2013, Vol. 15 
茶叶是我国主要的出口经济作物之一，其农药残留问题一直受到广泛关注[1]。 茶树上常见的害虫有天线子、瓢虫、假眼小绿叶蝉、茶毛虫、茶尺蠖、茶刺蛾及黑刺粉虱等，目前常用的防治药剂主要有吡虫啉、啶虫脒、噻螨酮、双甲脒、灭多威、克百威、丁硫克百威及唑螨酯等。 由于长期过度使用杀虫剂，在获得经济效益的同时也产生了一定的副作用[2]。目前，我国除尚未规定噻螨酮、双甲脒、丁硫克百威和唑螨酯在茶叶中的最大允许残留限量(MRL)标准外，已规定茶叶(含代用茶)中其他4种杀虫剂的MRL标准分别为：克百威0.05 mg/kg[3]，啶虫脒 0.1 mg/kg[4]，灭多威3.0 mg/kg[5]，吡虫啉0.5 mg/kg[5]。
有关茶叶中农药残留的分析方法已有很多报道，主要以色谱技术为主。侯如燕等[6]采用液相色谱-紫外检测器检测了茶叶中吡虫啉的残留量，样品经甲醇提取，二氯甲烷反萃取，ENVI-18小柱净化，其方法的检出限(LOD)为0.05 mg/kg；杨容[7]曾采用气相色谱法检测茶叶中痕量的双甲脒残留，样品中的双甲脒在酸性介质中经水解生成酰胺，酰胺碱解生成苯胺，苯胺经反复分配净化后生成含氟酰胺，其中双甲脒的实际检出限为0.005 mg/kg；徐敦明等[8]采用加速溶剂萃取(ASE)-气相色谱-串联质谱法测定了茶叶中唑螨酯的残留量，其定量限(LOQ)为0.003 mg/kg；顾亮等[9]通过液相色谱-串联质谱研究了茶叶中灭多威和克百威残留量的快速检测方法，样品经乙腈提取，氨基固相萃取柱净化，其LOD为0.005 mg/kg；徐娟等[1]建立了高效液相色谱-电喷雾电离串联质谱同时检测茶叶中啶虫脒、克百威、唑螨酯、吡虫啉及灭多威残留的方法，样品经QuEChERS方法前处理，其5种农药的LOQ均为0.01 mg/kg。
茶叶基质的复杂性增加了其农药残留检测的难度，近年来发展起来的超高效液相色谱-质谱联用(UPLC-MS)技术具有检测灵敏度高、适用范围广、分析速度快以及可有效排除复杂基质干扰等优点，因而成为了首选的最佳检测手段。但目前尚未见利用超高效液相色谱-电喷雾串联质谱(UPLC-ESI-MS/MS)同时检测茶叶中灭多威等多种杀虫剂残留的文献报道。因此，笔者通过对茶叶中噻螨酮、双甲脒、灭多威等8种杀虫剂残留的提取、净化及色谱-质谱检测条件进行研究，建立了UPLC-ESI-MS/MS同时测定茶叶中多种杀虫剂残留量的方法。
噻螨酮(hexythiazox)标准品(1 000 mg/L，溶剂为甲醇)购自北京北研馨绿生物技术有限公司；双甲脒(amitraz)标准品(10 mg/L，环己烷)购自Dr.Ehrenstorfer公司(德国)；灭多威(methomyl)标准品(1 000 mg/L，甲醇)、啶虫脒(acetamiprid)标准品(1 000 mg/L，丙酮)、吡虫啉(imidacloprid)标准品(1 000 mg/L，甲醇)、克百威(carbofuran)标准品(1 000 mg/L，甲醇)、丁硫克百威(carbosulfan)标准品(1 000 mg/L，丙酮)及唑螨酯(fenpyroximate)标准品(1 000 mg/L，丙酮)均购自农业部环境质量监督检验测试中心(天津)。
乙腈(色谱纯及分析纯)，无水硫酸钠(分析纯，使用前于450 ℃烘4 h)，其余试剂为色谱纯；纯净水(昆明娃哈哈启力饮料有限公司)。
ACQUITY Ultra Performance LCTM超高效液相色谱仪及Waters XEVO TQD串联四级杆质谱仪(Waters 公司)；分析天平(0.001 g，梅特勒-托利多 仪器有限公司)；茶叶TPT萃取柱(2 000 mg/12 mL， 天津博纳艾杰尔科技有限公司)。
Waters Acquity UPLC BEH C18色谱柱(50 mm× 2.1 mm，1.7 μ m)； 柱温40 ℃，进样室温度15 ℃；进样量10 μ L；流速0.3 mL/min；流动相A为纯净水(含体积分数为0.1%的甲酸)，流动相B为乙腈；梯度洗脱程序：0.0 min时，V(A) ∶V(B)=95 ∶5；0.5 min时，V(A) ∶V(B)=30 ∶70； 3.0 min时，V(A) ∶V(B)=10 ∶90；5.1 min时，V(A) ∶V(B)=95 ∶5。
ESI+离子化模式；毛细管电压3.43 kV；离子源温度150 ℃；雾化气和脱溶剂气均为氮气，碰撞气为氩气；脱溶剂气温度350 ℃，流速850 L/h；多反应监测(MRM)模式。各农药的分子式、定性及定量离子对、锥孔电压、碰撞能量及保留时间见表 1。
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表 1 供试8种杀虫剂的质谱条件参数 Table 1 Parameters of mass spectrum(MS) conditions for eight insecticides |
选取云南省西双版纳傣族自治州勐海县巴达一级晒青毛茶空白样品，四分法缩分后取200 g，粉碎后过1 mm孔径筛，混匀，备用。
准确称取2 g样品(精确至0.001 g)于50 mL具塞离心管中，加入10 mL纯净水浸润5 min， 加入15 mL乙腈(分析纯)，回旋振荡(360次/min， 回旋幅度20 mm)提取10 min，加入4 g无水硫酸钠，振摇2 min，静置5 min，4 200 r/min离心5 min，将上清液移入200 mL鸡心瓶中；残渣加15 mL乙腈重复振荡提取，离心后将上清液移入鸡心瓶中；剩余残渣再用10 mL乙腈重复振荡提取一次，将上清液并入鸡心瓶中；45 ℃水浴减压浓缩至1 mL左右，待净化。
在TPT萃取柱中加入约2 cm高无水硫酸钠，用10 mL乙腈-甲苯[V(乙腈) ∶V(甲苯)=3 ∶1]洗脱液预淋洗，弃去淋出液；将上述样品浓缩液转移至固相萃取柱中，用2 mL乙腈-甲苯洗脱液洗涤样品瓶，重复3次，合并洗涤液，移入柱中，再用25 mL乙腈-甲苯洗脱液淋洗；收集所有流出液于鸡心瓶中，于45 ℃水浴减压浓缩至约0.5 mL，45 ℃下氮气吹干，用2 mL乙腈-水[V(乙腈) ∶V(水)=3 ∶2]溶解残渣。取1 mL，经0.2 μ m微孔滤膜过滤后，供UPLC-MS/MS测定。
已有众多文献对采用C18色谱柱分离样品中残留的杀虫剂进行了较全面的报道。孔志强等[10]考察了C18、Shield RP18、HILIC和Phenyl 4种不同选择性的UPLC柱对柑橘及柑橘精油中吡虫啉等农药的分离效果，发现C18色谱柱的分离效果较理想。根据国家相关标准[11]中采用ZORBAX SB-C18对茶叶中的克百威、丁硫克百威、吡虫啉、灭多威、啶虫脒、唑螨酯 和噻螨酮等农药进行定性分离、确证的建议，本研究选用了 Waters Acquity UPLCBEH C18 柱( 50 mm×2.1 mm，1.7 μ m)，其采用1.7 μ m小颗粒填料，在更宽的线速度范围内可获得最佳的分离效果，显著提升了色谱柱的性能[12]。
在运用液-质联用技术时，流动相的选择除考虑色谱分离效果外，还必须考虑组分进入质谱前的离子化效率，以获得最佳的分辨率和最高的灵敏度。本研究选用0.1%甲酸水溶液(A)和乙腈(B)作流动相，流动相A中的甲酸可提供H+，维持目标离子的质子化状态，增强离子化程度，有助于提高检测的灵敏度，而流动相B(乙腈)的黏度低，样品出峰峰形较好，响应值较高。
目前研究较多的有机提取溶剂主要有甲醇、乙腈、丙酮、二氯甲烷等及其混合溶液。采用丙酮提取时杂质较多，后续净化步骤繁琐[9]；甲醇和二氯甲烷具有一定的毒性；而本研究所用乙腈极性中等、与水互溶，可有效提取茶叶中吡虫啉、啶虫脒等农药，杂质干扰少，后续净化方法简单，出峰效果较理想，且回收率较高[13]；同时，茶叶样品预先用纯净水浸润，也有利于将水溶性较好的啶虫脒[13]、吡虫啉[14]等农药提取出来。
在选择样品定容溶剂时，除要考虑各残留农药的溶解性外，还要考虑其对离子化效果及色谱峰形的影响。通过质谱全扫描发现，在电喷雾离子源(正离子)、多反应监测模式下，参考文献方法[11]，采用乙腈-水[V(乙腈) ∶V(水)=3 ∶2]作为定容溶剂时，离子化效率较好，响应值较高，且峰形较对称。
基质效应(matrix effect，ME)是指样品中除目标化合物以外的其他成分对目标化合物仪器响应值的影响，其会降低方法的灵敏度，影响方法的准确性[15]。茶叶样品中的复杂基质容易影响电喷雾的离子化效率，改变离子信号，从而影响检测结果的准确性[16]。本研究中采用基质匹配标准溶液校正方法[17]对基质效应进行了补偿。按信噪比(S/N)=3计算得方法的检出限(LOD)，按S/N=10计算定量限(LOQ)。结果见表 2。
取0.5 mg/kg的茶叶基质匹配混合标准工作溶液，于15 ℃下液质样品管理器中保存，分别在0、4、8、12、16、20和24 h取样进行日内精密度测定。结果显示，各农药的日内相对标准偏差(RSD，n=7)在1.3% ~4.2%之间，其中啶虫脒为1.3%，双甲脒为4.2%。表明茶叶基质中质量分数为0.5 mg/kg的待测农药混合标准工作溶液在24 h内较稳定。
准确称取2 g制备好的空白茶叶样品于50 mL离心管中，按照国家相关标准[18]，分别添加如表 3所示浓度水平的混合标准溶液，涡旋3 min，静置30 min。每个添加水平设6次重复，按照1.3.3节方法进行样品前处理后进样检测。当添加水平大于0.5 mg/kg时，可采用逐级稀释法稀释至终浓度在线性范围内。由表 3可见，经基质匹配标准工作溶液校正后，待测8种农药的平均回收率在61% ～107%之间，相对标准偏差(RSD，n=6)为0.2% ~9.9%。相关离子色谱图见图1。
| 表 2 供试8种杀虫剂的基质匹配标准曲线、相关系数、检出限及定量限 (n=7) Table 2 Linear equations,correlation coefficients,LOD and LOQ for eight insecticide(n=7) |
| 表 3 茶叶中8种农药的添加回收率及相对标准偏差 (n=6) Table 3 Recoveries and relative standard deviations(RSD) of eight insecticide residues in tea(n=6) |
 | 图1 茶叶基质中8种农药混合标准工作溶液的定性离子色谱图 (0.5 mg/kg) Fig.1 Qualitative ion' chromatograms of eight insecticides at tea matrix(0.5 mg/kg) |
采用所建立的方法，对来自云南省普洱茶主产区的147份茶叶样品中的8种供试药剂进行了测定。结果显示，所有供试茶叶样品中均未检出8种农药残留。
本研究对文献[11]中的前处理方法进行了改进，预先用纯净水浸润茶叶样品，用乙腈振荡提取，经茶叶专用TPT萃取柱净化，优化了超高效液相色谱-串联四级杆质谱检测条件，能够对茶叶样品中残留的8种供试杀虫剂进行准确的定性与定量。以空白茶叶样品基质配制基质匹配混合标准溶液进行基质效应校正，有效去除了基质干扰。精密度和添加回收率试验结果均符合农药残留分析准则要求。所建立方法检测速度快、灵敏度高，可用于同时测定茶叶中噻螨酮、双甲脒、灭多威及啶虫脒等8种农药的残留。
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