2013, Vol. 15 
羧酸酯类化合物因具有不同的生物活性而应用广泛，特别是其对农作物病虫害的防治效果更吸引了许多农药化学家的关注[1]，其中苯甲酸酯类化合物多在医药、食品、日用化学品中作为防腐剂使用[2, 3]。目前该类化合物作为农药研发方面的报道还较少，已经商品化的主要有嘧啶氧(硫)苯甲酸酯类除草剂[4, 5]及嘧啶苯甲酸酯类杀虫剂，后者具有良好的杀虫、杀螨和杀线虫活性[6]。有研究表明，4-碘-2-[3-(4-甲氧基-6-甲基-1,3,5-三嗪-2-基)脲磺酰]苯甲酸酯具有优异的除草活性[7]；3,5-二硝基-4-氯苯甲酸酯可完全控制番茄早、晚期的枯萎病，若将其与多菌灵复配使用，则能防治由镰刀菌引起的小麦干萎病[8]；此外，潘志针等研究发现，3,4-二羟基苯甲酸庚酯对蘑菇酪氨酸酶具有高效的抑制作用，并对菜青虫有触杀作用[9]；王勇等从吸水链霉菌BOS-013菌株中分离筛选出了一种对水稻稻瘟病病原菌 Phyricularia oryzae Cav.具有较高杀菌活性的化合物长白霉素，经鉴定其为1,2,4-苯三甲酸酯类化合物[10, 11]；黄均艳等借鉴长白霉素结构中的戊酯结构，以一元取代苯甲酸和异戊醇等为原料，合成出了对稻瘟病活体防效为80%的化合物4-氯苯甲酸异戊酯(500 μ g/mL),以及对灰霉病活体防效为50%的苯甲酸叔戊酯(500 μ g/mL)[12, 13]。为了进一步探究该类化合物的抑菌活性，笔者设计合成了具有不同取代基的二取代和三取代苯甲酸酯类新化合物，其中 3a和3b 采用先合成苯甲酰氯再与异戊醇反应的分步法合成， 3c~3n 则采用在浓硫酸催化下的酯化反应合成。通过1H NMR、IR、GC-MS对其结构进行了确证，并测定了其对几种病原菌的离体和活体杀菌活性。合成路线见 Scheme 1和Scheme 2 。
 | Scheme 1 |
 | Scheme 2 |
WD-9403A型荧光-紫外分析仪； Spectrum 65型傅里叶红外光谱仪(KBr压片法)；BRUKER 600MHz 核磁共振波谱仪(TMS 为内标，溶剂为CDCl3)；AGILENT 6890-5973N 气-质联用仪[HP-5MS色谱柱(30 m×250 μ m×0.25 μ m)，含5%苯甲基硅氧烷;载气为氦气,流速1 mL/min；柱温初温100 ℃，升温速率15 ℃/min，终温280 ℃保留2 min；进样口温度230 ℃；分流模式进样，分流比40 ∶1；辅助线温度285 ℃；采集方式为扫描，扫描范围35~520 mAU；四级杆温度150 ℃；离子源温度230 ℃；电离方式为EI]。
二取代和三取代苯甲酸、异戊醇及其他试剂均为市售分析纯或化学纯，其中异戊醇经3A分子筛脱水处理后使用，二氯甲烷用五氧化二磷干燥，N,N-二甲基甲酰胺(DMF)和N,N,N′,N′-四甲基乙二胺(TMEDA)经氢化钙回流2 h并减压蒸馏后使用。对照药剂95%百菌清(chlorothalonil)原药，新沂市飞皇化工有限公司；97%咪鲜胺(prochloraz)原药，江苏辉丰农化股份有限公司；95%腐霉利(procymidone)原药，北京绿农科技有限公司；95%啶酰菌胺(boscalid)原药，天津联合益农科技有限公司；60%井冈霉素(validamycin)原药，武汉科诺生物科技股份有限公司。
水稻稻瘟病菌Piricularia oryzae Cav.、水稻纹枯病菌Rhizoctonia solani Kühn、大豆根腐病菌Fusarium oxysporum Schlecht、番茄早疫病菌Alternaria solani(ELL.Martin) Sor.、半裸镰胞病菌Fusarium.semitectum Brek.& Rav、小麦根腐病菌Bipolari sorokiniana(Sacc.) Shoem、黄瓜炭疽病菌Colletotrichum orbiculare(Berk.Et Mont) Arx、辣椒枯萎病菌Fusarium annuum Leon和黄瓜灰霉病菌Botrytis cinerea Pers，均由沈阳农业大学植物保护学院农药科学教研室采集、分离、培养并保存。
依据农药室内生物测定准则，采用菌丝生长速率法[17]测定目标化合物在50 μ g/mL下对8种供试病原真菌的杀菌活性。
以百菌清为对照药剂，对初筛活性较好的化合物进行杀菌毒力测定。设100、50、25、12.5 μ g/mL 4个浓度梯度，利用Excel 软件按照文献[18]的统计方法计算EC50值。
叶片病情分级标准[19]：0级，无病斑；1级，病斑占整个叶面积的5%以下；3级，病斑占整个叶面积的5%~15%；5级，病斑占整个叶面积的15%~25%；7级，病斑占整个叶面积的25% ~50%；9级，病斑占整个叶面积的50%以上。
采用水稻活体盆栽试验法[20]。试验设16个处理，包括14个目标化合物、对照药剂咪鲜胺原药和空白对照。每个处理重复5次。选择生长状况良好的3叶期盆栽水稻苗，先在其叶片上喷施500 μ g/mL的供试药液，自然风干2 h后，喷洒培养好的稻瘟病菌孢子悬浮液(2×105孢子/mL)，将其移至室温25 ℃、光照时间12 h/d的人工气候室中培养，保持湿度在90%左右。7 d后当空白对照组发病率达50%以上时，调查病害发生情况(调查旗叶及其以下2片叶)，分别按(1)和(2)式计算病情指数和防治效果。
叶片病情分级标准[20]：0级，整株无病；1级，出现褐点病斑；3级，出现典型纺锤形病斑，病斑面积占整叶面积的5%以下；5级，典型病斑，病斑面积占整叶面积的6% ~25%；7级，典型病斑，病斑面积占整叶面积的26% ~50%；9级，典型病斑，病斑面积占整叶面积的50%以上。
参考文献[21]方法。试验设16个处理，包括14个目标化合物、空白对照以及对照药剂井冈霉素，每个处理重复5次。选取生长状况良好的4叶期盆栽水稻苗，先在其叶片上喷施500 μ g/mL的供试药液，自然风干2 h后，用接菌针挑取相同大小、在PDA培养基上培养的水稻纹枯病菌菌斑接种于每株叶片上，将其移至室温28 ℃、光照时间12 h/d的人工气候室中培养，保持湿度在90%左右。7 d后，视空白对照组的发病情况，调查病害发生情况，分别按(1)和(2)式计算病情指数和防治效果。
叶片病情分级标准[21]：0级，全株无病；1级，第4叶片及其以下各叶鞘、叶片发病(以剑叶为第1片叶)；3级，第3叶片及其以下各叶鞘、叶片发病；5级， 第2叶片及其以下各叶鞘、叶片发病；7级，剑叶叶片及其以下各叶鞘、叶片发病；9级，全株发病，提早枯死。
目标化合物的理化性质和收率及质谱数据见表 1，1H NMR及IR数据见表 2。谱图数据与化合物结构吻合较好。虽然利用酰氯与醇反应收率较高，产物较易纯化，但制备酰氯时需要高温减压蒸馏，且酰氯具有强烈的刺激性和毒性，因此用该方法只合成了2个化合物( 3a,3b ),其余化合物均改用了在浓硫酸催化下的酯化反应，反应操作更为简便，但产率有所降低，产物需经柱层析纯化。
 | 表 1 目标化合物的理化数据及质谱数据 Table 1Table 1 Physicochemical and GC-MS data of target compounds |
| 表 2 目标化合物的核磁共振氢谱及红外光谱数据 Table 21H NMR and IR data of target compounds |
菌丝生长速率法测定结果(表 3)表明，在药剂质量浓度为50 μ g/mL时，目标化合物对8种病原真菌的杀菌活性并不高，其中只有5个化合物的抑制率达50%以上，活性最高的为 3l ，且 3l 对8种病原真菌表现出的杀菌活性普遍高于其他化合物。对初筛中杀菌活性较好的5个化合物进行了毒力测定，结果见表 4。在离体环境下，相比较而言化合物 3l和3f 的杀菌活性较好，其中 3l 对水稻纹枯病菌的EC50值与对照药剂百菌清相当。
| 表 3 目标化合物对8种植物病原真菌菌丝生长的抑制率 (50 μ g/mL) Table 3 Inhibition rate of target compounds against eight fungi at 50 μ g/mL |
| 表 4 部分目标化合物对4种病原真菌的毒力 Table 4 Toxicity of some title compounds against four fungi |
结果(表 5)表明：在对黄瓜灰霉病的活体盆栽试验中，多数化合物表现出了较高的防治效果，其中化合物 3a、3i、3j、3l、3m 的活性均高于对照药剂腐霉利，且 3j和3l 的活体防效均达90%以上， 3j 的防效与啶酰菌胺相当。初步构效关系分析发现，苯环上2-位和4-位为甲基时杀菌活性较高，苯环上含有硝基时也有利于活性的提高；取代基所处位置不同其杀菌效果也不同，如 3j与3g ，甲基在2,4-位时比在2,3-位时的杀菌活性高。
在对水稻稻瘟病的活体盆栽试验中，只有化合物 3e、3f、3j和3m 的防效超过了60%，其中 3e和3f 较为突出，防效达89%以上， 3e 的杀菌活性略高于对照药剂咪鲜胺。初步构效关系分析发现，甲基、甲氧基和氯原子在苯环的2-位取代时有利于杀菌活性的提高。
目标化合物对水稻纹枯病菌的活体防效虽然普遍较低，但 3a、3b、3g 的杀菌活性都达到60%以上，高于对照药剂井冈霉素。初步构效关系分析发现，取代基为2,4-2Cl和2,3-2CH3时杀菌活性较高。
| 表 5 目标化合物对3种病害的活体防效 (500 μ g/mL) Table 5The control efficacy of target compounds against three fungi at 500 μ g/mL in vivo |
综上所述，不同化合物对于不同病原菌的杀菌活性存在较大差异，且离体和活体杀菌活性也不尽相同。如 3l 对水稻纹枯病菌的离体杀菌活性很好，但活体防效并不理想。由于药剂在植物上具有吸附、吸收、传导和代谢等特征，从而使活体生物测定试验受到许多因素的影响。若药剂未完全附着到叶片上，而是有部分流失，就会导致有些药剂的活体杀菌活性测定结果不如离体测定结果高。而 3e和3j 对病原真菌的离体杀菌活性并不高，但其活体生物测定结果却很好，这可能是由于这些化合物除具有杀菌活性以外可能还具有其他作用，如诱导植株产生抗病性、降低病菌侵染能力等，具体还有待进一步研究确证。
本研究发现，部分供试新化合物对3种病原菌的活体防效明显高于腐霉利和井冈霉素，有进一步研究的价值；另一方面，表明病原真菌对这些在生产中已使用多年的对照药剂已产生了一定的抗药性，有必要不断研发新型药剂来满足生产上对真菌病害防治的需要。
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