草甘膦是一种非选择性、内吸传导型、广谱、灭生性除草剂^[1]，其作用机制是抑制芳氨酸(苯丙氨酸、色氨酸与酪氨酸)的生物合成，导致包括蛋白质合成及次生产物在内的若干代谢反应失调及莽草酸合成途径受阻，其作用靶点有：质体EPSP合成酶、胞质EPSP合成酶以及胞质3-脱氧-D-阿拉伯-庚酮-7-磷酸合成酶^[2]。草甘膦经植物角质膜和气孔吸收后，可通过共质体传导，积累于植物地上部分的分生组织中，再被转化为水溶性盐，随光合产物从韧皮部输导至生长旺盛的部位。其可以杀死包括根在内的整个植株，从而预防由根引起的再生，也可在同一植株的不同分蘖间进行传导，杀死未接触到药剂的分蘖或分枝，从而起到斩草除根和防止杂草复活的效果^[3]。草甘膦在土壤中易被微生物降解为水、无机磷酸盐和氨等，不会影响土壤结构及地表水，对环境影响甚微^[4]，因此是一种相对安全的除草剂。

实际生产中为节约劳动成本，常将叶面微肥与草甘膦混用喷施抗草甘膦的转基因作物田，以期在杀灭杂草的同时还能给作物提供叶面营养。但叶面肥中的金属离子(如Mn²⁺ 等)对草甘膦的除草作用会表现出拮抗效应，使得其除草效果大大降低。Mark等^{[5, 6]}研究发现，Mn-EAA(乙胺醋酸螯合锰)、MnSO₄(硫酸锰)与Mn-LS(木质素磺酸锰)3种锰肥对草甘膦均有较明显的拮抗作用，而Mn-EDTA(乙二胺四乙酸螯合锰)对草甘膦的除草效果则无明显影响。与其他状态的锰元素相比，游离态Mn²⁺的拮抗作用最强^[7]，其可明显减轻草甘膦对植株高度的抑制，缓解植株萎蔫。赤霉素(GA\-3)是一种重要的植物激素，对种子萌发、节间伸长以及果实发育均具有明显的促进效应，但会降低植物对逆境的抵御能力^[8]。本研究采用化学调控的方法，测试了赤霉素在缓解Mn²⁺对草甘膦拮抗效应中的作用，以期有效解决叶面微肥和草甘膦混用中的拮抗效应问题。

1 材料与方法 1.1 药剂及杂草

41%草甘膦异丙胺盐水剂(glyphosate isopropylamine salt，AS；其中草甘膦质量分数为30.4%) (美国孟山都公司)；莽草酸(shikimate) 标准品( 纯度＞99.0%，Sigma公司)；90%赤霉素(GA\-3)原药(江苏丰源生物工程有限公司)，试验时用乙醇溶解，现配现用。其余试剂均为国产分析纯。

高羊茅Festuca elata品种为爱瑞3号(Arid3)(购于江苏省农业科学院)。

试验在南京农业大学实验基地温室进行，昼夜温度为28 ℃/19 ℃，相对湿度80%。

高羊茅种子用1.0%的次氯酸钠消毒10 min，漂洗后播种于细黄沙中，每盆约300株。置于温室中培养，待其生长至约5 cm高时开始浇施霍格兰氏(Hoagland)营养液(含四水硝酸钙 945 mg/L、硝酸钾 506 mg/L、硝酸铵 80 mg/L、磷酸二氢钾 136 mg/L、硫酸镁 493 mg/L、铁盐溶液 2.5 mL、微量元素液 5 mL、七水硫酸亚铁 2.78 g、乙二胺四乙酸二钠3.73 g、蒸馏水 500 mL)，每周施营养液2次至约15 cm高时，选择长势一致的健康植株供试。

采用叶面喷施法。以去离子水为对照，分别采用有效成分质量浓度为1 440 mg/L的草甘膦、硫酸锰(Mn²⁺质量分数为0.01%)以及质量浓度分别为30和50 mg/L的赤霉素混合喷施，至叶片上均匀附着细密小水珠且不聚集下滴为宜。于喷药后当天开始，每天取样1次，直至第6天，分别测定高羊茅干草和鲜草质量以及叶片中叶绿素、丙二醛(MDA)和莽草酸含量等生理生化指标的变化。

取处理后的高羊茅植株，洗去细沙，将根冲洗干净后用精度为0.000 1 g的电子天平称量其鲜质量。 每处理重复 3次，每重复20株，取平均值。

采用丙酮-乙醇混合液浸提法^[9]进行。取0.1 g新鲜试样于试管中，加入10 mL V(丙酮)∶V(乙醇)=1∶1的混合溶液，密封，置于黑暗处6～8 h，分别测定波长663和665 nm处的吸光度值(OD₆₆₃和OD₆₆₅)，每处理重复3次，按Arnon公式^[10]计算叶绿素含量。

参照赵世杰等所用的硫代巴比妥酸比色法^[11]。取高羊茅叶片，剪碎、混匀后每份称取0.5 g，加入少量石英砂和5 mL 5%的三氯乙酸，研磨至匀浆。匀浆液于4 000 r/min离心10 min，上清液即为丙二醛提取液。取2 mL上清液，以2 mL蒸馏水为对照，分别加入0.67%的硫代巴比妥酸溶液，混匀，置于沸水浴中反应15 min，迅速冷却并离心。取上清液，分别测定OD_450、OD₅₃₂和OD₆₀₀值。每处理重复3次。

参照Gaitonde 等^[12]和娄远来等^[13]的方法。取高羊茅叶片，加液氮研磨，加入0.25 mol/L盐酸继续研磨5 min，于 20 000 r/min 离心15 min。取200 μL上清液，加入2.0 mL、1%的过碘酸溶液，3 h 后再加入2.0 mL、1.0 mol/L 的氢氧化钠溶液，混匀后加入1.2 mL、0.1 mol/L 的甘氨酸，静置5 min，测定OD₃₈₀值。将10 mg 莽草酸标准品溶于1.0 mL、0.25 mol/L的盐酸溶液中，分别取0、1.0、2.5、5.0、10.0、12.5 和 25.0 μL，用0.25 mol/L 的盐酸定容至1.0 mL，同法测定OD₃₈₀值，绘制标准曲线。将测得的吸光值代入相应的标准曲线，计算样品提取液中莽草酸的含量。每处理重复3次。

数据用SPSS19.0软件进行单因素方差分析，多重比较采用Duncans法(P≤0.05)。

2 结果与分析 2.1 赤霉素缓解Mn²⁺对草甘膦的拮抗作用

由表 1可看出：从处理后第6天开始，与清水对照相比，草甘膦单剂处理组高羊茅的死亡率显著升高，这与草甘膦的除草效果表现一致；而草甘膦+硫酸锰处理组与清水对照差异不显著。赤霉素+草甘膦+硫酸锰混合处理组高羊茅的死亡率与草甘膦单剂处理组接近，明显高于草甘膦+硫酸锰处理组，表明赤霉素具有缓解Mn²⁺对草甘膦拮抗效应的作用。此外，加入50 mg/L赤霉素组高羊茅的死亡率比加入30 mg/L赤霉素组更接近于草甘膦单剂处理，表明50 mg/L赤霉素缓解Mn²⁺对草甘膦拮抗效应的效果更好，可更好地保证草甘膦的除草效果。

表 1(Table 1)

表 1 赤霉素与草甘膦及硫酸锰协同处理对高羊茅死亡率的影响Table 1 Effect of GA-3 and glyphosate and MnSO4 on plant mortality of Festuca elata 处理﹡ Treament﹡ 死亡率 Mortality/% 3 d 6 d 9 d 12 d H2O 0.0±0.0 a 0.0±0.0 a 0.0±0.0 a 0.0±0.0 a G 0.0±0.0 a 9.0±0.6 b 48.3±6.0 bc 95.3±2.7 c G+Mn 0.0±0.0 a 0.0±0.0 a 3.7±0.8 a 9.3±0.3 b G+Mn+GA3(50) 0.0±0.0 a 8.0±0.6 c 53.6±3.5 c 96.6±0.7 c G+Mn+GA3(30) 0.0±0.0 a 6.0±0.4 c 41.3±3.3 b 94.6±0.8 c *G: 草甘膦 glyphosate，1 440 mg/L；Mn: MnSO4(0.01%Mn2+)；GA3(30): 30 mg/L GA-3; GA3(50): 50 mg/L GA-3。 同列数据后不同字母表示在0.05水平差异显著。Different letters indicate significant difference at 0.05 level.

表 1 赤霉素与草甘膦及硫酸锰协同处理对高羊茅死亡率的影响Table 1 Effect of GA-3 and glyphosate and MnSO4 on plant mortality of Festuca elata

由图 1可看出：与清水对照相比，草甘膦处理显著抑制了高羊茅鲜质量的增加；而草甘膦+硫酸锰处理组高羊茅鲜质量在处理后0～5 d持续显著增加，第6天才出现下降趋势；赤霉素+草甘膦+硫酸锰处理组高羊茅鲜质量与清水对照相比受到了明显的抑制，与草甘膦单剂处理组的被抑制程度相近。表明赤霉素与草甘膦和硫酸锰混用，在一定程度上缓解了Mn²⁺对草甘膦的拮抗效应，保证了草甘膦药效的发挥。

图 1

Fig. 1

G: 1 440 mg/L草甘膦(glyphosate); Mn: MnSO4(Mn2+0.01%)；GA3(30): 30 mg/L GA\-3；GA3(50): 50 mg/L GA\-3 注：不同字母表示在P≤0.05水平差异显著。 Note: Different letters indicate significant difference at 0.05 level.图 1 赤霉素与草甘膦和Mn2+协同处理对高羊茅鲜质量的影响Fig. 1 Effect of GA\-3 and glyphosate and manganese on fresh weight of Festuca elata

2.2.2 赤霉素与草甘膦和硫酸锰协同处理对叶绿素含量的影响

由图 2可看出：与清水对照相比，自处理后第2天开始，赤霉素+草甘膦+硫酸锰处理组及草甘膦单剂处理组高羊茅体内叶绿素含量均开始下降，而草甘膦+硫酸锰处理组在第4天后才出现下降趋势，且下降较缓慢。6 d后，赤霉素+草甘膦+硫酸锰处理组叶绿素含量均显著低于草甘膦+硫酸锰处理组，分别降低了约42.7%(加入50 mg/L 赤霉素的处理)和11.7%(加入30 mg/L 赤霉素的处理)。

图 2

Fig. 2

G: 1 440 mg/L草甘膦(glyphosate); Mn: MnSO4 (Mn2+0.01%)；GA3(30): 30 mg/L GA\-3；GA3(50): 50 mg/L GA\-3 注：不同字母表示在P≤0.05水平差异显著。 Note: Different letters indicate significant difference at 0.05 level.图 2 赤霉素与草甘膦和Mn2+协同处理对高羊茅体内叶绿素含量的影响Fig. 2 Effect of GA\-3 and glyphosate and manganese on chlorophyll cotent of Festuca elata

2.2.3 赤霉素与草甘膦和硫酸锰协同处理对莽草酸含量的影响

由图 3可知：与清水对照相比，赤霉素+草甘膦+硫酸锰协同处理可使高羊茅体内莽草酸含量显著升高；从处理后第3天开始，赤霉素+草甘膦+硫酸锰处理组莽草酸含量显著高于草甘膦+硫酸锰处理组，处理6 d后，分别提高约49.8%(加入50 mg/L赤霉素)和28.8%(加入30 mg/L赤霉素)；其中，加入50 mg/L赤霉素组与草甘膦单剂处理组的莽草酸含量及上升趋势更为接近。这可能是由于赤霉素增强了未被螯合的草甘膦的药效，从而在某种程度上缓解了Mn²⁺与草甘膦间的拮抗作用，保证了草甘膦药效的发挥，阻断了莽草酸到其他芳香族氨基酸的合成途径，从而积累了更多的莽草酸。

图 3

Fig. 3

G: 1 440 mg/L草甘膦(glyphosate); Mn: MnSO4(Mn2+0.01%)；GA3(30): 30 mg/L GA\-3；GA3(50): 50 mg/L GA\-3 注：不同字母表示在P≤0.05水平差异显著。 Note: Different letters indicate significant difference at 0.05 level.图 3 赤霉素与草甘膦和Mn2+协同处理对高羊茅体内莽草酸含量的影响Fig. 3 Effect of GA\-3 and glyphosate and manganese on shikimate acid content of Festuca elata

由图 4可看出，与清水对照相比，处理2 d后，赤霉素+草甘膦+硫酸锰协同处理组高羊茅体内丙二醛含量显著升高，且比草甘膦+硫酸锰处理组分别提高了54.1%(加入50 mg/L赤霉素)和52.9%(加入30 mg/L赤霉素)，与草甘膦单剂处理组基本一致。

图 4

Fig. 4

G: 1 440 mg/L草甘膦(glyphosate); Mn: MnSO4(Mn2+0.01%)；GA3(30): 30 mg/L GA\-3；GA3(50): 50 mg/L GA\-3 注：不同字母表示在P≤0.05水平差异显著。 Note: Different letters indicate significant difference at 0.05 level.图 4 赤霉素与草甘膦和Mn2+协同处理对高羊茅体内丙二醛含量的影响Fig. 4 Effect of GA\-3 and glyphosate and manganese on MDA content of Festuca elata

据文献报道，在草甘膦与金属微肥混合喷施过程中，金属离子会与草甘膦发生拮抗作用，从而影响草甘膦对植物的毒力^[14]。 有报道指出，草甘膦与其他氨基酸类似，可作为1种螯合剂与二价或三价金属阳离子形成稳定的复合物^[15]。同时，研究表明，硬水中的金属阳离子Ca²⁺、Mg²⁺、Fe²⁺等可通过与草甘膦结合，形成不易被植物吸收的草甘膦-金属阳离子复合物，从而降低草甘膦的药效^[5]。硫酸锰为实际生产中常用的锰肥，其在溶液中可解离为Mn²⁺和SO₄^2－，其Mn²⁺同样可与草甘膦螯合形成不易被植物吸收的草甘膦-Mn²⁺盐，从而影响草甘膦的药效^[16]。Mn²⁺对草甘膦的拮抗作用也可能是由于Mn²⁺与草甘膦同时进入植物组织，最终在细胞质中发生螯合，进而影响草甘膦药效的发挥以及其在植物体内的运输^[17]。此外，Mn²⁺在对草甘膦产生拮抗作用的同时还降低了植物体对锰肥的吸收^[17]。

实际生产中有时会在草甘膦药液中加入硫酸铵(AMS)，其目的就是减少金属阳离子-草甘膦复合物的生成^[18]。Thelen等^[16]发现，在草甘膦水溶液中加入AMS后，Ca²⁺会与SO₄^2－结合形成难溶的CaSO₄，而NH₄⁺则与草甘膦形成更易被植物体吸收的草甘膦-NH₄盐形式，因而阻止了Ca²⁺与草甘膦的螯合。目前已有关于草甘膦和助剂混用的研究报道，例如向草甘膦药液中添加有机硅和丙三醇等助剂以改变药液的表面张力和黏度，可提高其药效 ^[19]。但尚未见关于通过添加助剂或植物生长调节剂来缓解金属阳离子对草甘膦拮抗效应的报道。

本研究以高羊茅为试材，将赤霉素与草甘膦和硫酸锰混配使用，以期缓解或消除Mn²⁺对草甘膦的拮抗作用。结果发现，与草甘膦+硫酸锰的处理相比，赤霉素+草甘膦+硫酸锰处理组高羊茅株高受到明显抑制，更早地表现出叶片发黄、枯萎的现象，其叶绿素含量明显下降，叶片中莽草酸和丙二醛含量显著升高。该结果与草甘膦单剂处理组相似，表明赤霉素可显著缓解Mn²⁺对草甘膦的拮抗效应。有研究表明，赤霉素具有促进幼苗生长的作用，包括促进细胞生长和分裂，特别是增强细胞壁的伸展性，促进细胞的纵向生长^[20]，从而促进节间和茎的伸长，使植株增高^[21]。但也因而会降低幼苗的抗逆性，当植物受到胁迫时，极易表现出叶片发黄、干枯的现象。李小艳等^[22]研究发现，赤霉素和草甘膦混用可减少农药的用量，加速植物幼苗死亡。由此推测，赤霉素缓解Mn²⁺对草甘膦的拮抗效应的原因之一，可能是通过上述机制增强了Mn²⁺和草甘膦混合液中草甘膦对植物的毒力。

由于添加赤霉素有可能会促使某些杂草的快速生长或促进其细胞分裂，导致杂草再生、返绿，因此在实际生产中应密切关注。但与添加助剂相比，赤霉素的优点在于其生物活性高、见效快、使用剂量低、与环境相容性好、抗药性风险相对较低、成本低廉，因此将赤霉素用于缓解Mn²⁺对草甘膦的拮抗效应具有重要的实际意义，有望解决金属微肥和草甘膦同时施用时药效降低的问题，减少劳动时间及降低劳动成本。

本研究仅从生理水平证明了赤霉素具有缓解Mn²⁺对草甘膦拮抗效应的作用，后续还应从分子水平入手，对其可能的作用机制进行深入探究。