农药学学报  2013, Vol.15 Issue (6): 661-666   PDF    
引用本文
丁立平, 方祥, 吴文凡. 固相萃取-气相色谱-质谱联用法测定蔬菜中烯肟菌胺的残留及其裂解机理[J]. 农药学学报, 2013, 15(6): 661-666  
DING Liping, FANG Xiang, WU Wenfan. Determination of fenaminstrobin in vegetables by gas chromatography-mass spectrometry with solid phase extraction and its fragmentation mechanism[J]. Chinese Journal of Animal Nutrition, 2013, 15(6): 661-666  
固相萃取-气相色谱-质谱联用法测定蔬菜中烯肟菌胺的残留及其裂解机理
丁立平 , 方祥, 吴文凡    
福清出入境检验检疫局 综合技术中心, 福建 福清 350300
收稿日期：2013-6-3; 修回日期：2013-6-20.
基金项目：福建出入境检验检疫局科技项目（FK2012-16）.
作者简介: *丁立平，通信作者（Author for correspondence），男，硕士，工程师，主要从事进出口食品有害物质检测工作，E-mail：43548624@qq.com; .
摘要：建立了蔬菜中烯肟菌胺残留量的固相萃取-气相色谱-质谱联用（SPE-GC-MS）分析方法；对烯肟菌胺的裂解机理进行了探讨；确定了测试分析的定性离子和定量离子。样品采用乙酸乙酯高速分散提取，以无水硫酸镁、硅胶和石墨化炭黑（GCB）为混合填料进行固相萃取净化，气相色谱-质谱联用仪在选择离子扫描（SIM）模式下进行检测，基质匹配标准溶液外标法定量。结果显示：烯肟菌胺在0.02~1 mg/L内，标准溶液的峰面积与质量浓度呈良好的线性关系（r>0.999）；在0.02~0.2 mg/kg添加水平下，烯肟菌胺的平均回收率为94%~99%，相对标准偏差（RSD，n=6）为2.3%~2.9%；方法的检出限（LOD）（S/N=3）为0.006 mg/kg，定量限（LOQ）（S/N=10）为0.02 mg/kg。
关键词： 固相萃取     气相色谱-质谱联用     蔬菜     烯肟菌胺     残留     裂解机理    
Determination of fenaminstrobin in vegetables by gas chromatography-mass spectrometry with solid phase extraction and its fragmentation mechanism
DING Liping , FANG Xiang, WU Wenfan    
Fuqing Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau Technology Center, Fuqing 350300, Fujian Province, China
Abstract: A solid phase extraction coupled with gas chromatography-mass spectrometric(SPE-GC-MS) method was established for the determination of fenaminstrobin(SYP-1620) residue in vegetables.The target analytes in samples were extracted with ethyl acetate in high-speed homogenate extraction,followed by solid phase extraction clean-up with the mixture of anhydrous magnesium sulphate(MgSO4),silicone gel and graphitized carbon(GCB),analyzed by GC-MS under selected ion monitor mode(SIM) and quantified by matrix-match standard solution in external standard method.Good linear was obtained in the range of 0.02-1.00 mg/L for fenaminstrobin with correlation coefficient not less than 0.999 under the optimum conditions,and the limits of detection(S/N=3) and the limits of quantitation(S/N=10) were 0.006 mg/kg and 0.02 mg/kg,respectively.The average recoveries of fenaminstrobin from blank samples at three spiked levels of 0.02,0.04 and 0.2 mg/kg ranged from 94% to 99% with RSDs of 2.3%-2.9%.The fragmentation mechanism of fenaminstrobin was also studied in this article in which the qualitative ions and quantitative ions were confirmed.
Key words: solid phase extraction     gas chromatography-mass spectrometry     vegetable     fenaminstrobin     residue     fragmentation mechanism    

烯肟菌胺( Scheme 1 )，英文名fenaminstrobin(SYP-1620),化学名为(E,E,E)-N-甲基-2-[((((1-甲基-3-(2，6，-二氯苯基)-2-丙烯基)亚氨基)氧基)甲基)苯基]-2-甲氧基亚氨基乙酰胺，分子式为：C21H21Cl2N3O3，相对分子质量为433.10，易溶于丙酮、乙腈、乙酸乙酯和二氯甲烷[1]，是由沈阳化工研究院于1999年自主创制的甲氧基苯烯酸酯类杀菌剂，于2003年获得中国发明专利(专利号:ZL00110143.9)，2004年完成原药及5%乳油的临时登记并进入中国市场[2]，对小麦、蔬菜、果树上的主要真菌病害具有较好的防治效果[2, 3, 4, 5, 6]。目前市售产品有5%乳油和20%悬浮剂，环境生物毒性评价显示其为低毒[1]，但最近的研究报道提示其对生态环境可能存在一定的潜在风险[7]。目前，国内外尚未规定其在食品中的最大残留限量值(MRL)。

Scheme 1

当前，对烯肟菌胺的研究报道主要是采用高效液相色谱法(HPLC)对其原药和制剂进行检测和分析[8, 9]，尚未见关于其残留量检测的报道。气相色谱-质谱(GC-MS)联用仪对新物质检测具有较强的定性功能[10]，但目前未见有关应用GC-MS分析检测烯肟菌胺残留量的研究报道，也未见有关烯肟菌胺有机质谱解析的研究报道。本研究采用乙酸乙酯高速分散提取，固相萃取法(SPE)净化，GC-MS测定，建立了蔬菜中烯肟菌胺残留量的检测方法，并对其裂解机理进行了探讨。

1 材料与方法
1.1 供试材料
1.1.1 主要仪器

Agilent 6890N-5975B气相色谱-质谱联用仪,美国Agilent公司；IKA T-25高速分散器,德国IKA公司；Turbovap Ⅱ样品快速浓缩工作站,美国Biotage公司；RV10旋转蒸发仪，德国IKA公司；ZM200超离心研磨仪，德国Retsch公司；3K-15冷冻离心机，德国Sigma公司；AFS-7400 凝胶渗透净化系统，北京莱伯泰科仪器有限公司。

1.1.2 试剂与药剂

烯肟菌胺(fenaminstrobin)原药,纯度98%，沈阳化工研究院生产。二氯甲烷、环己烷为色谱纯,德国默克公司；其余试剂均为国产分析纯。盐析剂：m(无水硫酸镁)∶ m(乙酸钠)=4∶1 混合；净化剂Ⅰ:m(无水硫酸镁) ∶m(PSA) ∶m(C18) ∶m(GCB)=3 ∶1 ∶1 ∶1混合；净化剂Ⅱ：m(无水硫酸镁) ∶m (中性氧化铝) ∶m(GCB)=3 ∶2 ∶1混合；净化剂Ⅲ：m(无水硫酸镁) ∶m(硅胶) ∶m(GCB)=3 ∶2 ∶1混合。

1.1.3 供试样品

供试芹菜、菠菜、黄瓜、甘蓝和番茄样品购自当地农贸市场或超市，取可食部分制成糜样，于-20 ℃冰箱中冷冻保存，备用。

1.2 试验方法
1.2.1 基质匹配标准溶液配制

准确称取0.01 g(精确到0.000 01 g)烯肟菌胺原药，用丙酮溶解并配制成10.0 mg/L的标准储备液，于-20 ℃冰箱中保存，备用。使用前根据检测要求使用空白基质提取液(乙酸乙酯)稀释成相应浓度的基质匹配标准工作溶液。

1.2.2 样品的提取和净化

提取：参考文献[10]的方法并稍作改动。准确称取解冻样品10.00 g加入到50 mL具塞离心管中，依次加入盐析剂5.0 g 和乙酸乙酯20.0 mL，在10 000 r/min下高速分散提取1.0 min；另取1支50 mL离心管，加入20.0 mL 乙酸乙酯清洗刀头；合并2次提取液，在4 000 r/min下离心5 min，取全部上清液于40 ℃下旋转蒸发至约1 mL，待净化。

净化：参考文献[10]的方法并稍作改动。用5 mL V(正己烷) ∶V(丙酮)=1 ∶1 混合溶液活化装有0.50 g净化剂的固相萃取小柱，吸取上述待净化溶液加入到活化后的固相萃取小柱中， 待液面没入柱体后加入5 mL V(正己烷) ∶V(丙酮)=1 ∶1 混合溶液洗脱，收集全部洗脱液，于40 ℃下氮吹至近干，以丙酮定容至1.0 mL，经0.22 μ m滤膜过滤，待分析。

1.2.3 GC-MS分析条件

GC条件： DB-5 MS毛细管色谱柱(30 m×0.25 mm×0.25 μ m)；载气为高纯氦气(99.999%)；恒流模式，柱流速为1.1 mL/min；进样量为1.00 μ L，不分流进样；进样口温度270 ℃； 柱温升温程序：初始温度70 ℃，保持1 min，以25 ℃/min升至280 ℃，保持2 min，以20 ℃/min升至300 ℃，保持5 min。

MS条件：电子轰击离子源(EI源)，电子轰击能量70 eV，单级四极杆质量分析器；离子源温度230 ℃；四级杆温度 150 ℃；传输线温度 280 ℃；全扫描模式：扫描范围m/s

50～500，确定待测化合物扫描离子、保留时间和检查目标峰有无杂质干扰；溶剂延迟15.0 min；选择离子模式(SIM)：定量离子m/z 116，定性离子m/z 132、221、205；驻留时间：100 ms。

1.2.4 样品前处理方法的优化

选择色素含量较高的空白菠菜为样品基质，在0.05 mg/kg添加水平下，借鉴文献[11]设计正交试验方案L9(34)，考察提取方法、提取溶剂、净化方式和净化剂等对添加回收率和相对标准偏差的影响。即1)3种提取方法：振荡提取30 min(简称OE)、超声波辅助萃取15 min(UAE)和高速分散提取1 min(HSTE)；2)3种提取溶剂：乙腈(A)、乙酸乙酯(EA)和V(正己烷) ∶V(丙酮)=1 ∶1(HA)；3)3种净化方式：固相萃取法(SPE)、凝胶渗透色谱法(GPC)[12]和QuEChERS法(Q)[13]；4)3种净化剂：Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ(组成成分见1.1.2节)。根据正交试验方案得到9种组合条件：1)OE+A+SPE+Ⅰ；2) OE+EA+GPC+Ⅱ；3)OE+HA+Q+Ⅲ；4)UAE+A+GPC+Ⅲ； 5)UAE+EA+Q+Ⅰ；6)UAE+HA+SPE+Ⅱ；7)HSTE+A+Q+Ⅱ；8)HSTE+EA+SPE+Ⅲ；9)HSTE+HA+GPC+Ⅰ。

在上述3种净化方式中：SPE按照1.2.2节方法进行提取和净化； GPC是在按照1.2.2节中的方法完成提取和离心后，将全部上清液倒入50 mL梨形瓶中，于40 ℃下旋转蒸发至近干，用6 mL V(二氯甲烷) ∶V(环己烷)=1 ∶1混合溶液溶解并转移至离心管中，离心后取4.8 mL上清液，依照文献[12]中GPC的净化条件进行净化：检测波长254 nm，V(二氯甲烷) ∶V(环己烷)=1 ∶1，流量5 mL/min，切割点为11.5 min,收集切割点后流动相90 mL；QuEChERS法是按照文献[13]方法对添加样品用乙腈作为提取液进行提取离心后，称取0.5 g净化剂Ⅰ于5.0 mL离心管中，加入1.0 mL乙腈提取液，涡旋、离心并过滤后，待分析。

1.2.5 标准曲线绘制

采用外标法定量。使用空白基质提取液(乙酸乙酯)将烯肟菌胺标准储备液梯度稀释成0.02、0.04、0.1、0.5和1 mg/L的标准工作溶液，按照1.2.3节条件进行分析。以标准溶液的峰面积为纵坐标(y)、质量浓度(x)为横坐标绘制校正曲线。

1.2.6 添加回收试验

分别称取10.0 g空白样品，加入适量质量浓度为1.0 mg/L 的烯肟菌胺标准工作溶液，混匀后静置老化30 min，制成添加水平分别为0.02、0.04、0.2 mg/kg的添加样品[14]，按照1.2.2节方法进行前处理和1.2.3节条件进行分析测试。每个水平重复6次，计算添加回收率和相对标准偏差(RSD)。

1.2.7 基质效应考察试验

配制质量浓度为0.05 mg/L 的基质匹配标准溶液和同样浓度的溶剂标准溶液，分别按照1.2.3节选择SIM方式进行测定，依照公式 η =Ai 基质标样/Ai 溶剂标样计算基质效应[14]，考察 η 与1的关系，判定基质效应。其中，Ai为烯肟菌胺的峰面积。

1.2.8 全扫描试验

取适量质量浓度为1 mg/L的烯肟菌胺标准溶液按照1.2.3节条件在m/z 50～450范围内进行全扫描，确定烯肟菌胺的保留时间并得到全扫描质谱图。

2 结果与讨论

2.1 样品前处理方法的优化

表1为正交试验所得的添加回收率和RSD结果。可见：应用QuEChERS方法回收率较低，不宜采用；虽然使用SPE和GPC方法均能取得较好的 试验结果，其中HSTE+EA+SPE+Ⅲ组合与HSTE+ HA+GPC+Ⅰ组合结果较优，但使用GPC净化的操作过程过于繁琐，且有机溶剂用量大，既增加了检测成本又对环境、实验人员健康易产生不利影响。因此，最终确定前处理条件为：以乙酸乙酯为提取溶剂进行高速分散提取，以m(无水硫酸镁) ∶m(硅胶) ∶m(GCB)=3 ∶2 ∶1(净化剂Ⅲ)为净化剂，采用SPE净化方法。其添加色谱图见图1。从中可见目标峰未受杂质峰干扰，表明净化效果较好。

图1 烯肟菌胺标准溶液、基质空白及其在蔬菜中 添加(0.05 mg/kg)色谱图 Fig.1 The chromatograms of fenaminstrobin standard,sample blank and spiked samples(0.05 mg/kg) 注：1.芹菜；2.番茄；3.菠菜；4.甘蓝；5.黄瓜；6.空白； 7.标准溶液。

Note:1.Celery;2.Tomato;3.Spinach;4.Cabbage;5.Cucumber;6.Blank sample;7.Standand.

表1 正交试验所得的烯肟菌胺添加回收率 (n=3) Table 1 Recoveries of fenaminstrobin from orthogonal experiments(n=3)

2.2 方法的线性范围、检出限和定量限

外标法定量分析结果表明：在质量浓度0.02～1 mg/L内，烯肟菌胺标准溶液的峰面积(y)与质量浓度(x)间有良好的线性关系，线性方程为y=170 044 x-1 092，r=0.999。以稀释标准溶液进行样品添加的方式测得方法的检出限(S/N=3)为0.006 mg/kg,定量限(S/N=10)为0.02 mg/kg。

2.3 方法的准确度及精密度

结果(表2)显示:在0.02、0.04和0.2 mg/kg添加水平下,烯肟菌胺平均回收率为94% ～99%，RSD(n=6)为2.3% ～2.9%。结果符合农药残留分析的要求[15]。

表2 烯肟菌胺的添加平均回收率和相对标准偏差 (n=6) Table 2 Recoveries and RSD of fenaminstrobin (n=6)

2.4 基质效应

基质效应考察试验结果表明，5种基质的 η 在0.97～1.03之间，接近1，表明基质效应不明显，说明这5种基质经过本方法净化后对质谱检测不会产生显著影响。

2.5 烯肟菌胺裂解机理和特征碎片离子的选择

烯肟菌胺的总离子流色谱图和质谱图见图2。由于烯肟菌胺属于新型农药，无标准谱库数据可查询，因此需对其进行解析加以确证。

图2 烯肟菌胺标准品(0.05 mg/L)的总离子流色谱图及质谱图 Fig.2 Total ion chromatogram and mass spectrum of fenaminstrobin(0.05 mg/L)

从图2可见：在质谱图高质量端未见分子离子峰，表明其分子离子均已发生裂解，并发生了以下裂解反应。即当氨基氮上的n电子丢失时，则产生奇电子离子，并发生取代反应(rd)，产生碎片离子m/z 205。当羰基氧上的n电子丢失时，则产生奇电子离子并有2条二次裂解反应途径：1)发生 α 断裂，产生碎片离子m/z 58；2)发生氢重排(rH)反应、 α 断裂产生碎片离子m/z 221，之后该离子经过环化反应(rc)、消去反应(re)产生碎片离子m/z 132和116。以上途径的断裂过程及机理见图3。由于在m/z＜100的低质量端碎片离子峰易受进样溶剂、样品中杂质和色谱柱流失等因子干扰，不易判别，一般不作为定量和定性离子用，故选择m/z 116作为定量离子，m/z 132、221、205作为定性离子。

图3 推断的烯肟菌胺特征碎片离子裂解机理 Fig.3 The inferred fragmentation mechanism of fenaminstrobin characteristic fragment ions

3 结论

本研究以乙酸乙酯为提取剂进行高速分散提取，以无水硫酸镁、硅胶和石墨化炭黑为净化剂进行固相萃取，结合GC-MS检测，外标法定量，建立了蔬菜中烯肟菌胺的残留量有效检测方法。所建方法方便、快捷、可靠，对其他蔬菜中烯肟菌胺的快速检测有借鉴作用。通过对其裂解机理的探讨，确定了烯肟菌胺测试分析所要求的定性和定量离子，为烯肟菌胺的检测确证提供了依据，同时所得到的质谱图进一步丰富了国际通用质谱库。

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