可湿性粉剂(WP)是微生物杀菌剂的主要剂型之一，润湿性(润湿时间)和悬浮率是评价农药可湿性粉剂质量的重要指标，直接影响着田间实际应用时药液的混合便利性和均匀性。在可湿性粉剂加工过程中，粉碎和添加助剂是提高润湿性和悬浮率最常用的方法。已有研究报道，通过气流粉碎和添加表面活性剂能提高多粘类芽孢杆菌可湿性粉剂的悬浮率和润湿性^[1]，而加入吐温-20可明显缩短苏云金芽孢杆菌可湿性粉剂的润湿时间^[2]。但由于粉碎是高耗能过程，与单纯添加助剂相比其增加了生产成本。因此，筛选合适的助剂是农药可湿性粉剂开发过程中重要的环节。目前针对农药可湿性粉剂配方的研究多为宏观的、经验式的筛选^[3]，由于缺乏系统的理论指导和科学的选择方法，导致其在实际生产应用中易出现悬浮率低、润湿性差和pH值较高等问题。混料设计(mixture design)是较为合适的研究固体制剂中各成分最佳比例的方法^[4]，已广泛用于食品^{[5, 6, 7]}、医药^{[8, 9, 10]}及化学材料^{[11, 12, 13]}等的配方优化研究，但将该方法用于农药可湿性粉剂配方优化的研究较少。刘振华^[14]曾利用混料设计方法对多粘类芽孢杆菌可湿性粉剂配方进行过初步优化。

笔者所在实验室与上海泽元海洋生物技术有限公司合作，成功创制出了首个海洋微生物农药——以海洋芽孢杆菌B-9987为活性成分、浓度为1.0×10⁹ CFU/g的海洋芽孢杆菌可湿性粉剂(WP)^[14]。田间试验结果表明，其对番茄青枯病、甜瓜枯萎病和辣椒疫病等土传病害均有较好的防治效果^[15]。但是，利用海洋芽孢杆菌发酵液与载体直接混合、经喷雾干燥后制备的可湿性粉剂，其悬浮率和润湿性均达不到农药可湿性粉剂标准(悬浮率≥70%，润湿时间≤120 s)^[14]的要求，而且制剂的pH值较高(≥8.70)。此外，由于海洋芽孢杆菌可湿性粉剂属活体微生物农药，与传统化学农药的经验加工方式也存在较大差异。这些因素在很大程度上限制了海洋芽孢杆菌可湿性粉剂的推广使用。

本研究首先通过助剂筛选，选取与海洋芽孢杆菌具有较高生物相容性并能显著提高制剂悬浮率和湿润性的助剂，然后利用混料设计确定最佳的固体介质配方组合，并就该配方进行了验证试验，得到了悬浮率、润湿性及pH值符合农药可湿性粉剂标准要求的海洋芽孢杆菌可湿性粉剂。旨在为海洋芽孢杆菌可湿性粉剂配方的进一步优化奠定基础，同时对其他可湿性粉剂的配方优化提供参考。 1 材料与方法 1.1 供试材料

菌株：海洋芽孢杆菌B-9987(简称B-9987，由华东理工大学海洋生化工程研究室保藏)。

培养基：种子及发酵培养基均参考文献方法^[16]配制。

发酵液：芽胞率≥95.00%(由华东理工大学海洋生化工程研究室制备)。

载体：轻质碳酸钙(粒径10 μm，1 250目)，高岭土(粒径10 μm，1 250目)。

助剂：烷基萘磺酸缩聚物钠盐(Morwet D-425)(Akzonobel公司)，丁基萘磺酸钠(BX)及木质素磺酸钠(新沂市飞皇化工有限公司)，亚甲基二萘磺酸钠(NNO)及十二烷基硫酸钠(SDS)(上虞浙创化工有限公司)。 1.2 主要仪器

SY6000喷雾干燥仪(水分蒸发量1 kg/h，上海世远生物设备有限公司)；PYX-DHS-40X50-S 隔水式电热恒温培养箱(上海跃进医疗器械厂)；Delta320酸度计(上海梅特勒-托利多有限公司)；恒温磁力搅拌器(上海司乐仪器有限公司)等。 1.3 试验方法 1.3.1 可湿性粉剂性能指标测定

按照国家相关标准分别测定B-9987 WP的pH值^[17]、悬浮率^[18]及润湿性(润湿时间)^[19]。 1.3.2 助剂与海洋芽孢杆菌的生物相容性考察

采用平板培养法^[20]，将供试助剂用纯水配成1.00 g/L的母液，经0.22 μm滤膜过滤后，分别加入到50 ℃左右的液态培养基中，冷却后制得固体平板，其中各助剂的质量浓度分别为0、0.02、0.05和0.1 g/L。接入同一批次制备的B-9987 WP样品，培养 24 h后考察其菌落数。试验重复3次。根据(1)式计算菌株存活率(S_C)。

将木质素磺酸钠和SDS分别以质量分数为5%、10%和15%的比例与轻质碳酸钙载体混合，用玻璃棒将混合物与B-9987发酵液搅拌均匀，再利用恒温磁力搅拌器搅拌30 min，之后边搅拌边通过喷雾干燥法制得可湿性粉剂。按1.3.1节方法测定悬浮率和润湿时间。 1.3.4 活菌含量测定

采用平板计数法^[21]测定。 1.3.5 混料设计

混料设计试验中，载体与助剂的百分比之和为1，试验的响应值与每种成分的百分比相关，若限定某一因素的比例范围，则这种具有上下限约束条件的混料试验适合采用极端顶点设计法^[22]。由于本试验中助剂的质量分数限定为5%～10%，所以采用极端顶点设计法进行，即根据混料设计方案提供的轻质碳酸钙、高岭土及SDS的质量分数比值将3者混合，参照1.3.3节方法制备可湿性粉剂，分别测定所得制剂的润湿时间、pH值和悬浮率。

采用Minitab 16软件对混料设计试验数据进行分析。其中，某一组分的质量分数比值=该组分质量分数/(轻质碳酸钙质量分数+高岭土质量分数+SDS质量分数)。 2 结果与分析 2.1 助剂与海洋芽孢杆菌的生物相容性

尽管助剂对改善农药可湿性粉剂的悬浮率和润湿性等物理性状很重要^[14]，但对于以活菌为活性成分的微生物农药而言，其首要考虑因素应是助剂与活菌的生物相容性，因为某些助剂可能由于对活菌的抑制作用较大而完全不能使用^{[20, 23, 24, 25]}。笔者在已有研究^[14,26]的基础上，选择目前常用的几种可湿性粉剂助剂：Morwet D-425、BX、NNO、木质素磺酸钠及SDS，考察了不同助剂与海洋芽孢杆菌B-9987的生物相容性。

从图 1中可看出，Morwet D-425与B-9987的生物相容性较差，其明显抑制了B-9987的生长，因此不适于作为B-9987 WP的助剂；同样，随BX及NNO添加浓度的提高，B-9987的存活率均明显下降，也表现为一定的抑制作用；而木质素磺酸钠和SDS与B-9987的生物相容性良好，两者对活菌数影响不大，可作为进一步考察的对象。

图 1

Fig. 1

图 1 助剂对海洋芽孢杆菌可湿性粉剂中活菌存活率的影响 Fig. 1 Effects of additives on viable survival in Bacillus marinus B-9987 WP 注：图中数据为平均值±标准差(n=3)。Note：The data in the figure as mean±SD(n=3).

表 1结果表明：虽然木质素磺酸钠也能显著提高可湿性粉剂的悬浮率，降低制剂的润湿时间，但与SDS相比，其提高幅度较小。当助剂质量分数在0～10%范围内时，随着SDS添加量的增加，其提高制剂悬浮率及润湿性的效果更为明显；但当其质量分数为5%时，制剂悬浮率为69.86%，略低于可湿性粉剂标准(悬浮率≥70%)的要求，表明其最低添加量应为5%；而当其添加量超过10%后，制剂悬浮率再无明显增加。因此，可选择SDS作为B-9987 WP的助剂，且其用量在5%～10%之间为宜。 2.3 通过混料设计试验优化后的制剂配方

选择pH值较低的高岭土及悬浮率较好的轻质碳酸钙为载体，以可提高润湿性和悬浮率的SDS为助剂进行了混料设计试验。根据Minitab软件的极端顶点设计方法，混料设计试验方案及所得各可湿性粉剂的润湿时间、pH值和悬浮率见表 2。利用Minitab软件等值线图对表 2中的结果进行分析，以确定最优配方。

表 1(Table 1)

表 1 木质素磺酸钠和十二烷基硫酸钠对 海洋芽孢杆菌可湿性粉剂性能的影响 Table 1 Effects of sodium ligninsulfonate and SDS on B-9987 WP 助剂 Additives 质量分数 Mass fraction/% 悬浮率 Suspensi- bility/% 润湿时间 Wetting time/s CK 0 31.87±0.05 e 167.00±5.00 a 木质素磺酸钠 5 56.26±2.26 d 98.00±4.00 b Sodium 10 58.15±0.29 c 96.00±4.00 b ligninsulfonate 15 58.19±1.53 c 96.00±3.00 b 十二烷基硫酸钠 5 69.86±2.09 b 96.00±5.00 b SDS 10 77.62±1.48 a 85.00±3.00 c 15 77.11±1.22 a 84.00±5.00 c 注：表中数据为平均值±标准差(n=3),同列数据后不同小写字母表示差异显著(P＜0.05) Note：The data in the table as mean±SD(n=3)，the different lowercase letters in the same coulumn mean significant difference(P＜0.05).

表 1 木质素磺酸钠和十二烷基硫酸钠对 海洋芽孢杆菌可湿性粉剂性能的影响 Table 1 Effects of sodium ligninsulfonate and SDS on B-9987 WP

表 2(Table 2)

表 2 混料设计试验方案及响应值 Table 2 program and response value of mixture experimental design 试验序号 Number 十二烷基硫酸钠 质量分数比值 Ratio of SDS 轻质碳酸钙 质量分数比值 Ratio of LCC 高岭土 质量分数比值 Ratio of kaolinite 润湿时间 Wetting time/s pH值pH value 悬浮率 Suspensibility/% 1 0.100 0 0.900 00 0.000 00 86.00±4.00 8.68±0.05 79.66±2.04 2 0.087 5 0.231 25 0.681 25 156.00±2.00 7.98±0.03 65.94±1.66 3 0.087 5 0.681 25 0.231 25 127.00±3.00 8.45±0.02 74.79±1.73 4 0.075 0 0.462 50 0.462 50 107.00±5.00 8.21±0.03 70.11±0.88 5 0.062 5 0.231 25 0.706 25 202.00±5.00 7.88±0.06 65.40±1.03 6 0.062 5 0.706 25 0.231 25 102.00±3.00 8.51±0.04 73.54±1.06 7 0.050 0 0.950 00 0.000 00 100.00±6.00 8.64±0.02 72.80±1.02 8 0.050 0 0.000 00 0.950 00 210.00±5.00 7.01±0.03 60.01±2.11 9 0.100 0 0.000 00 0.900 00 188.00±5.00 7.16±0.02 61.91±1.25 注：表中数据为平均值±标准差(n=3)。Note：The data in the table as mean±SD(n=3).

表 2 混料设计试验方案及响应值 Table 2 program and response value of mixture experimental design

由图 2中可看出，只有当载体轻质碳酸钙的质量分数在85%以上(区域4)时，才能保证制剂的润湿时间在120 s以内；同时只有提高SDS的质量分数到9.5%以上时，润湿时间才有可能低于90 s(区域5)。表明以轻质碳酸钙为载体有利于制剂的快速润湿，但需在其含量较高的情况下同时提高SDS的含量，才可明显改善制剂的润湿性。

对试验数据进行混料回归，得回归模型为：Y₁=95 020A+658B+806C-1 111 159AB-1 111 543AC+259BC(R²=0.877 4)。方程中，A=SDS质量分数比值，B=轻质碳酸钙质量分数比值，C=高岭土质量分数比值，Y₁为制剂的润湿时间(s)。所得回归模型为B-9987 WP润湿时间与3种助剂和载体组分的经验方程，R²为0.877 4，表明该回归模型能较好地预测B-9987 WP的润湿时间。

图 2

Fig. 2

图 2 轻质碳酸钙与十二烷基硫酸钠质量分数 比值对润湿时间的影响 Fig. 2 Effects of the ratio of LCC and SDS on wetting time

从图 3中可看出，在确定载体轻质碳酸钙含量的情况下，提高SDS的含量对pH值影响不大，表明SDS对制剂pH值影响不显著；而随着轻质碳酸钙含量的增加，pH值明显升高，表明载体中高岭土和轻质碳酸钙的比例对制剂pH值影响较大。

其混料回归模型为：Y₂=209.5A+10.1B+8.0C-237.3AB-237.2AC+2.2BC(R²=0.995 4)。方程中Y₂代表可湿性粉剂的pH值。所得回归模型为B-9987 WP pH值与3种助剂和载体组分的经验方程，R²为 0.995 4，表明该回归模型能很好地预测B-9987 WP的pH值。

图 3

Fig. 3

图 3 轻质碳酸钙与十二烷基硫酸钠 质量分数比值对pH值的影响 Fig. 3 Effects of the ratio of LCC and SDS on pH value

从图 4中可看出：载体轻质碳酸钙含量对B-9987 WP悬浮率影响最为明显，当其质量分数在55%以上时，制剂悬浮率可达到70%以上(区域3)；但提高高岭土的比例则会降低制剂的悬浮率(区域2和区域1)；当轻质碳酸钙质量分数超过80%，同时提高助剂SDS质量分数至9%以上，则制剂的悬浮率可达75%以上(区域4)。表明轻质碳酸钙有利于制剂悬浮率的提高，并且只有在轻质碳酸钙含量较高的情况下，再增大助剂含量才能进一步提高制剂的悬浮率。

其混料回归模型为：Y₃=70 389A+484B+475C-82 063AB-82 201AC+249BC(R²=0.998 1)。方程中Y₃代表制剂的悬浮率(%)。该回归模型为B-9987 WP悬浮率与3种助剂和载体组分的经验方程，R²为0.998 1，表明该回归模型能很好地预测B-9987 WP的悬浮率。

图 4

Fig. 4

图 4 轻质碳酸钙与十二烷基硫酸钠 质量分数比值对悬浮率的影响 Fig. 4 Effects of the ratio of LCC and SDS on suspensibility

利用Minitab软件中的响应优化设计，选择期望润湿时间为90.00 s，pH值为8.50，悬浮率为75.00%，经软件分析得到3个响应因子的最佳配比分别为：助剂SDS 9.54%，载体轻质碳酸钙83.74%、高岭土6.72%，预测悬浮率为75.15%，pH值为8.62，润湿时间为89.40 s。

该配方中3个指标的复合随意性达95.73%，表明目的期望可靠，达到预测指标的可能性极大。 2.3.3 验证试验

对优化后配方的验证结果见表 3。从中可知，预测值与实测值较接近，表明优化后的配方比较可靠，其润湿时间和悬浮率均符合农药可湿性粉剂质量标准要求，pH值也有小幅降低。因此，该配方可作为B-9987 WP的固体介质使用。

表 3(Table 3)

表 3 对优化后配方的验证结果 Table 3 Experimental verification of the selected formulation 可湿性粉剂性能指标 Function index of WP 悬浮率 Suspensibility/% pH 润湿时间 Wetting time/s 响应预测值 Predicted value of response 75.15 8.62 89.40 验证试验值 Experimental value of verification 73.13±2.12 8.33±0.03 100.00±4.00 注：表中验证试验数据为平均值±标准差(n=3)。Note：The verifying data in the table as mean±SD(n=3).

表 3 对优化后配方的验证结果 Table 3 Experimental verification of the selected formulation

3 结论与讨论

通过助剂筛选及混料设计试验方法，对海洋芽孢杆菌B-9987可湿性粉剂的配方进行了优化。优化后制剂的悬浮率(73.13%)和润湿性(润湿时间，100.00 s)比原本单纯添加轻质碳酸钙的制剂(表 1中CK，悬浮率31.87%，润湿时间167.00 s)有了大幅度提高，pH值低于8.70。优化后制剂的润湿性和悬浮率无需经过高耗能的气流粉碎过程即可达到农药可湿性粉剂标准的要求，因而可明显降低生产成本，为该制剂的进一步推广应用奠定了良好的基础。

目前尚未见有关微生物农药可湿性粉剂中助剂与生防细菌生物相容性筛选的研究报道，仅有部分涉及真菌与助剂生物相容性^{[20, 23, 24, 25]}的研究，发现不同生防真菌与不同助剂之间生物相容性差异很大。笔者采用平板培养法，系统研究了助剂与海洋芽孢杆菌的生物相容性，结果表明，生防细菌与不同助剂之间生物相容性差异也很大。

混料设计是一种统计优化方法，目前尚未见采用统计优化的方法研究可湿性粉剂配方的报道，只有少数报道将该方法应用于可湿性粉剂助剂筛选以及复配助剂的研究^[23,27]。本研究通过混料设计试验，对B-9987可湿性粉剂的配方进行了优化。结果表明，利用统计优化方法可以对可湿性粉剂的配方进行系统研究，改变了传统的、比较粗放的可湿性粉剂配方优化方法。根据优化后的配方进行小试生产，所制备的可湿性粉剂的悬浮率和润湿性均可达到相关质量标准要求，其pH值符合企业标准要求。但目前尚未对该优化后的配方进行规模化放大。由于小试设备和中试设备的作用方式不同，通过 2种 方式制备的可湿性粉剂的性能可能存在较大差异。因此本研究中优化后的配方还需经过规模化放大试验进行验证，再根据放大试验过程中存在的问题进一步优化。此外，后续还可考虑就多种助剂复配使用的情况进一步展开研究。