2013, Vol. 15 
2. 农业部 农药检定所, 北京 100026
2. Institute of the Control of Agrochemicals, Ministry of Agriculture, Beijing 100026, China
双孢蘑菇 Agaricus bisporus是目前世界上栽培最广泛、栽培量最大的食用菌品种。蘑菇褐腐病又称蘑菇湿泡病、白腐病，是为害蘑菇栽培业的世界性病害[1, 2, 3, 4]，其病原菌为疣孢霉 Mycogone perniciosa Magn.，是一种土壤习居菌，分类上属半知菌亚门，丝孢纲，丝孢目，丛梗孢科[5]。1982年，朱慧贞在研究北京蘑菇病害时首次报道了疣孢霉，之后该病害在我国蘑菇主要种植区迅速扩展开来，造成了严重的经济损失[6, 7]。覆盖土的消毒灭菌和发病后喷施杀菌剂处理仍是目前防治该病害的主要措施，生产上曾先后使用过甲醛、福美双、代森类及苯并咪唑类等杀菌剂[8, 9]。
双孢蘑菇在分类上属于真菌门，担子菌亚门，层菌纲，伞菌目，蘑菇属，和疣孢霉具有一定的同源性。由于杀菌剂对蘑菇褐腐病菌和蘑菇有着相似的作用位点，因此其对蘑菇褐腐病菌和蘑菇均可能产生不同程度的抑制作用[10, 11]。为明确不同类型杀菌剂对蘑菇褐腐病的药效及对蘑菇生长的影响，笔者开展了多菌灵、百菌清、福美双、咪鲜胺、噻菌灵、苯醚甲环唑和戊唑醇7种杀菌剂对蘑菇褐腐病菌的室内毒力和田间防效测定，以及其中部分药剂对蘑菇的安全性研究与评价，以期为蘑菇生产上安全合理使用杀菌剂提供参考。其中，多菌灵和百菌清已在蘑菇生产中应用多年 [12]；咪唑类杀菌剂咪鲜胺和噻菌灵已获准登记在蘑菇上使用；而苯醚甲环唑和戊唑醇是分别由先正达和拜耳公司开发的具有保护、治疗和内吸特性的三唑类杀菌剂，属甾醇合成抑制剂，可阻止真菌的生长，对子囊菌亚门、担子菌亚门、半知菌亚门多个属病原菌造成的作物病害均有很好的保护和治疗作用[13]，是目前国内生产和使用量较大的杀菌剂品种；福美双是具有良好保护作用的杀菌剂，常用作土壤处理[13]。
蘑菇褐腐病菌，由本研究组从福建省莆田市荔城区新度镇青坨村采集标本并分离纯化，经症状和病原菌形态学观察[3, 14] 鉴定为疣孢霉 Mycogone perniciosa Magn.，并通过柯赫氏法则[15]验证了其致病性。
蘑菇品种：双孢菇AS2796、双孢菇W192及姬松茸A均由福建省农业科学院食用菌研究所提供，用于供试杀菌剂对蘑菇的安全性评价。
97.2%福美双(thiram)原药，南通宝叶化工有限公司；98.5%百菌清(chlorothalonil)原药，江阴苏利化学有限公司；97.2%戊唑醇(tebuconazole)原药，江苏丰登农药有限公司；96.1%苯醚甲环唑(difenoconazole)原药，江苏耕耘化学有限公司；96.5%咪鲜胺(prochloraz)原药及98.1%多菌灵(carbendazim)原药，辉丰农化股份有限公司；98.5%噻菌灵(thiabendazole)原药，江苏嘉隆农药厂。多菌灵原药用0.1 mol/L的盐酸水溶液配制成1.0×104 mg/L的母液，其余均用丙酮溶解并配制成1.0×104 mg/L的母液，置于4 ℃冰箱保存，备用。
50%多菌灵可湿性粉剂(WP)(江苏三山农药有限公司)；75%百菌清WP(江阴苏利化学有限公司)；50%福美双WP(江苏南通宝叶化工有限公司)；43% 戊唑醇悬浮剂(SC)及50%咪鲜胺锰盐WP(江苏辉丰农化股份有限公司)；10%苯醚甲环唑水分散粒剂(WG)(江苏耕耘化学有限公司)。
马铃薯葡萄糖培养基(PDA)：马铃薯200 g，葡萄糖20 g，琼脂17 g，纯净水1 L；麦粒煮汁培养基：麦粒200 g，葡萄糖20 g，磷酸氢二钾1 g，硫酸镁0.5 g，蛋白胨1 g，琼脂20 g，纯净水1 L。
采用菌丝生长速率法[16]测定。根据预试验结果，将各供试原药母液用0.1%的吐温-80无菌水溶液分别稀释成5个系列浓度后加入到PDA培养基中，其中，戊唑醇、苯醚甲环唑、咪鲜胺和多菌灵分别配制成0.012 5、0.025、0.05、0.1和0.2 mg/L系列浓度的含药PDA平板，福美双配制成20、40、80、160和320 mg/L系列浓度的PDA平板，百菌清配制成0.025、0.05、0.1、0.2和0.4 mg/L系列浓度的PDA平板，噻菌灵配制成0.05、0.1、0.2、0.4和0.8 mg/L系列浓度的PDA平板，备用。将蘑菇褐腐病菌置于无药PDA培养基上，25 ℃培养7 d后从菌落边缘打取直径0.5 cm的菌碟，菌丝面朝下接种于系列含药PDA平板中央，于25 ℃恒温培养，每处理5次重复，以不加药剂的处理为对照，7 d后用十字交叉法[17]测量菌落直径。
供试7种药剂中，由于噻菌灵和咪鲜胺已获准登记用于防治蘑菇褐腐病，因此未就这2种药剂对双孢蘑菇的室内安全性进行评价，采用菌丝生长速率法[16]测定了其余5种杀菌剂对不同品种双孢蘑菇的安全性。将各原药母液用0.1%的吐温-80无菌水溶液分别稀释成系列浓度，加入到麦粒煮汁培养基中，分别配制成其对蘑菇褐腐病菌的EC50值、2倍EC50值及4倍EC50值 3个处理浓度的培养基平板，备用。将3个品种双孢蘑菇菌种于无药麦粒煮汁培养基上，25 ℃培养7 d后从边缘打取直径0.5 cm的菌碟，菌丝面朝下分别接种于含3个浓度药剂的麦粒煮汁培养基平板中央，25 ℃恒温培养。每处理重复5次，以不加药剂的处理为对照，7 d后用十字交叉法[17]测量菌落直径。
试验分别于2012年2月和2013年1月在福建省莆田市荔城区新度镇青坨村双孢蘑菇棚进行。
2012年2月田间药效试验：双孢蘑菇品种为AS2796，采用床架式栽培，层架6层，每层面积12 m2(1.5 m×8 m)。各供试药剂用水稀释后，按有效成分计共设50%多菌灵WP 1 000、500、250 mg/kg， 75%百菌清WP 1 500、750、375 mg/kg，50%福美双WP 1 000、500、250 mg/kg，50%咪鲜胺锰盐WP 333、266、200 mg/kg以及空白对照共13个处理， 每小区12 m2，重复4次，随机排列。
2013年1月田间药效试验：双孢蘑菇品种及栽培方式 同2012年。因2012年试验结果表明，50%多菌灵WP 1 000 mg/kg、75%百菌清WP 1 500 mg/kg、 50%福美双WP 1 000 mg/kg及50%咪鲜胺锰盐WP 3种剂量的防效均较好，故在2013年试验中未设置上述药剂浓度，而是增加筛选了国内生产和使用量较大的三唑类杀菌剂43%戊唑醇SC和10%苯醚甲环唑WG。各供试药剂用水稀释后，按有效 成分计共设50%多菌灵WP 500、250、166.7 mg/kg， 75%百菌清WP 750、375、250 mg/kg，50%福美双WP 500、250、166.7 mg/kg，43%戊唑醇SC 143.3、86.0、61.4 mg/kg，10%苯醚甲环唑WG 33.3、20.0、14.3 mg/kg和空白对照共16个处理，每小区12 m2，重复4次，随机排列。
将供试浓度药液定量喷施于待覆土的定量土粒上(每m2菇床覆盖用土约25 kg，喷施药液1.5 L)，拌匀，保持土壤含水量约为70%，用塑料膜覆盖闷土24 h后进行覆土。于覆土7 d后分别进行第2次施药，将相同剂量药液均匀喷施于床面土粒上，以土粒湿润且不流进菌料内为度。
参照《农业部田间药效试验准则》[18]，从采收第1潮菇起开始调查，共调查3潮菇，采取全区调查方式，于每次采收时调查记录培养料上病菇菇粒数或菌团数(菇粒或菌团≥1 cm)，累计各小区的发病菇粒数，计算防治效果。
药剂处理同1.6节。从施药后开始每天观察有无药害出现，同时记录对蘑菇有益的影响。参照《农业部田间药效试验准则》[18]，调查记录各处理对蘑菇的药害情况，观察并记录各处理蘑菇出土时间、色泽、朵形，各处理每潮菇随机测量4个点(每个点1 m2)的产量及20朵菇的质量，计算各处理单位面积产量(kg/m2)及单菇质量(g)。
根据各处理中蘑菇褐腐病菌菌落直径的平均净增长值，按公式(1)计算抑制率，利用DPS软件，分别建立药剂质量浓度自然对数值(x)和抑制率几率值(y)之间的回 归关系，计算各供试药剂的毒力回归方程、EC50值、相关系数及其95%置信区间[17, 19, 20]。 根据杀菌剂对蘑菇褐腐病各处理区与对照区的病菇粒数，按公式(2)计算防治效果，并计算4次重复的平均值。根据各处理中双孢蘑菇菌落直径的平均净增长值，按公式(1)计算各处理对双孢蘑菇的抑制率，并计算5次重复的平均值，评价杀菌剂对蘑菇的安全性[21]。采用DPS软件按Duncans新复极差法进行差异显著性分析。
抑制率/%=[(对照菌落平均净增长直径-处理菌落平均净增长直径)/对照菌落平均净增长直径]×100 (1)
防治效果/%=[(对照区病菇数-处理区病菇数)/对照区病菇数]×100 (2)
7种杀菌剂对蘑菇褐腐病菌的室内毒力测定结果(表 1)表明：咪鲜胺、苯醚甲环唑、多菌灵、戊唑醇、百菌清和噻菌灵对蘑菇褐腐病菌的抑制作用均较强， EC50值在0.024 5~0.296 mg/L之间，而福美双的抑制作用较弱，EC50值为88.0 mg/L。
 | 表 1 供试7种杀菌剂对蘑菇褐腐病菌的毒力 Table 1 Toxicity of 7 fungicides against M.perniciosa |
5种杀菌剂对双孢蘑菇的室内安全性测定结果(见表 2)表明：50%多菌灵WP对W192、AS2796及姬松茸A 3种双孢蘑菇菌丝生长的抑制作用均较弱，仅0.16 mg/L处理对W192菌株的菌丝生长有一定的抑制作用；75%百菌清WP 3个浓度处理对3种双孢蘑菇菌丝生长的抑制作用均较弱； 50%福美双WP及10%苯醚甲环唑WG 3个浓度处理对3种双孢蘑菇菌丝生长的抑制作用均较强；43%戊唑醇SC 3个浓度处理对W192的抑制作用均较强，其0.06和0.12 mg/L处理对AS2796及姬松茸A的抑制作用较弱，0.24 mg/L处理对AS2796和姬松茸A有一定的抑制作用。
| 表 2 供试5种杀菌剂对双孢蘑菇的室内安全性评价 Table 2 Safety evaluation of 5 fungicides to A.bisporus in lab |
2012年田间试验结果见表 3。从中可看出： 除75%百菌清WP 375 mg/kg处理组对蘑菇褐腐病防效稍差外，其余各药剂处理组防效均较好；50%多菌灵WP 1 000 mg/kg、75%百菌清WP 1 500和
| 表 3 供试4种杀菌剂对蘑菇褐腐病的田间防效及对双孢蘑菇的安全性 (2012年)
Table 3 Field control efficacy of 4 fungicides against M.perniciosa and their biological safety to A.bisporus (2012) |
750 mg/kg、 50%福美双WP 1 000和500 mg/kg处理组对蘑菇出菇有一定的影响，出菇时间分别推迟了 2~7 d，其余各处理组对出菇时间均无显著影响；50%多菌灵WP 500和250 mg/kg、75%百菌清WP 750 mg/kg、50%福美双WP 500 mg/kg、50%咪鲜胺锰盐WP 3种剂量处理与对照相比均有显著的增产效果，其余各处理组对蘑菇产量影响均不显著；所有供试药剂各处理对蘑菇的色泽、朵形及单菇质量均无显著影响。
2013年田间试验结果见表 4。从中可看出：50%多菌灵WP 500和250 mg/kg、75%百菌清WP 750和375 mg/kg、50%福美双WP 500 mg/kg、43%戊唑醇SC 143.3 mg/kg、10%苯醚甲环唑WG 33.3 mg/kg处理对蘑菇褐腐病的防效较好，均在80%以上；75%百菌清WP 750 mg/kg、50%福美双WP 500 mg/kg、43%戊唑醇SC 3种剂量以及10%苯醚甲环唑WG 33.3 mg/kg处理均会造成出菇推迟，其余各处理组对蘑菇出菇时间影响不明显；50%多菌灵WP 500 mg/kg、75%百菌清WP 750 mg/kg处理组蘑菇增产明显，增产率分别为8.06%和6.04%，而43%戊唑醇SC 143.3和 86.0 mg/kg处理组蘑菇减产显著，减产率分别为20.54%和13.19%，10%苯醚甲环唑WG 33.3 mg/kg处理组减产率为4.73%，但与对照相比差异不显著，其余各处理对蘑菇产量影响均不明显；供试药剂各处理组对蘑菇的色泽、朵形、单菇质量均无显著影响。
比较2年的试验结果发现，各药剂的防效均随着施药剂量的增加而增加，呈正相关关系。2012年50%多菌灵WP 500和250 mg/kg、75%百菌清WP 750和375 mg/kg、50%福美双WP 500和250 mg/kg 处理对蘑菇褐腐病的防效均优于2013年，这可能与2013年蘑菇褐腐病发生更严重有关。
| 表 4 供试5种杀菌剂对蘑菇褐腐病的田间防效及对双孢蘑菇的安全性 (2013年)Table 4 Field control efficacy of 5 fungicides against M.perniciosa and their biological safety to A.bisporus (2013) |
由于蘑菇褐腐病菌和蘑菇具有一定的生物同源性，因此在筛选防治蘑菇褐腐病的杀菌剂时须同时考虑防效及对蘑菇生长的影响。本研究表明，苯并咪唑类的多菌灵对蘑菇褐腐病菌毒力较强，同时对蘑菇较安全，50%多菌灵WP对田间蘑菇褐腐病具有较好的防治效果，且250~500 mg/kg剂量处理时具有一定的增产作用，这与张桂香等[22]的研究结果较一致，故50%多菌灵WP 250~1 000 mg/kg可考虑用于防治蘑菇褐腐病。咪唑类杀菌剂噻菌灵、咪鲜胺对蘑菇褐腐病菌毒力较强，且均已获准登记用于防治蘑菇褐腐病，本研究中50%咪鲜胺锰盐WP对田间蘑菇褐腐病具有较好的防效，且对蘑菇朵形、色泽无显著影响，故50%咪鲜胺锰盐WP 200~333 mg/kg也可考虑用于防治蘑菇褐腐病。室内研究表明，百菌清对蘑菇褐腐病菌的毒力较强，且对蘑菇较安全；而田间试验表明，1 500 mg/kg处理会造成出菇推迟及减产。张桂香等[22]研究发现，75%百菌清WP在 2 400~1 200倍液(有效成分质量分数为312.5~625 mg/kg)时均可对蘑菇造成一定的减产，而范建奇等[23]的研究表明，70%百菌清WP 2 400倍液(有效成分质量分数312.5 mg/kg)对蘑菇有增产作用。分析这可能与施药前用于覆土的土壤含水量不同而使得施药量不同有关。因此百菌清在用于防治田间蘑菇褐腐病时有一定的药害风险，建议其使用剂量以有效成分质量分数为375 mg/kg较为合理。
苯醚甲环唑和戊唑醇对蘑菇褐腐病菌的室内毒力较强，但同时对蘑菇生长的抑制作用也较强，安全性较差，使蘑菇减产明显，因此不适宜作为防治蘑菇褐腐病的药剂，这与温志强等[11]的研究结果一致。福美双对蘑菇褐腐病菌的毒力较差，安全性也较差，也不宜用于防治蘑菇褐腐病。此外，从各杀菌剂对双孢蘑菇的室内安全性试验结果还可看出，同一杀菌剂对不同品种蘑菇的抑制作用也存在一定的差异，如菌株W192对多菌灵、福美双和戊唑醇最敏感，AS2796次之，而姬松茸A相对较不敏感，因此实际生产中不同品种蘑菇对杀菌剂的敏感性还需进一步验证。
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