定殖能力测定

采用利福平标记法^[7]。筛选在含有100 mg/L利福平的NA培养基上能稳定生长、且对棉花黄萎病菌的拮抗作用保持不变的X-278菌株。采用五点取样法，从棉花第二片真叶展开时开始采集棉苗以及根际土壤样品，之后每隔10 d取样1次。无菌封装，4 ℃保存。采用王志远等^{[8 --------- 9]}的方法，检测棉花根、茎及根际土壤中X-278的含量。 1.4 田间防治效果试验

田间试验在河北省邢台市广宗县进行。试验田已种植棉花15 a以上，棉花黄萎病发生较重且分布较均匀。共设6个处理：X-278片剂穴施，0.2、0.6、1.0 g/株；对照药剂枯草芽孢杆菌可湿性粉剂1 000倍灌根，100 mL/株；X-278发酵液(2×10⁷ cfu/mL) 20倍灌根，100 mL/株；空白对照。每处理重复3次，随机区组设计，各试验小区面积 30 m²，棉株200棵。片剂于棉花种植时随种子一起穴施；可湿性粉剂及发酵液于棉花第2片真叶展开时开始灌根施药，每隔10 d施药1次，连续施药 3次。

分别于棉花现蕾期、结铃盛期和采摘期调查黄萎病的发生情况^[10]，按公式(1)~(3)计算发病率、病情指数及防治效果，其中病情分级标准^[5]为：0级，无病；1级，少数成叶上产生个别病斑或表现嵌色状；3级，植株30%~50%成叶嵌色状；5级，植株50%~100%成叶嵌色状，或叶片凋落，但有棉铃；7级，植株成叶脱落，无棉铃；9级，植株死亡。

参考农业部办公厅颁发的《全国棉花高产创建示范片测产验收办法》^[11](试行)中的方法对棉花产量进行测评。

2 结果与分析 2.1 生物片剂配方组分的筛选 2.1.1 载体

试验结果发现：以高岭土作载体时，解淀粉芽孢杆菌X-278不能生长；当m(白炭黑) : V(种子液)=4 ∶5时，X-278活菌数为5.6×10⁴ cfu/g；而当m(硅藻土)∶V(种子液)=1∶0.5、1∶1、1∶1.5时，其活菌数分别为7.2×10⁸、2.5×10⁸和3.4×10⁸ cfu/g；故最终选择以硅藻土为载体，且其用量为m(硅藻土)∶V(种子液)=1∶1.5。 2.1.2 碳源和氮源及其最佳营养组分配比分析

所加碳源对片剂中X-278活菌含量的影响见图 1。可见加入不同碳源后，其活菌生长量均明显高于空白对照，其中以葡萄糖作为碳源时活菌含量最高，为1.56×10⁹ cfu/g，故最终选择葡萄糖为碳源。

图 1

Fig. 1

图 1 碳源对X-278片剂中活菌含量的影响 Fig.1 Influence of carbon source on the living bacterium content in the X-278 tablets

供试氮源对片剂中X-278活菌含量的影响见图 2。结果表明：分别以硫酸铵、氯化铵、硝酸钾为氮源时，片剂中X-278活菌含量均低于空白对照，说明这几种氮源并不适合该菌的生长；而以花生饼作为氮源时，活菌含量最高，为1.2×10⁹ cfu/g；故选择花生饼作为最适氮源。

图 2

Fig. 2

图 2 氮源对X-278片剂中活菌含量的影响 Fig.2 Influence of nitrogen source on the living bacterium content in the X-278 tablets

将碳源葡萄糖与氮源花生饼按不同质量比混配后进行试验，发现当葡萄糖的质量分数为15%、花生饼的质量分数为30%时，片剂中X-278活菌含量最高，达5×10⁹ cfu/g(表 1)。双因素方差分析结果显示，F_碳源=1.026<F0.05(2,4)=6.94，F_氮源=2.328< F0.05(2,4)=6.94，即碳源不同的质量比和氮源不同的质量比对X-278片剂中活菌含量影响均不大。从经济上考虑，最终选择葡萄糖和花生饼的质量分数分别为15%和30%。2.1.3 粘合剂的筛选 试验结果表明，以20%的聚乙二醇和20%的淀粉浆作粘合剂进行压片时，片剂中X-278的含量分别为2.3×10⁶和7.4×10⁷ cfu/g，后者明显高于前者，故选择20%的淀粉浆作粘合剂。

表 1(Table 1)

表 1 不同质量比的碳源和氮源对X-278片剂中 活菌含量的影响(cfu/g) Table 1 Influence of different mass ratio of carbon and nitrogen on the living bacterium content in the X-278 tablets(cfu/g) 花生饼的质量分数% Mass fraction of peanut cake 葡萄糖的质量分数% Mass fraction of glucose 15 20 25 30 5.0×109 4.5×109 2.3×108 35 3.7×109 1.1×1010 1.5×1010 40 4.3×109 1.7×1010 1.9×1010

表 1 不同质量比的碳源和氮源对X-278片剂中活菌含量的影响(cfu/g) Table 1 Influence of different mass ratio of carbon and nitrogen on the living bacterium content in the X-278 tablets(cfu/g)

采用m(硅藻土)∶V(种子液)=1∶1.5、葡萄糖质量分数15%、花生饼30%及淀粉浆(粘合剂)20%的配方，研制出了规格为0.2g/片的片剂，其含水量(质量分数)为0.5%，X-278菌含量为7.4×10⁷ cfu/g，未检测到其他杂菌。片剂外观完整、光洁，色泽均匀。加速破坏试验结果显示，该片剂在-20～37 ℃ 4个测试温度下贮存200 d内，均能保持很好的稳定性，其中在28 ℃下贮存时稳定性最好(表 2)。

表 2(Table 2)

表 2 贮存期内单位体积中X-278活菌数的变化 Table 2 Changes of living bacterium per unit volume of X-278 in preservation period 贮存时间 Preservation period /d 活菌数 Number of living bacterium /(cfu/g) -20 ℃ 4 ℃ 28 ℃ 37 ℃ 1 7.4×107 7.4×107 7.4×107 7.4×107 5 7.4×107 7.2×107 7.4×107 7.4×107 10 6.9×107 7.0×107 7.1×107 6.7×107 30 6.1×107 6.2×107 6.7×107 6.4×107 90 5.7×107 6.0×107 6.5×107 6.0×107 200 2.4×107 2.5×107 3.6×107 2.7×107

表 2 贮存期内单位体积中X-278活菌数的变化 Table 2 Changes of living bacterium per unit volume of X-278 in preservation period

播种27 d后为棉苗第2片真叶展开期，于播种30 d后取样，检测结果(图 3、图 4)显示：施用不同剂量的X-278片剂后，X-278均可在棉花根、茎内很好地定殖和传导，且各处理的定殖量随处理时间的延长呈“先增后减”的趋势。施用片剂40 d时定殖量达到最高，且最高定殖量随施用剂量的增加而增加，60 d后仍能检测到X-278；而采用X-278发酵液(2×10⁷ cfu/mL)20倍进行灌根处理，50 d时X-278的定殖量达最高，但明显低于片剂的最高定殖量。试验结果表明，解淀粉芽孢杆菌在棉花根、茎内具有很强的定殖和传导能力，且其片剂的持效期明显优于发酵液。

图 3

Fig. 3

图 3 X-278片剂及发酵液在棉花根内的定殖 Fig.3 Colonization of X-278 in cotton root through tablets and fermented liquid treatment

图 4

Fig. 4

图 4 X-278片剂及发酵液在棉花茎内的定殖 Fig.4 Colonization of X-278 in cotton stem through tablets and fermented liquid treatment

X-278在棉花根际土壤中的定殖情况测定结果(图 5)显示：片剂处理后30～40 d内，X-278含量呈上升趋势，说明片剂中的X-278在土壤中能自身繁殖，处理40 d后，菌含量呈下降趋势，这可能是由于X-278通过棉苗的蒸腾作用，由初始接种位点根际土壤经过根系维管束系统逐渐向植株地上部分迁移的结果，并在60 d内保持较高的群体数量；X-278发酵液处理后40～50 d内，根际土壤中菌含量增加较快，可能是由于处理次数增加造成菌含量突然增加，而50 d后菌含量直线下降，且下降速度明显快于片剂处理，这可能是由于停止施药后，发酵液中营养不足，菌种不能在土壤中快速繁殖造成的。本研究结果表明，片剂内的X-278能在根际土壤中很好地繁殖并定殖。

图 5

Fig. 5

图 5 X-278片剂及发酵液在土壤中的定殖 Fig.5 Colonization of X-278 tablets and its fermented liquid in soil

根据棉花黄萎病病情分级标准^[5]，在棉花现蕾期和结铃盛期发病植株均为1级，且发病植株不多因此只计算其发病率。本研究中，各处理组棉花在现蕾期的发病率无明显区别；在结铃盛期，空白对照的发病率明显高于其他处理，其中片剂0.6 g/株的处理发病率最低，仅为6%；在棉花采摘期，空白对照的病株数量最多，且病情达5级，虽然枯草芽孢杆菌可湿性粉剂处理的棉田病情级数也达到5级，但病株总数较空白对照少，其他各处理棉株的病情均未达到5级。枯草芽孢杆菌可湿性粉剂对棉花黄萎病的田间防效为72.74%，X-278发酵液为76.87%，而X-278片剂3个剂量处理的防效均达到85%以上(表 3)。试验结果表明，X-278片剂对棉花黄萎病表现出很好的田间防治效果，其3个剂量处理之间无显著差异，但均明显优于10亿活芽孢/g枯草芽孢杆菌可湿性粉剂和X-278发酵液。

表 3(Table 3)

表 3 X-278不同剂型处理对棉花黄萎病的田间防治效果 Table 3 Field control efficacy of X-278 in different formulation to cotton verticillium wilt 处理 Treatment 棉花现蕾期 Cotton budding period 棉花结铃盛期 Cotton peak bolling stage 棉花采摘期 Cotton picking period 发病率 Disease incidence/% 发病率 Disease incidence/% 病情指数 Disease index 田间防效 Field efficiency 空白 Blank 2 16 12.74 Aa - X-278片剂         0.2 g/株 0.2 g/plant 2 8 1.85 Dd 85.47 Cc X-278 Tablets          0.6 g/株 0.6 g/plant 1 6 1.74 Dd 86.34 Cc         1.0 g/株 1.0 g/plant 2 7 1.23 DEde 88.15 CDcd 枯草芽孢杆菌 WP 100 mL/株         B. subtilis WP 100 mL/plant 1 11 3.22 Bb 72.74 Aa X-278发酵液(2×107 cfu/mL) 20倍 X-278 Broth(2×107 cfu/mL) 20 times 1 9 2.89 Cc 76.87 Bb 注：同列数据后相同大、小写字母分别表示在P<0.01和P<0.05水平上差异不显著。 Note：The same capital letters and lower case letters in the column indicate that there is no significant difference between the data at 0.01 and 0.05 level,respectively.

表 3 X-278不同剂型处理对棉花黄萎病的田间防治效果 Table 3 Field control efficacy of X-278 in different formulation to cotton verticillium wilt

试验结果(表 4)表明：X-278片剂的3个剂量处理，其单株成铃数均高于其他处理，其中0.6g/株处理的单株成铃数最多，为17.60朵，每公顷产量均增加24%以上；枯草芽孢杆菌可湿性粉剂和X-278发酵液处理每公顷产量分别增加9%和15%(表5)。表明X-278片剂能显著提高棉花产量。

表 4(Table 4)

表 4 X-278不同剂型处理对棉花产量的影响 Table 4 Influence of different formulations of X-278 on cotton production 处理 Treatment 单株成铃数/朵 Number of bolls per plant 单棉铃质量 Single boll mass/g 单皮质量 Single tare mass/g 衣分率 Lint percentage rate/% 每公顷籽棉质量 Seed cotton mass per hectare/kg 每公顷皮棉质量 Lint mass per hectare/kg 空白 Blank 11.80 7.33 2.50 36.09 6 490.05 aA 2 342.25 aA X-278片剂       0.2 g/株 X-278Tablets 0.2 g/plant 14.67 7.17 2.50 36.88 7 883.40 abcAB 2 907.60 abcA          0.6 g/株 0.6 g/plant 17.60 7.17 2.50 36.88 9 460.05 cB 3 489.15 cA          1.0 g/株 1.0 g/plant 16.51 6.83 2.50 38.59 8 461.95 bcAB 3 265.05abA 枯草芽孢杆菌WP     100 mL/株 B. subtilis WP     100 mL/plant 13.77 6.67 2.33 37.00 6 883.35 abAB 2 546.85 abA X-278发酵液(2×107 cfu/mL) 20倍 X-278 Broth(2×107 cfu/mL) 20 times 13.67 6.83 2.50 38.59 7 004.10 abAB 2 702.55 abcA 注：同列数据后相同大、小写字母分别表示在P<0.01和P<0.05水平上差异不显著。 Note：The same capital letters and lower case letters in the column indicate that there is no significant difference between the data at 0.01 and 0.05 level,respectively.

表 4 X-278不同剂型处理对棉花产量的影响 Table 4 Influence of different formulations of X-278 on cotton production

微生物农药制剂加工的优劣及制剂化程度高低已成为其开发的瓶颈。制剂中的各种辅料成分、pH值及含水量等在很大程度上影响着微生物农药的稳定性及活性。在制备解淀粉芽孢杆菌X-278片剂过程中，加入的碳源和氮源使其在芽孢形成阶段中因具有充足的营养成分而有利于菌株的繁殖，从而可以保持较高的含菌量而使其活性提高；X-278片剂施用于棉花根部土壤中，可减少紫外光等不利因素的影响，延长持效期，从而较好地解决了生物制剂贮存稳定性差、持效期短、长期存放含量菌过低等技术难题。

田间试验结果表明，X-278片剂对棉花黄萎病的防效可达85%以上，高于已报道的NCD-2菌株对棉花黄萎病的防效(70%以上)^[12]。夏正俊等从棉株内分离得到了73a、A1a等对棉花黄萎病具有良好防效的内生菌，其中73a的室内防效在70%以上^[13]。Tehrani等从土壤中分离到5株抗棉花黄萎病的菌株，同时发现其能不同程度地提高棉花的产量^[14]。本研究结果与之相似，X-278片剂能很好地在棉花植株茎和根中定殖和传导，施药后50 d时在根、茎中的定殖量仍然高达10³~10⁴ cfu/g，并能提高棉花皮棉产量49%。

片剂具有成型性好、工艺简单、省时省力、易贮存及运输安全等特性，本研究结果为生物制剂剂型加工提供了重要参考；另外本研究制备的片剂，不含有毒有害载体，为环境友好型产品，具有较好的开发利用前景。