农药学学报  2014, Vol.16 Issue (1): 8-13   PDF    
引用本文
谭超, 张乃明. 利用新鲜蓝藻藻泥发酵制备苏云金芽胞杆菌杀虫剂[J]. 农药学学报, 2014,16(1): 41-48  
TAN Chao, ZHANG Naiming. Fermentation of Bacillus thuringiensis based biopesticide using mud of blue-green algae[J]. Chinese Journal of Animal Nutrition, 2014,16(1): 41-48  
利用新鲜蓝藻藻泥发酵制备苏云金芽胞杆菌杀虫剂
谭超a, 张乃明b    
a. 云南农业大学 植物保护学院, 昆明 650201;
b. 云南农业大学 资源环境学院, 昆明 650201
收稿日期：2013-9-23;修回日期: 2013-12-19 .
基金项目：云南省社会发展科技计划项目（2012CA017）.
作者简介：谭超，男，博士研究生，E-mail：tctj_1212@163.com
通讯作者：张乃明，男，博士，教授，主要从事农药与环境保护研究，E-mail：zhangnaiming@sina.com
摘要：富营养化湖泊中蓝藻爆发已成突出的环境问题。以云南昆明滇池蓝藻新鲜藻泥为培养基，通过接种Bt菌种，测定发酵过程中Bt的活菌数及芽胞数，观察其生长过程中形态变化，同时测定杀虫晶体蛋白产量及杀虫毒力效价，并与常规LB培养基比较，探究了利用蓝藻藻泥培养基接种苏云金芽胞杆菌（Bt GIM1.32）制备生物源杀虫剂的可行性。结果表明：Bt GIM1.32菌种在新鲜蓝藻培养基中能正常生长并完成芽胞和伴胞晶体的合成；当蓝藻含固率为3%、pH 7、接种活化10 h处于对数生长期的菌种、接种量为2%、培养温度为30 ℃时，灭菌后直接接种Bt GIM1.32菌株，发酵48 h左右其活菌数可达到相对稳定值（6.79×108 CFU/mL），54 h左右芽胞数达到相对稳定值（7.01×108 CFU/mL）；其130 ku晶体蛋白的质量浓度为4.81 mg/mL，对3龄小菜蛾的致死中浓度（LC50）为0.180 μL/mL，毒力效价为1 600.00 IU/μL；发酵性能较常规LB培养基优良。研究表明，蓝藻作为发酵生产生物源农药Bt的培养基具有很好的开发潜力和应用前景。
关键词： 蓝藻     苏云金芽胞杆菌     生物源杀虫剂    
Fermentation of Bacillus thuringiensis based biopesticide using mud of blue-green algae
TAN Chaoa, ZHANG Naimingb     
a.College of Plant Protection,
b.College of Resources and Environments, Yunnan Agricultural University, Kunming 650201, China
Abstract: Blooms of blue-green algae in eutrophication lake has been one of the major environmental problems in recent years. Bioconversion of blue-green algae to biopesticide by Bacillus thuringiensis GIM1.32 was studied using the mud of blue-green algae in Dianchi lake of Yunnan province as culture medium. During fermentation, the available cells and spores, as well as the morphology and metabolic characteristics of B.thuringiensis GIM1.32 were measured. Furthermore, the production of insecticidal crystal protein and its toxicity titer of B.thuringiensis GIM1.32 in the mud of blue-green algae were also investigated, comparing with that in the conventional LB culture medium. The results showed that the mud of blue-green algae was a suitable medium for B.thuringiensis GIM1.32, in which the growth, spore formation and spore crystal synthesis of B.thuringiensis GIM1.32 were normal. When the mud of blue-green algae (3% solid content and pH of 7) was sterilized and inoculated with pre-cultured (10 h) B.thuringiensis GIM1.32, with inoculation level as 2%, and cultured at 30 ℃, the available B.thuringiensis GIM1.32 reached 6.79×108 CFU/mL and kept relatively stable after 48 h, moreover, the number of spores reached a relatively stable value around 7.01×108 CFU/mL after 54 h. The concentration of 130 ku crystal protein was 4.81 mg/mL, the LC50 value to Plutella xylostella was 0.180 μL/mL, and the toxic titer was 1 600.00 IU/μL. Which were superior to those in the ordinary LB culture medium. The results of present study suggested that blue-green algae has good potential application prospect as medium to produce biopesticide in the future.
Key words: blue-green algae     zBacillus thuringiensis Berliner     biopesticide    

苏云金芽胞杆菌Bacillus thuringiensi Berliner(Bt)是一类革兰氏阳性细菌[1]，在代谢过程中能产生伴胞晶体、α-外毒素和β-外毒素等多种对鳞翅目、膜翅目、双翅目等9个目、500多种害虫有毒杀作用的物质，且对人畜和环境无害[ 2 , 3]，已成为世界上产量最大的生物源杀虫剂，广泛用于农林果蔬害虫的防治[4]。目前Bt的生产主要以液态深层发酵为主[5]，此外还有部分固态发酵[6]，其碳源主要用糖类和玉米淀粉，氮源主要利用有机氮化合物(如鱼粉、豆粕粉、蛋白胨等)，生产成本较高，是目前生物源杀虫剂普及推广的主要限制因素之一[7]，因此如何降低Bt的生产成本是近年来的研究热点。已有研究报道，可利用味精生产废水[ 8 , 9]、废啤酒酵母浸出液[10]、废蜜糖[11]、乳清[12]、污泥[13]等发酵生产Bt，但仍存在原料处理工序繁琐、成本较高、后期处理工艺复杂、产品质量稳定性差等诸多问题。

与此同时，经济快速发展及污染物排放增加导致大量湖泊水库的水体出现了富营养化，夏季蓝藻爆发已成为一大环境公害[14]。对蓝藻的治理目前仍以机械打捞分离为主[15]，打捞出的蓝藻不能直接被家畜食用，也无法直接提取蛋白，堆积在岸边不仅占用土地，其产生的藻毒素、多环芳烃(PAHs)及NH3、H2S等物质还会二次污染环境[16]。如何妥善处理这些藻泥有机废弃物，是湖泊污染治理中迫切需要解决的难题。目前对蓝藻藻泥的处理主要以焚烧发电、转化生产有机肥为主，但受其水分含量过高等因素制约，尚不能满足实际需要[ 17, 18, 19, 20]。而蓝藻中富含大量微生物可利用的碳、氮、磷、钾等营养物质[ 21, 22, 23]，如能利用其作基质生产Bt杀虫剂，不仅能将蓝藻变废为宝，也可有效降低生物源农药Bt的生产成本。
笔者以云南昆明滇池蓝藻新鲜藻泥为培养基，通过接种Bt菌种，测定接种后Bt的活菌数及芽胞数，观察其生长过程中形态变化，同时测定杀虫晶体蛋白产量及杀虫毒力效价，并与常规LB培养基进行对比，探究了利用蓝藻藻泥培养苏云金芽胞杆菌(Bt GIM1.32)制备生物源杀虫剂Bt的可行性。

1 材料与方法
1.1 供试材料及仪器

新鲜蓝藻采自云南省昆明市滇池藻水分离站，微囊藻属占96.5%，鱼腥藻属为1.66%，束丝藻属1.72%，绿藻门2.99%，硅藻门0.51%；苏云金芽胞杆菌B.thuringiensis 菌种由广东省微生物菌种保藏中心提供，菌株标准编号：FSCC(T)115030，GIMCC编号：GIM1.32；小菜蛾Plutella xyslostella由科云生物科技公司提供，取3龄初幼虫供试。

维生素C、干酪素、冻干甘蓝菜叶粉、酵母粉、纤维素粉(CF-11)、琼脂粉、蔗糖、菜籽油、LB肉汤培养基、孔雀石绿、番茄红、香柏油、1.5 mol/L pH 8.8 的三羟甲基氨基甲烷(Tris-HCl)、30%丙烯酰胺单体贮液(Arc-Bis)、10%十二烷基磺酸钠(SDS)、10%过硫酸铵(APS)、四甲基乙二胺(TEMED)及考马斯亮蓝(CBB G-250)均来源于昆明仁科试剂有限公司；甲醛、对羟基苯甲酸甲酯、磷酸二氢钾等试剂均为分析纯；高纯度实验用苏云金芽胞杆菌标准品(16 000 IU/mg)由湖北康欣农用药业有限公司提供。

HITACHI L-8800全自动氨基酸分析仪(日立公司)；CX21FS1C显微镜(奥林巴斯有限公司)； Bio-rad Mini-PROTEAN Tetra Cell-2gel垂直电泳槽；DYY-6D型电泳仪(北京市六一仪器厂)；SW-CJ-1G单人单面水平送风净化工作台(苏州净化设备有限公司)；PGX-260A多段可编程光照培养箱(宁波东南仪器有限公司)；HZQ-Y全温恒温摇床(上海一恒科学仪器有限公司)；PHS-3E 雷磁pH计(上海仪电科学仪器股份有限公司)。

1.2 Bt GIM1.32菌种活化及蓝藻基质理化性质测定

在无菌操作台上，取约1环菌种冻干粉于200 mL LB液体培养基中，于30 ℃±1 ℃、110 r/min 下培养活化10 h。镜检菌种活化至对数生长期，将培养瓶放入2 ℃冰箱冷藏，备用。

总固形物(TS)、挥发性固形物(VSo)及灰分参照文献[24]测定；总碳、氮、磷、钾参照文献[25]测定；采用pH计测定pH值；多糖含量采用蒽酮硫酸比色法[24]于620 nm比色测定，y=5.737 1x-0.006 1(R2=0.999 9)；蛋白质采用考马斯亮蓝G-250比色法[24]于595 nm比色测定，y=7.704 4x+0.001 2(R2=0.993 1)；氨基酸采用全自动氨基酸分析仪测定。

1.3 Bt GIM1.32在不同培养基中的生长情况

于500 mL锥形瓶中加入300 mL LB培养基或蓝藻培养基(含固率3%)并灭菌，每瓶接种6 mL(接种量2%)已活化的Bt GIM1.32，其初始pH为7.0。在30 ℃±1 ℃、110 r/min下培养，每6 h用接种环取1环进行镜检，并取1 mL测定其pH变化、活菌数(VC)及活芽胞数(VS)，连续测定84 h。于48和84 h分别取样100 mL，以备后续测定晶体蛋白含量和杀虫毒力效价。活菌数检测采用生理盐水平板稀释分离法[26]，活芽胞数检测采用显微镜血球计数法[26]。

1.4 不同培养基中Bt晶体蛋白含量SDS-PAGE电泳分析

采用不连续缓冲系统[27]，8%电泳分离胶。称取适量高纯度实验用Bt标样及试样，分别配制成0.5 mg/mL的菌液。电泳条件：恒压50 V，30 min；待试样进入分离胶后，加大电压至120 V，80 min；电泳完毕，用7.5%的乙酸浸泡30 min；考马斯亮蓝CBB G-250染色。采用Bio-Rad Quantity One凝胶成像系统分析软件对凝胶进行定量分析，计算130 ku Bt GIM 1.32杀虫特征蛋白条带含量。

1.5 不同培养基中Bt杀虫毒力效价评定

标准品及饲料按照GB/T 19567.1—2004方法[27]配制。

试样配制：用移液枪分别吸取10、20、40、60和 80 μL含Bt的培养基于容量瓶中，加磷酸缓冲液定容至100 mL，分别配制成0.1、0.2、0.4、0.6和0.8 μL/mL 的供试菌液。

将供试菌液制备为1 cm3的琼脂固体饲料块。随机取已放置饲料的养虫管，每管投入10头小菜蛾3龄初幼虫，每浓度处理4管。塞上棉塞，感染48 h后检查试虫死亡情况，以细签轻触虫体，无任何反应者判为死亡。计算校正死亡率，将菌液各浓度换算成对数值，校正死亡率转换成死亡几率值，用SPSS软件分别求出标准品的LC50值和待测样品的LC50值，计算待测样品的毒力效价(Tx)。

Tx＝ 标准品LC50值×标准品效价 样品LC50值

2 结果与分析
2.1 Bt GIM1.32在2种培养基中的生长情况

2.1.1 蓝藻藻泥基本理化性质

蓝藻中理化成分分析结果见表1。经过藻水分离站富集后的蓝藻藻泥中仍含有约90%的水分，其中总固形物含量为9.47%±0.22%，挥发性固形物占到 7.29%±0.18%，灰分为2.08%±0.04%，因此如需利用蓝藻转化生产生物源农药，从固形物含量较低的藻泥中直接提取活性产物收率相对较低，且不现实，只能另寻思路。

冷冻干燥是目前保存生物制品较为有效的方法之一，对热敏性及易氧化的物质较为适合[28]。蓝藻冻干粉中含有大量蛋白质和氨基酸类物质，其中蛋白质含量高达42.48%±4.10%，氨基酸达35.71%±1.11%，其氨基酸含量不仅高，而且种类丰富，谷氨酸(4.68%)、天门冬氨酸(3.51%)、亮氨酸(3.54%)三者含量较高，均在3%以上，除脯氨酸、组氨酸、蛋氨酸含量在1%以下，其他氨基酸也均在1%~3%之间，因此蓝藻作为生物高蛋白饲料以及培养基具有一定的基础。此外，蓝藻冻干粉中还含有高达17.8%±1.75%的多糖及4.75%±0.35%的粗脂肪，58.41%的总碳，10.98%的总氮，1.22%的总磷以及0.74%的总钾，碳氮比(C/N)为5.32。因此利用蓝藻冻干粉作为培养基具有一定优势。

2.1.2 两种培养基中Bt GIM1.32活菌数的变化

培养基的种类可影响到Bt GIM1.32的生长。将活化10 h、处于对数生长期的菌种接种至不同培养基后，活菌数变化情况(图1)表明，蓝藻培养基中Bt GIM1.32的生长情况与常规LB培养基中较为接近。接种至蓝藻培养基后，菌体从12 h开始大量繁殖，至约36 h时达到6.35×108 CFU/mL，随后呈现一定的下降趋势。其原因可能是由于此阶段菌体开始形成芽胞，处于芽胞形成期，其生理状况较为复杂，通过平板计数法计算菌落时发现形成菌落的能力较差，但实际上培养基中菌体总量可能并未下降。48 h后，蓝藻及LB培养基中菌体生长均达到稳定状态，且蓝藻培养基中活菌数略高于常规LB培养基，二者分别为6.79×108和4.68×108 CFU/mL。


表1 蓝藻藻泥及冻干粉理化成分 Table 1 Physical-chemical properties of dry and wet blue-green algae
2.1.3 两种培养基中Bt GIM1.32活芽胞数的变化

从图2中可看出，接种至蓝藻培养基后，Bt GIM1.32 产生芽胞的时间要比常规LB培养基的提前约6 h，且在约54 h时，蓝藻培养基中Bt GIM1.32产芽胞量达到稳定并高于LB培养基中的产芽胞量，二者分别为7.01×108和8.49×106 CFU/mL。


图 1不同培养基中Bt GIM1.32活菌数变化规律 Fig.1 Changes of the number of viable cells of Bt GIM1.32 in different medium

图 2不同培养基中Bt GIM1.32 活芽胞数变化规律 Fig.2 Changes of the number of viable spore of Bt GIM1.32 in different medium

图 3 Bt GIM1.32菌种在不同培养基上 生长过程中pH变化规律 Fig.3 Changes of the pH value of Bt GIM1.32 in different medium
2.1.4 两种培养基中Bt GIM1.32生长过程pH值的变化

从图3中可看出，在2种培养基中，pH均呈现先下降后上升趋势，但蓝藻培养基和常规LB培养基的变化程度不同。从0~30 h，二者pH值均从7.0开始逐渐下降至约6.5；随后蓝藻培养基中pH迅速上升，至84 h时达到7.8，呈碱性，而LB培养基中pH为7.1，呈中性。可以看出，pH变化与Bt GIM1.32的代谢过程相关。原因在于接种Bt GIM1.32后其生长有一定延滞期，之后菌株营养体释放出的胞外淀粉酶使得培养基中的多糖转化为葡萄糖，葡萄糖随后通过己糖二磷酸(EMP)途径再降解为酸性的丙酮酸、乳酸和乙酸，从而导致pH下降。随后有机酸异化，胞外蛋白酶将蛋白质转化为细胞可用的氨基酸，同时生成NH+4，使得pH上升，此时芽胞也开始大量形成。但当pH达到一定程度时，氨基酸氧化酸的能力下降，同时NH+ 4被用于生成晶体蛋白，于是pH上升速度变缓慢。由于蓝藻培养基中营养较常规LB培养基丰富，因此Bt GIM1.32更易于在蓝藻培养基中生长和产生NH+4，这可能是导致蓝藻培养基中pH较高的原因之一。

2.1.5 Bt GIM1.32在2种培养基中的生长情况

通过光学显微镜观察能直观地表征Bt GIM1.32的生长和代谢进程，为规模化生产和研究提供依据。显微观察发现，取样稀释时由于菌体分布不均匀，因此从显微镜中不能直接反映出活菌及活芽胞数量的多少，但可以明显看出芽胞形成的时间及菌体本身变化情况。接种后菌体即开始大量生长，24 h左右，2种培养基中即开始有芽胞形成和释放，其中蓝藻培养基略早一些。常规LB培养基在48 和84 h时均还有约10%的菌体未转化为芽胞，而蓝藻培养基中48 h时菌体就已基本全部转化为芽胞，84 h时2种培养基中芽胞数量差异更为明显。因此蓝藻培养基产生芽胞的时间要比LB培养基早。

2.2 不同培养基中Bt晶体蛋白含量SDS-PAGE电泳分析

Bt中的主要杀虫活性物质是其所分泌的伴胞晶体和δ内毒素。通过SDS-PAGE电泳排除其他杂蛋白后，根据蛋白条带密度，通过Bio-Rad Quantity One软件可计算蛋白含量。已有研究表明，苏云金芽胞杆菌特征蛋白条带一般在125~138、65~75或25~28 ku[29]。从图4中可看出，Bt GIM1.32在蓝藻和LB培养基中生长代谢产生的特异性蛋白条带较为相似，均在130 ku处有明显条带，此外常规LB培养基在65 ku处的条带强于标准品和蓝藻培养基。通过Bio-Rad Quantity One软件计算得标准晶体蛋白回归方程为y=0.000 021 2x+0.349，R2=0.997 2(见表2)。可以看出，至48 h时，常规LB培养基与蓝藻培养基中130 ku晶体蛋白的含量均高于84 h时的，其原因可能是随着时间延长，菌株产晶体能力下降，此外还可能是由于130~140 ku的蛋白在pH值9.5时即可溶解[30]，即随时间增加菌株产晶体能力下降，以及pH升高导致部分晶体蛋白降解，可能是蛋白含量下降的原因之一。此外，同时段蓝藻培养基中晶体蛋白的含量高于常规LB培养基：48 h时，蓝藻培养基中130 ku晶体蛋白的质量浓度为 4.81 mg/mL，LB培养基中为3.91 mg/mL，相差 23.02%；84 h时，蓝藻培养基中130 ku晶体蛋白质量浓度为4.23 mg/mL，而LB培养基中为 3.09 mg/mL，相差36.89%。说明相对于常规LB培养基而言，同等条件下蓝藻培养基产芽胞的速率更快，晶体蛋白含量也较高，因此其用作为培养基具有一定的优势。


图 4 Bt GIM1.32在蓝藻与LB培养基中生长代谢产生晶体蛋白的SDS-PAGE电泳图 Fig.4 Bt GIM1.32 crystal protein in LB and blue-green algae media observed by SDS-PAGE

2.3 两种培养基中Bt的杀虫毒力效价(Tx)评定

以3龄初小菜蛾幼虫供试，接种感染48 h后发现，Bt GIM1.32在常规LB培养基和蓝藻培养基上生长产生伴胞晶体后均对小菜蛾有明显的杀虫活性，感染死亡后的小菜蛾全身变黑、腐烂并萎缩。从表3中可看出：48 h 时，蓝藻培养基的Tx最高，为1 600.00 IU/μL，LC50值为0.180 μL/mL，随着时间延长至84 h，其Tx下降为1 384.62 IU/μL，LC50值为0.208 μL/mL，表明蛋白晶体在培养基中会随时间有所降解；而LB培养基在48 h 时的Tx为1 315.07 IU/μL，LC50值为0.219 μL/mL，低于同时段的蓝藻培养基，84 h时，LB培养基中Tx也有所下降，为 1 082.71 IU/μL，LC50值为 0.266 μL/mL。结合表2与表3分析，在不同培养基上培养，Bt GIM1.32的杀虫毒力与SDS-PAGE电泳的晶体蛋白含量变化趋势呈正相关。

表2 SDS-PAGE电泳Bt GIM1.32 130 ku蛋白标准曲线及样品相对含量

Table 2 Relative contents of Bt standard and GIM1.32 crystal protein of 130 ku determined by SDS-PAGE


表3 Bt GIM1.32在常规LB和蓝藻培养基上培养 不同时间对小菜蛾3龄幼虫的毒力

Table 3 Toxicity of Bt GIM1.32 cultured in LB and blue-green algae media at different

fermentation time to 3rd instar larvae of P.xylostella

3 小结与讨论

蓝藻原料相对较易获得，以云南昆明滇池5套机械抽藻平台为例，每年可收集约2 300余吨新鲜蓝藻，且利用其作为培养底料无需经过任何前处理(3%含固率即可)。传统底物成本约 2 000元/t[10]，而蓝藻仅需机器富集的电力和运输费用，可使生产Bt的成本大幅降低。此外，相比沼渣、啤酒糟、玉米粉、豆饼粉、米糠、麦麸等传统底物而言，由于蓝藻富含氮、磷、多糖、氨基酸、蛋白质、粗脂肪等成分，能够满足Bt GIM1.32菌株正常生长代谢，完成芽胞和伴胞晶体的合成。因此，利用蓝藻为底物发酵生产Bt杀虫剂具有很好的开发潜力和应用前景。

蔡健等曾对利用蓝藻生产Bt的条件进行过研究分析，但采用的是Bt k130菌种，结果发现其毒效较低[31]。本研究选用Bt GIM1.32菌株，以蓝藻为培养基，当蓝藻含固率为3%、pH 7、接种物种龄为10 h、接种量2%、培养温度30 ℃时，在48 h左右，活菌数达到相对稳定值(6.79×108 CFU/mL)，54 h左右芽胞数达到相对稳定值(7.01×108 CFU/mL)。其130 ku晶体蛋白质量浓度为4.81 mg/mL，对3龄小菜蛾的LC50值为0.180 μL/mL，毒力效价为1 600.00 IU/μL，产毒素性能整体上较常规LB培养基优良。Dulmage[32]研究了苏云金芽胞杆菌12个亚种在2种不同培养基中的生长后发现，不同亚种在同一培养基中或同一亚种在不同培养基中培养，所产生的活芽胞数及杀虫活性可相差几倍到几百倍不等。由于菌种和培养基组份均对最终产品的毒力效价具有重要影响，因此，为进一步提高杀虫毒效，针对蓝藻发酵Bt GIM1.32菌株生产生物农药Bt的最佳条件进一步进行研究探索十分必要。

本研究为蓝藻资源的高附加值化利用开辟了一条新的技术途径，既可将蓝藻变废为宝，也可有效降低生物农药Bt的生产成本。

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利用新鲜蓝藻藻泥发酵制备苏云金芽胞杆菌杀虫剂
谭超, 张乃明