茄(Solanum melongena L.)在世界范围内广泛栽培^[1], 目前大多栽培品种为紫茄。作为为数不多富含花青素的紫色蔬菜, 紫茄果皮的颜色和均匀程度直接影响茄果的商品价值^[2]。花青素是果实着色的物质基础^[3], 其合成和积累容易受到光照、温度等环境条件的影响^[4]。研究表明, 品种不同, 茄果中花青素合成受光诱导的敏感程度也不同, 据此, 茄可被分类为光敏感型和光不敏感型^[5]。在套袋模拟黑暗条件下, 光敏感茄果皮无花青素积累, 呈白色; 而光不敏感茄果皮着色不完全依赖光, 即使完全遮光, 果皮中仍有花青素积累, 呈现出不同程度的紫色^[6-7]。在生产中, 早春设施栽培的弱光环境常导致茄果皮着色不均, 因此, 培育光不敏感茄对于提高茄商品价值意义重大。

在传统的茄育种工作中, 选择光不敏感茄品种主要是在开花后对果实进行套袋, 摘袋后依据表型进行鉴定。前期田间观察发现, 萼片下果皮是一个特殊位置, 无法接触光照, 光敏感茄萼片下无花青素积累, 颜色为白色或绿色, 而光不敏感茄萼片下有花青素积累, 颜色表现为不同程度的紫色, 这与套袋验证结果一致。因此, 通过萼片下颜色可判断茄果皮着色对光的敏感程度^[7-8]。这种方法往往需要到结果期才可进行选择, 周期长, 筛选效率较低, 且费时费力。分子标记辅助选择能极大地缩短育种年限, 提高育种效率^[9]。目前, 茄中与果皮着色光敏性相关的报道较少。陈雪平^[10]利用萼片下果色不同的茄构建F₂群体, 并构建了总图距为1 454.63 cM、平均图距0.82 cM的高密度遗传图谱, 在第6连锁群上检测到3个大小为1.105~3.001且与萼片下果色相关的QTL, 贡献率均在10%以上, 均表现为主效QTL。He等^[6]通过数量遗传研究方法对果萼下颜色为浅紫色和绿色的茄及其F₂进行遗传规律探究, 发现茄果萼下颜色主要由以加性效应为主的2对主基因控制, 在F₂中2对主基因遗传率为93.96%, 并在第6连锁群上发现1个与果萼下颜色极显著相关的SSR标记E06-5。Toppino等^[11]在第5和第10染色体上定位到2个控制萼片下果皮颜色的QTL位点Undcal10和Undcal05, 在Montanaso Lombardo试验地的贡献率分别为77.00%和13.80%。目前关于茄萼片下颜色相关标记已有相关成果, 但仍需进一步研究。

本研究以果皮着色光敏感茄'蓝山禾线'和光不敏感茄'145'及其后代为材料, 利用群体分离分析法(BSA)混池测序, 开发茄果皮着色光敏性相关分子标记, 并经F₂群体材料及茄品种进行验证, 旨在为加快优质茄品种的选育提供技术支持, 为解析茄萼片下紫色形成的分子机制提供参考。

1 材料与方法 1.1 供试材料

以光敏感茄品种'蓝山禾线'、光不敏感茄品种'145'以及30个光敏感和30个光不敏感F₂单株的DNA为BSA混池测序的材料, 以192个F₂单株和123个茄品种为验证标记的材料。所有供试材料于2019年12月播种于上海航育种子基地(121.504°E, 31.049°N), 常规方法种植和管理。亲本材料及F₂群体由上海交通大学园艺植物资源与种质创新团队提供; 123个品种来源于上海市农业科学院(表 1)。

1.2 试验方法

1.2.1田间表型鉴定

在开花14 d后对所有单株进行表型鉴定。选取每个单株中较大的茄果实, 掀开萼片, 观察萼片下果皮的颜色。若萼片下果皮颜色为紫色或淡紫色, 即有花青素积累, 则归类为光不敏感型; 若萼片下果皮颜色为白色或绿色, 即无花青素积累, 则归类为光敏感型。

1.2.2 DNA提取

采用CTAB法提取茄材料基因组DNA^[12], 用琼脂糖凝胶电泳检测DNA质量。

1.2.3 混池构建及测序分析

提取亲本'蓝山禾线'和'145'DNA各1份, 光敏感和光不敏感的F₂单株DNA各30份, 构建光敏感型和光不敏感型DNA混池。样品基因组DNA检测合格后, 每个混池中DNA等量混合, 利用超声波将亲本和混池DNA序列片段化形成随机片段, 对片段化的DNA依次进行末端修复、3′端加A、连接测序接头, 再利用磁珠吸附富集基因组长度为400 bp左右的片段, 经过PCR扩增形成测序文库。建好的文库先进行文库质检, 质检合格后再用Illumina HiSeq TM平台进行测序, 测序策略为Illumina PE150, 总测序读长为300 bp。建库、简化基因组测序由上海美吉生物医药科技有限公司完成。比对参考基因组(http://http://eggplant.kazusa.or.jp/)进行变异检测分析。根据混池中基因型频率的差异, 在全基因组进行混池关联分析, 筛选与目标性状相关联的位点, 获得目的基因候选区间。

1.2.4 dCAPS标记开发

在BSA重测序获得的初定位区间内, 挑选2亲本中相异且纯合的SNP位点, 均匀设计引物30对(表 2)。利用dCAPS Finder 2.0 Program(http://helix.wustl.edu/dcaps/dcaps.html)进行dCAPS引物开发和内切酶的选择, 同时利用Primer Premier 5.0软件设计相应的下游引物。引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

分别以两亲本基因组DNA为模板进行PCR扩增, 并选择相应内切酶进行酶切, 通过80 g · L^-1聚丙烯酰胺凝胶电泳对酶切产物进行检测, 选择能在双亲中表现出不同条带的多态性引物。PCR扩增体系10 μL: 0.5 μL模板DNA, 5 μL Easy Taq, 4 μL ddH₂O, 正、反向引物各0.25 μL(10 μmol · L^-1)。扩增程序为: 98 ℃ 10 s; 98 ℃ 10 s, 55 ℃ 30 s, 72 ℃ 40 s, 35个循环; 4 ℃保存。PCR产物经15 g · L^-1琼脂糖凝胶电泳检测合格后, 分别对相应PCR产物进行酶切。酶切体系10 μL: 2 μL PCR产物, 0.2 μL限制性内切酶(10 U · mL^-1), 1 μL Buffer, 6.8 μL ddH₂O, 酶切体系置于37 ℃恒温2 h, 即可获得酶切后产物。

1.2.5 dCAPS标记验证

分别以192份茄F₂单株及123个茄品种的基因组DNA为模板, 以开发出的分子标记为引物进行PCR扩增, 酶切并电泳检测。

2 结果与分析 2.1 田间表型统计

用于dCAPS多态性引物验证的192个F₂单株中, 有148份光敏感型, 44份光不敏感型, 表型如图 1所示。采用卡方检验, 发现F₂群体表型符合3 ∶ 1分离比例, 说明茄光敏性是质量性状。在123个茄子种质资源中, 85份为光敏感型, 38份为光不敏感型(表 1)。通过田间观察发现, F₂群体中不同光不敏感茄萼片下花青素积累量不同, 表现为紫色程度不一: 有些单株萼片下为淡紫色, 有些为紫红色, 有些为深紫色。这一现象也出现在不同品种中。推测萼片下果皮着色光敏感是质量性状, 而敏感程度是数量性状。

2.2 茄果皮着色光敏性基因候选区段的获得

BSA-seq结果显示: 当置信度为0.99时, 在10号染色体上共得到3个定位区间, 定位区域为87.080~88.090 Mb、91.475~92.475 Mb、92.785~93.785 Mb, 总长度为3.01 Mb。基于基因组数据分析, 区间内共得到54个SNP, 9个Indel。

2.3 引物特异性检测

分别以光敏感亲本'蓝山禾线'与光不敏感亲本'145'的基因组DNA为模板, 进行特异性检测。部分结果如图 2所示, 有6对引物在亲本间表现多态性, 10对引物在亲本间带型无区分, 8对引物在亲本间表现杂带, 6对引物无条带。

在该3.01 Mb区段设计的引物中, dCAPS-9在差异亲本中表现出较好的特异性。测序结果(图 3)显示: 在纯合光敏茄基因组中该位点SNP为G, 纯合光不敏感茄基因组中该位点SNP为A, 利用dCAPS技术, 在该SNP附近2 bp处引入突变碱基A, 从而引入1个EcoRⅠ的酶切位点。理论上由光敏茄DNA扩增出来的谱带有1个酶切位点, 可以被EcoRⅠ限制性内切酶切成17和113 bp, 光不敏感茄DNA扩增出来的谱带无酶切位点, 条带长度为120 bp。

使用亲本及F₁对该dCAPS标记进行验证, 结果(图 4)显示, 扩增后酶切共有3种带型: A(113 bp)、B(120 bp)、H(113+120 bp), 而17 bp的条带在胶上基本不可见。扩增并酶切后的条带大小与引物设计时的一致。

2.4 标记在F₂分离群体中的检测

由表 3可见: 在茄F₂群体的44份光敏材料中, 有41份材料酶切后带型为A, 分子标记的检测结果与表型的准确率达到93.2%;148份光不敏感材料中, 48份材料酶切后带型为B, 96份材料酶切后带型为H, 分子标记的检测结果与表型的准确率达到100.0%, 部分检测结果如图 5所示。在192个F₂群体中, 分子标记的检测结果与表型的平均准确率达到98.4%。F₂分离群体中基因型分布满足1∶2∶1, 符合孟德尔遗传规律, 这也再次验证了茄果皮着色光敏性这一性状为单基因控制的显性遗传。

2.5 标记在茄品种中的检测

由表 4可见: 在用于标记检验的85份光敏感茄品种中, 82份材料酶切后带型为A, 准确率为96.5%;38份光不敏感茄品种中, 31份材料酶切后带型为B或H, 准确率为81.6%, 部分检测结果如图 6所示。在123份茄品种中, 分子标记的检测结果与表型的平均准确率达到91.9%。

3 讨论

茄作为仅次于马铃薯和番茄的第三大茄科作物, 具有重要的经济价值。但由于茄子栽培种内遗传背景狭窄^[8]、重要经济性状的关联标记开发和基因挖掘滞后等原因, 相较于其他已经构建高密度连锁图谱的茄科作物, 茄中分子遗传研究相对落后。目前, 茄子中用于遗传多样性研究和基因图谱研究的分子标记有SSR、ISSR、RAPD、AFLP和SRAP^[13-15]等类型, 且多集中在前2种类型。自2011年马铃薯基因组序列被公布以来^[16], 其他茄科作物全基因组测序工作陆续开展, 2014年茄基因组测序草图完成^[17], 部分基因组测序的完成为茄分子标记开发及基因定位等提供了新的途径。对不同茄种质资源进行全基因组重测序并挖掘全基因组SNP位点, 开发重要经济性状的关联标记, 构建遗传连锁图谱定位重要农艺性状的主效基因, 已成为茄分子遗传育种研究中一个重要研究内容。

本研究中所使用的dCAPS标记是基于亲本重测序数据开发获得, 更具有针对性, 且准确有效。董淑芳等^[18]采用Super BSA测序技术获得1个与粉红色番茄高度相关的SNP位点, 并根据该位点开发出1个符合度达到95%以上的dCAPS标记; 迟莹莹等^[19]基于西瓜全基因组重测序数据在普通栽培西瓜品系'W1-1'和黏籽西瓜品系'PI186490'亲本间开发了450个CAPS分子标记, 筛选出具有多态性的CAPS标记200个, 并通过QTL分析定位到与种子性状相关的QTL位点15个; 王学征等^[20]利用群体分离分析法(BSA)与双亲材料基因重测序相结合, 将甜瓜果面沟基因定位于第11号染色体后半段, 并在定位区域上开发出2对CAPS标记, 分子数据与田间性状符合率为74.67%和75.99%。

在众多的分子标记方法中, SNP标记遗传稳定性高, 位点分布广泛且富有代表性, 已成为当前研究最多的分子标记之一^[21-22]。酶切扩增多态性序列(CAPS)标记和衍生限制性内切酶多态性序列(dCAPS)标记作为SNP标记^[23], 因为具有共显性、低成本、操作简单、检测的样品量较少等优点, 被广泛应用于辅助育种中^[24]。随着高通量测序技术的发展, 大量SNP位点被挖掘, CAPS分子标记技术已经在柑橘^[25]、玉米^[26]、木薯^[27]、黄麻^[28]等作物中得到广泛应用。

分子标记的准确性是分子辅助育种的关键, 直接决定着育种的成功与否^[29]。本研究中, dCAPS-9在茄F₂分离群体中有着更高的筛选准确率, 但在品种的群体验证中还有少量个体表型鉴定与基因型鉴定结果不一致, 推测这些个体可能为重组单株, 或参照茄基因组新测序结果设计的引物存在检测不完全准确的问题等。

本研究以光敏感和光不敏感茄为研究对象, 基于茄全基因组重测序, 结合BSA混池构建和关联分析, 在第10号染色体上鉴定出总长度为3.01 Mb的3个候选区段, 选择候选区域内的差异SNP位点, 开发出1个衍生限制性内切酶多态性标记dCAPS-9, 在192个F₂单株及123个茄品种材料中的检测准确率分别达到98.4%和91.9%, 可以很好地鉴别茄F₂群体及茄品种的光敏性, 显著提高了光不敏感茄选择的准确性和育种效率。研究结果为茄果色光敏性辅助选择奠定了理论依据。后期试验着力于将标记与群体相结合, 通过图位克隆等方式进一步精细定位茄中光诱导花青素合成相关性状的主效基因。