以天然或合成的高分子材料为壁材，将固体或液体药物(通称芯材)包裹成的药库型微小胶囊称微囊(microcapsules)；而使芯材溶解或均匀分散在成球材料中，形成骨架型微小球状实体则称为微球(microspheres)；微囊及微球的制备过程统称为微囊化^[1]。目前以脂肪族聚酯、聚乳酸及其共聚物及天然高分子聚合物等生物可降解物质为壁材的农药微球的研究正逐渐成为农药缓释剂研究的热点^{[2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10]}。

多杀菌素(spinosad)是一种应用前景广阔的新型生物源农药^[11]，而甲氨基阿维菌素苯甲酸盐(emamectin benzoate,以下简称甲维盐)是一种高效、广谱、无公害的生物源杀虫剂^{[12, 13]}。二者具有不同的作用方式，将其复配使用，可明显提高其对靶标害虫的防治效果，有效延缓鳞翅目害虫抗药性的产生，并能缓解环境压力^[14]。但二者在田间易发生光解 ^{[15, 16]}，导致其在田间叶面施用时持效期较短。目前二者的复配制剂主要为乳油^[17]及水分散粒剂^[14]，若将二者加工成农药微球，可有效降低光解速率，延长持效期。

在农药配方筛选过程中，目前应用较为广泛的试验工艺优化方法是正交设计和均匀设计^{[18, 19, 20, 21, 22]}。这两种方法试验次数均较少,但其更多的是用于对线性模型的预测，对非线性模型的预测精度相对较弱,某些设计表如正交L9(3⁴)不适于二次以上多项式模型^{[23, 24]}，而在农药制剂工艺和配方筛选过程中,各影响因素与结果之间关系往往并非简单的线性关系。中心多点等距设计(central composite design,CCD)是在二水平析因设计的基础上加极值点、中心点组成的一种试验设计，已在医药领域有较多应用^{[25, 26, 27, 28]}。在相关试验设计中，若仅有析因设计点，则只能用作线性拟合，但加入极值点后，即可增强其对非线性模型的拟合能力，一定量的中心点重复可保证试验设计的均一精密性及正交性^[29]。与正交设计和均匀设计相比，CCD设计能建立拟合度、相关性、预测性更好的非线性回归模型^[23]，因此可作为农药微球制备工艺优化的工具^{[30, 31]}。

农药配方筛选过程中，往往需要对多个技术指标进行考察。各指标间往往互相影响，对某一项指标有利的因素条件可能不利于另一指标，最终选择条件往往依据这些指标的综合效应。通过“归一化”法，将各个指标均标准化为0~1 间的“归一值” (desirability),由各指标“归一值”求算几何平均数,得总评“归一值”(overall desirability,OD)^[32]，可实现对各指标综合效应的客观量化。通过中心多点等距设计法建立数学模型，通过优化与预测分析筛选出对多个指标均有利的因素水平。本研究首次制备了多杀菌素·甲氨基阿维菌素苯甲酸盐聚乳酸微球(以下简称多杀菌素·甲维盐微球)，并采用中心多点等距设计法，应用总评“归一值”对其制备工艺进行多指标优化，以期为该农药剂型的配方优化提供借鉴。

XHF-I高速内切式匀浆器(宁波新芝生物科技股份有限公司)；LS-POP(7)型激光粒度分析仪、SCF-106循环进样系统(珠海欧美克科技有限公司)；Eppendorf 5804R高速冷冻离心机(德国艾本德股份公司)；FA2004电子分析天平(上海舜宇恒平科学仪器有限公司)；Acme9000高效液相色谱仪(HPLC,韩国英麟机器有限公司)；88-1大功率双数显磁力搅拌器(常州国华电器有限公司)；DHG-9140A型恒温鼓风干燥箱(上海精宏实验设备有限公司)。

95.8%甲氨基阿维菌素苯甲酸盐原药(emamectin benzoate，TC，佳木斯兴宇生物技术开发有限公司)；84.97%多杀菌素原药 [spinosad，TC，由陶氏益农48%多杀菌素悬浮剂(催杀)提取纯化]；聚乳酸(PLA，注塑级，相对分子质量约为8万，深圳光华伟业实业有限公司)；PVA-1788(醇解度88%，阿拉丁试剂有限公司)；透析袋(相对分子质量 7 000，美国Viskase公司)；其他试剂均为市售分析纯、化学纯或色谱纯。

采用溶剂蒸发法^{[6, 9]}。分别称取一定量按比例混配好的多杀菌素·甲维盐原药和 0.4～1.2 g聚乳酸，溶于10 mL二氯甲烷中，保鲜膜密封后置于冰水浴中；待二者充分溶解后，以注射器将药液注入100 mL 质量分数为2.0% 的PVA-1788水溶液中，用高速内切式匀浆器以3 600 r/min乳化0.5 min，制得初乳液。加入约0.3 mL有机硅消泡剂，保持反应温度30 ℃，在避光及 360～1 200 r/min条件下高速搅拌，待二氯甲烷挥发完全后(约3～4 h)离心，抽滤，分离固形物并置于恒温干燥箱中，40 ℃下烘干，即得多杀菌素·甲维盐微球。

精确称取20 mg微球，用少量二氯甲烷溶解。待二氯甲烷完全挥发后加入1.5 mL 甲醇，超声萃取5 min，转移至10 mL棕色容量瓶中，重复萃取5次，用甲醇定容至10 mL；经0.22 μm滤膜过滤，高效液相色谱法(HPLC)测定样品中多杀菌素及甲维盐的含量。

HPLC检测条件^[17]为：Amemyst C₁₈-H色谱柱 (250 mm×4.6 mm)，紫外检测器，柱温为室温(25 ℃)，流速1.0 mL/min，检测波长250 nm，进样体积20 μL，流动相为V(甲醇)∶V(乙腈)∶V[水(含0.5%乙酸钠)]=45∶45∶10。分别按(1)、(2)和(3)式计算微球载药量和包封率。

称取0.3 g微球样品和0.03 g磷酸钠(分散剂)于50 mL量杯中，加入超纯水约40 mL，超声波处理5 min，采用循环进样法用激光粒度仪测定微球粒径。按(4)式计算跨距(S_p)。

以磷酸盐缓冲液(PBS，pH 7，含20%甲醇)为释放介质，采用透析膜扩散法^[33]测定微球的释药性能。称取75 mg微球，置于含2 mL释放介质的透析袋内，两端扎紧后投入到含150 mL释放介质的锥形瓶中，保鲜膜封口，避光条件下置于25 ℃恒温摇床上，以120 r/min的转速振荡。每隔24 h取2 mL释放介质，经0.22 μm 滤膜过滤后用HPLC测定释放介质中多杀菌素与甲维盐含量，计算农药释放率。每次取样后需补足2 mL释放介质。

分别称取10 mg左右的多杀菌素·甲维盐微球、按一定比例混配好的多杀菌素·甲维盐原药与空白PLA微球的物理混合物、以及空白PLA微球，置于热分析仪中，以氩气为保护气，从室温开始以10 K/min的速率升温至1 000 K，记录数据并作图。

在预试验的基础上，选取对微球性质影响较显著的3个因素作为考察对象，即聚乳酸质量浓度(mg/mL)、理论载药量(%)和搅拌速率 (r/min)。根据CCD 的原理，每个因素设5水平，各因素的极大和极小水平根据预试验结果和制备的实际需要而定。各因素及水平见表 1，试验安排见表 2(1～4列)。

表 1(Table 1)

表 1 CCD设计的因素、水平表 Tab 1 Independents variables and their levels in coded and physical form in the central composite design 水平Level 聚乳酸质量浓度 Content of polylactide/(mg/mL) 理论载药量 Theoretical pesticides loading/% 搅拌速率 Stirring speed/(r/min) -1.732 39.55 9.77 363.63 -1 60.00 20.00 500.00 0 90.00 35.00 700.00 1 120.00 50.00 900.00 1.732 140.45 60.23 1036.36

表 1 CCD设计的因素、水平表 Tab 1 Independents variables and their levels in coded and physical form in the central composite design

表 2(Table 2)

表 2 CCD设计试验表及各项指标值 Tab 2 Experimental designs with experimentally determined values of different dependent variables 序号 No. 聚乳酸 质量浓度 Content of polylactide X1/(mg/mL) 理论载药量 Theoretical pesticides loading X2/% 搅拌速率 Stirring speed X3/(r/min) 实际载 药量 Actual pesticides loading/% 包封率 Entrapment rate Y1/% 平均粒径 Mean diameter Y2/μm 跨距 Span Y3 5 d释放率 Release percentage of 5 days Y4/% 总评 “归一值” OD 1 60.00 20.00 500 11.34 63.70 6.14 1.208 23.94 0.400 9 2 120.00 20.00 500 12.91 71.56 7.62 1.730 17.91 0.024 6 3 60.00 50.00 500 38.68 84.36 6.31 1.208 64.17 0.579 8 4 120.00 50.00 500 38.74 84.47 8.12 1.625 54.67 0.397 8 5 60.00 20.00 900 10.97 61.88 6.68 1.137 54.54 0.313 3 6 120.00 20.00 900 12.95 71.77 8.22 1.568 38.13 0.310 5 7 60.00 50.00 900 37.38 81.77 7.26 1.230 53.58 0.582 4 8 120.00 50.00 900 38.71 84.42 9.17 1.398 81.18 0.000 0 9 39.55 35.00 700 19.27 62.06 5.88 0.963 48.12 0.437 9 10 140.45 35.00 700 25.09 78.69 9.62 1.473 52.56 0.000 5 11 90.00 9.77 700 4.964 57.80 7.42 1.396 12.19 0.000 0 12 90.00 60.23 700 53.22 95.42 6.95 1.316 54.48 0.676 5 13 90.00 35.00 363 20.38 65.25 7.00 1.139 35.65 0.463 7 14 90.00 35.00 1 036 23.38 73.80 8.42 1.077 62.18 0.409 9 15～ 20 90.00 35.00 700 23.52 74.20± 1.18 8.24± 0.11 1.156±0.009 35.69± 1.20 0.4924±0.0141

表 2 CCD设计试验表及各项指标值Tab 2 Experimental designs with experimentally determined values of different dependent variables

按配方制备微球，测定载药量、包封率、平均粒径、跨距及5 d 释放率。参考文献^[32]方法，每个指标均标准化为0～1 之间的归一值(desirability)，由各指标归一值求算几何平均数，得总评“归一值”(overall desirability)。

对取值越小越好的因素(粒径、跨距及5 d释放率)，分别按(5)式计算归一值；对取值越大越好的因素(包封率和载药量)，分别按(6)式计算归一值。

d=(Ymax-Y )/(Ymax-Ymin )(5)

d=(Y-Ymin)/(Ymax-Ymin )(6)

OD=(d₁d₂d₃d₄d₅ ) ^1/5(7)

其中d 为各指标的归一值；d₁～d₅分别表示5个指标的归一值；OD为总评“归一值”；Y为该指标的测定值；Y_max与Y_min分别为所有试验方案中该指标的最大值与最小值。

微球的各项指标——包封率、粒径、跨距、5 d释放率及总评“归一值”的试验结果见表 2 。经Design-expert.V8.0.6软件拟合，微球的聚乳酸质量浓度、理论载药量及搅拌速率对微球包封率的影响符合线性关系，对微球平均粒径、跨距、5 d释放率及总评“归一值”的影响符合多元二次方程；分别固定3个因素中的一个为中值，绘制其余2个因素对粒径、跨距、5 d释放率及总评“归一值”的三维空间曲面图，对各因素的影响及各因素间存在的交互作用进行分析的结果如下(图 1~2)。

图 1

Fig. 1

图 1 三维因变量效应图 Fig. 1. 3D response surface graphs of dependent variables X1、X2、X3分别为聚乳酸的质量浓度(mg/mL)、理论载药量(%)和搅拌速率(r/min) X1,X2,X3 represent content of polylactic acid(mg/mL),theoretical pesticide loading(%) and stirring speed(r/min),respectively

图 2

Fig. 2

图 2 三维因变量效应图 Fig.2 3D response surface graphs of dependent variables X1,X2,X3分别为聚乳酸质量浓度(mg/mL)、理论载药量(%)和搅拌速率(r/min) X1,X2,X3represent content of polylactic acid(mg/mL),theoretical pesticide loading(%) and stirring speed(r/min)，respectively

随着聚乳酸质量浓度、理论载药量及搅拌速率的升高，微球的包封率均出现不同程度的增加。经拟合，微球的包封率与聚乳酸质量浓度、理论载药量及搅拌速率在所选区间内符合一级动力学方程为：Y₁=74.11+3.55X₁+9.47X₂+0.74X₃， R²=0.871 8,P<0.05，表明线性关系良好，且3个因素在各自区间内并不存在交互作用。本研究结果表明，随着聚乳酸质量浓度、理论载药量和搅拌速率的增大，微球包封率逐渐增大，最高可达95.42%。

聚乳酸质量浓度、理论载药量及搅拌速率对微球平均粒径的影响符合二项分布式：Y₂=8.25+0.95X₁+0.10X₂+0.41X₃+0.087X₁X₂+0.020X₁X₃+0.11X₂X₃-0.19X₁²-0.39X₂²-0.20X₃²,R²=0.955 6,P<0.05，呈显著相关性。在所选区间内，微球的粒径随聚乳酸质量浓度及搅拌速率的增加而增大；较高或较低的理论载药量均会减小微球粒径，理论载药量在中值(35%)附近取值时，微球粒径达到最大值(见图1a)。3个因素间存在一定的交互作用，其中理论载药量与搅拌速率之间的交互作用更为明显。

聚乳酸质量浓度、理论载药量及搅拌速率对微球跨距的影响符合二项分布式：Y₃=1.15+0.18X₁-0.023X₂-0.040X₃-0.046X₁X₂-0.042X₁X₃+0.003 47X₂X₃+0.055X₁²+0.10X₂²+0.016X₃ ²，R²=0.879 4，P<0.05，呈显著相关性。在所选区间内，聚乳酸质量浓度越高，搅拌速率越低，微球的跨距越大；在所选区间接近中值(40%)附近，微球跨距最小(见图1b)，较高与较低的理论载药量均会造成跨距增大。3个因素间存在一定的交互作用，其中理论载药量与搅拌速率之间的交互作用较小。 聚乳酸质量浓度、理论载药量及搅拌速率对微球5 d释放率的影响符合二项分布式：Y₄=35.57+0.23X₁+13.93X₂+8.15X₃+5.07X₁X₂+3.34X₁X₃-4.36X₂X₃+5.98X₁²-0.031X₂²+5.48X₃²,R²=0.9318,P<0.05，呈显著相关性。随着理论载药量及搅拌速率的增加，微球5 d释放率增加，而当聚乳酸质量浓度在80 mg/mL附近时，微球5 d释放率最小(见图2a)。

聚乳酸质量浓度、理论载药量及搅拌速率对微球总评“归一值”的影响符合二项分布式：OD=0.49-0.14X₁+0.12X₂-0.021X₃-0.048X₁X₂-0.003 35X₁X₃-0.074X₂X₃-0.096X₁²-0.054X₂²-0.019X₃²,R²=0.832 5,P<0.05，呈显著相关性。随着聚乳酸质量浓度及搅拌速率越大，总评“归一值”有减小的趋势，但其中搅拌速率的影响不显著；随着理论载药量增大，总评“归一值”明显增大(见图2b)。

由图2b可知，当X_1、X_2、X₃分别在60～80 mg/mL、45%～50%、500～600 r/min区间取值时，总评“归一值”可达到最大。微球粒径是影响微球理化性质的重要因素。粒径越小，越容易配制成悬浮率较高的农药悬浮剂，但过小的微球粒径将增加微球在形成过程中有效成分流失的概率，造成载药量降低，释药速率加快^{[34, 35]}。因此，农药微球的粒径应控制在一定范围内。

本研究根据实际情况，将微球平均粒径控制在7～10 μm。经Design-expert V8.06软件优化，当X₁、X₂、X₃分别取77.79 mg/mL、51.06%、560.91 r/min时，总评“归一值”可达到最大值0.681 1。较优条件下制备的多杀菌素·甲维盐微球表面较为圆整光滑(图 3),粒度分布较为均匀(图 4)；差示量热扫描结果(图 5)表明，微球玻璃转化温度较之未包裹多杀菌素及甲维盐的空白聚乳酸微球减小约 10 ℃，说明原药已与聚乳酸框架结构以非定型态结合，而并非简单的物理吸附。经测定，总评“归一值”预测值与实测值偏差较小(见表 3)，表明本研究所建立的数学模型可用来预测多杀菌素·甲维盐微球的较优配方。

图 3

Fig. 3

图 3 微球电子扫描图 Fig.3 Scanning electron microscope photographs of microspheres

图 4

Fig. 4

图 4 微球粒径分布图 Fig.4 Size distribution of microspheres

图 5

Fig. 5

图 5 差示量热扫描示意图 Fig.5 Differential scanning calorimetry curve a,b,c分别为空白聚乳酸微球、空白聚乳酸微球与原药混合物、多杀菌素·甲维盐微球 a,b,c represented blank PLA microspheres,mixture of blank PLA microspheres and pesticides technical,microspheres containing spinosad and emamectin benzoate,respectively.

表 3(Table 3)

表 3 预测值及实测值 Table 3 Predicted and observed values 考察变量 Variables 包封率/% Entrapment rate 平均粒径/μm Mean diameter 跨距 Span 5 d释放量/% Release rate of 5 days 总评“归一值” OD 预测值 Predicted values 82.28 7 1.22 50.3 0.681 1 实测值 Observed values 84.49 7.19 1.13 52.9 0.630 8 偏差/% Deviation 2.2 4.4 -7.05 5.26 -5.03

表 3 预测值及实测值 Table 3 Predicted and observed values

本研究考察了聚乳酸质量浓度、理论载药量及搅拌速率3个因素对微球理化性质的影响。研究发现，随着聚乳酸质量浓度的增加，微球粒径、理论载药量及包封率均增加,这与郭瑞峰等^[8]的研究结果符合。当聚乳酸质量浓度增加时，有机相的黏度增大，乳化形成的有机液滴体积增大，导致固化形成的微球粒径变大；同时，有机液滴增大，会导致有机相与外水相的接触面积减小，致使有效成分流失减小，包封率增大。

本研究表明，随着理论载药量的增大，微球的包封率及5 d 释放率均呈现增大的趋势。原因可能是随着理论载药量的升高，体系中农药的有效成分总量增加，随之流失于外水相的农药占总量的相对比例较小，因而包封率升高；同时，微球理论载药量越高，聚合物骨架材料在处方中所占的比例越小，微球分解时间变短，释药速度加快^[35]。

本研究表明，随着搅拌速率增大，微球的粒径、包封率及5 d 释放率均逐渐增大，只有微球跨距呈现减小的趋势。这是因为较快的搅拌速率可加快有机溶剂的蒸发速度，微球形成过程缩短，微球的包封率提高^{[36, 37]}；有机溶剂蒸发速度加快还会导致聚合物固化剧烈，乳滴聚结的机率增加，导致微球粒径增大^[38]；此外，聚合物固化过于激烈，不利于农药包埋，微球控释能力下降，突释现象严重^{[35, 36]}。

吴伟等^[32]的研究表明，提高药物微球的理论载药量可使微球各指标的总评“归一值”增大，聚合物质量浓度对总评“归一值”的影响不明显。本研究中，提高理论载药量，减小聚乳酸质量浓度可使总评“归一值”增大；而搅拌速率对总评“归一值”的影响不明显，其原因可能是各指标之间的作用相互抵消了。

本研究结果表明，微球的包封率、粒径、跨距、5 d 释放率等指标最优条件各不相同，各指标之间也相互影响，因此在配方筛选过程中应考虑各指标的综合效应。本研究应用总评“归一值”法，较直观地反映了微球载药量、包封率、平均粒径、跨距及5 d释放率等指标的综合效应。经中心多点等距设计优化预测，筛选出了各项指标均较为适宜的农药微球制备配方。经测定，真实值与预测值偏差较小，模型准确度较好。表明采用中心多点等距设计结合总评“归一值”法，能筛选并优化得到性能较佳的农药微球制备配方，这也为其他类型农药制剂配方的筛选与优化提供了新的思路，具有较好的推广前景。