调理肉制品又称预制肉制品, 是以畜禽或水产品为主要原料, 添加适量的调味料或辅料, 经适当加工, 以包装或散装形式在一定温度下储存销售, 可直接食用或经简单加工即可食用的肉制品^[1-2]。因调理肉制品食用方便, 免除了清洗、切割、调理等步骤, 更适应现代社会的快节奏生活, 其已成为我国城市人群和发达国家消费的主要肉制品种类^[2]。随着冷链技术的成熟, 冰箱和微波炉的普及, 调理肉制品逐渐从方便储存、方便保鲜开始向家庭菜肴转变, 超市常见的有青椒肉丝、红烧肉、黄焖鸡、宫保鸡丁等^[2-4]。荠菜猪肉馅是以猪肉和荠菜为主要原料, 经分割、整形、调制、搅拌而成的中式调理肉制品^[5], 其味道鲜美、营养丰富, 但该产品在工厂的生产过程中未经热杀菌处理, 因此货架期较短, 难以进行长途运输, 大大限制了该产品的销路。

对于中式调理肉制品, 我国主要使用天然的抑菌物质或气调包装以达到保鲜效果^{[3-4, 6-8]}, 如使用乳酸链球菌素能将生鲜青椒肉丝的保鲜期延长至10 d; 气调包装可以将烤鸭腿的货架期延长至21 d等。气调包装(MAP)也称置换气体包装, 采用具有气体阻隔性能的包装材料, 根据实际生产需求充入不同比例的CO₂、N₂等混合气体, 调节贮藏的气体环境从而达到食品保鲜的目的^[9]。气调包装能够保持食品原有的口感、色泽及营养物质, 受到众多食品生产者的青睐^[10], 是一项应用范围越来越广泛的食品包装新技术。目前国内外关于气调包装在调理肉制品方面的研究以单一的肉类为主^{[7-8, 11-13]}, 如调理牛排、酱卤鸭翅等, 但在肉、菜相结合菜肴方面的研究较少, 仅在黄桂龙^[14]的研究中涉及到了猪肉和少量淀粉的结合。由于地区饮食的差异, 国外更无相关经验可供参考, 因此, 气调包装在肉馅类菜肴的应用上仍有较大的研究空间。

荠菜猪肉馅为冷藏生鲜食品, 据国家标准《冷藏食品物流包装、标志、运输和储存:GB/T 24616—2009》规定, 冷藏食品在冷链物流过程中的中心温度必须维持在8 ℃以下, 然而在冷链运输过程中, 由于装卸货物的实际需要, 冷藏车需要开门作业, 此时车门处产生强烈的热湿交换, 使得贮藏环境温度上升^[15-16]。研究表明, 有塑料门帘的冷藏车在开门后2 min内温度即由-10 ℃上升至8 ℃^[17]。到了销售终端, 根据国家标准《超市销售生鲜农产品基本要求:GB/T 22502—2008》, 超市销售生鲜产品所配备的冷藏柜一般为0~5 ℃, 但是在销售过程中因消费者取货而多有变动。研究表明, 环境温度每升高2 ℃, 卧式敞开式冷藏陈列柜中的食品温度平均升高0.1~0.3 ℃^[18], 导致其实际温度高于设定温度。因此, 为更实际反映产品在流通及销售过程中的情况, 从而更好指导食品企业的生产, 本试验将贮藏温度设定为8 ℃。

近年来, 高通量测序借助16S rDNA/rRNA分析技术能够较为全面地检测样品中的微生物种类, 有利于研究者准确分析菌群结构^[19]。因此, 本试验将荠菜猪肉馅进行气调包装, 在8 ℃条件下贮藏, 每天监测样品包装顶空气体组成的变化, 在采用传统的平板计数法对特定微生物进行计数的同时, 使用高通量测序技术分析荠菜猪肉馅贮藏过程中微生物菌群结构的变化, 旨在揭示贮藏末期样品的优势腐败菌, 并为气调包装在荠菜猪肉馅中的应用提供一定的理论参考。

1 材料与方法 1.1 材料与仪器

荠菜猪肉馅取自江苏省某食品有限公司。平板计数琼脂(PCA)、MRS培养基、VRBGA培养基、缓冲蛋白胨(BPW)、氯化钠均购自北京陆桥技术股份有限公司, 无菌均质袋购自青岛海博生物技术有限公司。

主要仪器有:气体分析仪(WITT OXYBABY6.0), 拍击式均质器(BagMixer, Interscience), pH计(METTLE TOLEDO), 气调包装机(ULMA, SMART500), 恒温恒湿箱(BINDER), PCR仪(9700型ABI GeneAmp^®), MiSeq测序仪(美国Illumina)。

1.2 试验方法 1.2.1 样品采集及贮藏

取若干袋新鲜制作的样品, 低温(小于4 ℃)运回实验室。原始样品为500 g规格的密封塑料袋包装, 平均分为5组, 其中1组不作任何处理, 作为对照组(CK), 其余4组采用不同气体比例的气调包装, 分别为100%N₂、30%CO₂+70%N₂、40%CO₂+60%N₂、50%CO₂+50%N₂, 每个处理3个重复。所有样品均置于8 ℃的恒温恒湿箱中贮藏, 每天取样进行相关指标的测定, 直至样品彻底腐败。

1.2.2 感官评定

由10人构成的感官评定小组, 每天对样品进行感官评定。评定内容包括包装外观、气味、组织状态、色泽、总体可接受度5个方面, 最高分为10分, 最低分为1分。评定结果取10人的平均值, 当综合评分小于5分时, 认为产品感官不可接受。具体评价指标见表 1。

1.2.3 气体比例测定

将气体比例测定仪的探头插入不同处理组的气调包装盒中, 测定气调包装盒顶空CO₂的气体比例, 每个处理3个重复。

1.2.4 pH值测定

参照《食品安全国家标准食品pH值的测定:GB5009.237 — 2016》的方法, 取5 mL均质后的处理液于灭菌离心管中, 加入45 mL pH7.0的去离子水, 振荡混匀后用pH计测定pH值。

1.2.5 微生物测定

菌落总数测定参照国家标准《食品微生物学检验菌落总数测定:GB4789.2—2016》方法进行; 乳酸菌数测定参照国家标准《食品微生物学检验乳酸菌检验:GB4789.35—2016》方法进行; 肠杆菌数测定参照国家标准《食品微生物学检验肠杆菌检验:GB4789.41—2016》方法进行, 结果均以lg(CFU·g^-1)表示。

1.2.6 DNA提取及高通量测序

每天取各处理组的样品5 g左右, 参照试剂盒完成样品基因组DNA的抽提, 并通过10 g·L^-1琼脂糖凝胶电泳检测。以提取的总DNA为模板, 对细菌的16S rDNA的V3—V4区设计特异引物并进行PCR扩增, 特异性引物为515F(5′-GTGCCAGCMGCCGCGG-3′)和907R(5′-CCGTCAATTCMTTTRAGTTT-3′)。反应程序为:95 ℃ 5 min; 95 ℃ 30 s, 55 ℃ 30 s, 72 ℃ 30 s, 共27个循环; 72 ℃ 5 min。将PCR产物用20 g·L^-1琼脂糖凝胶电泳检测, 使用凝胶回收试剂盒(AXYGEN公司)切胶回收PCR产物, 并用QuantiFluor^TM-ST蓝色荧光定量系统进行定量检测, 将PCR产物通过Illumina MiSeq PE250平台进行DNA测序。

1.3 数据处理

采用SAS V8.01软件的Duncan's多重比较进行差异显著性分析。采用GraphPad Prism 5(Version 5.01 2007)软件绘制折线图。将Illumina MiSeq PE250测序得到的PE reads根据overlap关系拼接, 同时对序列质量进行质控和过滤, 区分样本后进行物种分类学分析。基于分类学信息, 可以在各个分类水平上进行群落结构的统计分析。使用R语言工具绘制菌群结构组分图。

2 结果与分析 2.1 贮藏过程中气调包装顶空CO₂含量及荠菜猪肉馅pH值的变化

由图 1可见:气调包装组在贮藏初期均达到预设的气体环境, 100%N₂组的CO₂含量随贮藏时间延长而上升; 含CO₂的气调包装组(30%CO₂+70%N₂、40%CO₂+60%N₂、50%CO₂+50%N₂)CO₂含量0~3 d时不断下降, 3 d后CO₂含量随贮藏时间的延长而增加, 最终高于初始CO₂含量。0 d时样品pH值在6.5左右, 随着贮藏时间的延长, 样品pH值逐渐下降, 其中, 含CO₂的气调包装组样品pH值均低于不含CO₂气调包装组(CK和100%N₂组), CO₂含量高的气调包装组样品的pH值低于CO₂含量低的气调包装组。

2.2 不同气调包装荠菜猪肉馅在贮藏过程中感官品质的变化

从图 2可知:0 d时荠菜猪肉馅组织紧密, 富有弹性, 且荠菜呈鲜绿色, 猪肉油润有光泽, 贮藏前期样品的感官品质下降较为缓慢; 4 d时对照组样品的感官评分均低于各处理组, 对照组的肉馅颜色轻微发白, 荠菜略微发黄, 有涨袋倾向, 并且在“总体可接受程度”方面最先呈现“不可接受”, 其他处理组总体处于“勉强接受”, 其中50%CO₂+50%N₂处理组在包装外观方面优于其他处理组, 而在色泽气味等感官特性上与其他处理组无显著差异。值得注意的是, 4 d时, 所有样品的感官评分与2 d时相比有明显下降, 部分样品出现可被肉眼觉察的腐败症状; 6 d时所有样品均有明显的汁液渗出和涨袋现象, 已经完全腐败。

2.3 不同气调包装的荠菜猪肉馅在贮藏过程中微生物的数量变化

由图 3可见:样品初始菌落总数为10^4.6 CFU·g^-1左右, 说明样品在制作过程中被轻微污染; 对照组和30%CO₂+70%N₂组的菌落总数在贮藏过程中不断增加, 而100%N₂、40%CO₂+60%N₂、50%CO₂+50%N₂组的菌落总数在2 d时明显下降, 说明气调包装处理在此时具有一定效果; 3~4 d时, 气调包装组的菌落总数均大于10^5.5 CFU·g^-1, 感官评定结果表明此时的样品已经出现轻微的腐败症状; 5~6 d时, 样品的菌落总数均超过10^6.5 CFU·g^-1, 而我国《调理肉制品加工技术规范:NYT 2073—2011》规定菌落总数最高安全限量为10⁶ CFU·g^-1(4 ℃条件下), 说明此时样品已经完全腐败。含CO₂气调包装组(30%CO₂+70%N₂、40%CO₂+60%N₂、50%CO₂+50%N₂组)的乳酸菌数量在贮藏前期显著低于不含CO₂的处理组(对照组和100%N₂组), 尤其是50%CO₂+50%N₂组。2 d时, 40%CO₂+60%N₂、50%CO₂+50%N₂处理组的肠杆菌数低于其他处理组(对照组、100%N₂、30%CO₂+70%N₂组); 3 d时所有气调包装组肠杆菌的数量突增。50%CO₂+50%N₂组在整个贮藏过程中均对肠杆菌科有良好的抑制作用。

2.4 不同气调包装的荠菜猪肉馅在贮藏过程中菌群结构的变化

由图 4可见:对照组和气调包装组的菌群结构明显不同。1~2 d, 嗜冷菌(Psychrobacter sp.)为对照组的优势菌, 相对丰度达70%, 由于嗜冷菌是需氧菌, 其相对丰度随环境中氧气的减少而下降; 3 d时嗜冷菌的相对丰度只有5%, 同时, 肉食杆菌(Carnobacterium sp.)兼性厌氧, 其相对丰度由4%增加至35%左右; 5 d时肉食杆菌属和嗜冷菌属共同成为样品的优势菌群, 相对丰度分别占40%和30%, 另外还有4%左右的假单胞菌、乳球菌、链球菌等。4种气调包装组的菌群结构较为相似, 均以沙雷氏菌(Serratia sp.)、气单胞菌(Aeromonas sp.)为主要优势菌, 同时有乳球菌、肉食杆菌、假单胞菌、乳杆菌等, 但具体比例不同。1 d时, 含有CO₂的气调包装组(30%CO₂+70%N₂、40%CO₂+60%N₂、50%CO₂+50%N₂)优势菌均为气单胞菌和假单胞菌, 其平均相对丰度分别为9%和10%;3 d时肉食杆菌和沙雷氏菌相对丰度分别为6%和20%;5 d时, 50%CO₂+50%N₂组中的沙雷氏菌相对丰度略低于其他气调包装组, 乳球菌相对丰度(25%)高于其他气调包装组, 气单胞菌(12%)和肉食杆菌(5%)丰度相似, 沙雷氏菌(23%)丰度较低。

3 讨论与结论 3.1 贮藏过程中气调包装顶空CO₂含量及荠菜猪肉馅pH值的变化

本研究结果表明, CO₂含量在100%N₂组贮藏全程不断增加, 而在其他气调包装组中先下降再增加。CO₂含量增加可能是微生物在代谢过程中产生了CO₂, 而CO₂含量下降可能是CO₂溶解于肉中, 形成酸性物质, 从而降低样品的pH值^{[12, 20-22]}。

较低的pH值会营造酸性环境, 抑制部分微生物的生长, 从本文的感官评定结果上看, 高浓度CO₂引起的低pH值环境并没有破坏荠菜猪肉馅的食用品质, 因此50%CO₂+50%N₂组更有利于维持肉馅在贮藏过程中的新鲜度。

3.2 不同气调包装荠菜猪肉馅在贮藏过程中感官品质的变化

感官评定是衡量食品品质直接且重要的指标, 在消费者购买产品时起决定作用^[13]。Zhang等^[23]发现高CO₂气调包装在黄羽鸡的各项感官指标中得分最高。本试验结果显示, 50%CO₂+50%N₂处理组在包装外观方面优于其他处理组, 而在色泽气味等感官特性上与其他处理组无显著差异。

本试验发现, 4 d时所有样品的感官评分与2 d时相比有明显下降, 表明2~4 d是荠菜猪肉馅品质转变的关键时期, 对特定微生物的计数也支持这一结果; 6 d时样品汁液渗出可能是由于鲜肉里蛋白质持水力下降, 涨袋可能是厌氧产气菌的大量繁殖导致的。

3.3 不同气调包装的荠菜猪肉馅在贮藏过程中微生物的数量变化

本试验的样品初始菌落总数为10^4.6 CFU·g^-1左右, 略高于正常值, 这主要是由于荠菜猪肉馅在制作过程中未经热杀菌处理, 并且制作时的空气温度和湿度较高, 有利于细菌的繁殖。研究表明, 样品初始菌落总数对气调效果有较大影响, 当样品的初始菌落达到10⁵ CFU·g^-1时, 气调几乎没有效果^[24]。因此在生鲜调理肉制品的生产过程中, 降低产品的初始菌落总数从而延长产品货架期是非常必要的。

本试验发现CO₂能抑制肉馅中乳酸菌的生长, 且CO₂浓度越高抑制效果越好。这一结果与Zhang等^[23]在研究气调包装黄羽鸡的货架期时的结论基本一致。肠杆菌科细菌常与菌落总数共同指示食品的卫生状况^[25], 且被认为是食品在气调包装条件下的主要菌群, 因此, 我们测定了样品中肠杆菌的数量。结果表明:40%以上的CO₂能显著抑制肠杆菌科细菌的生长, 这与已有的研究结果^{[24, 26]}相一致。

本试验结果表明, 40%CO₂+60%N₂、50%CO₂+50%N₂组对菌落总数、乳酸菌和肠杆菌均有抑制作用, 但抑制效果有所不同, 其中高浓度CO₂组即50%CO₂+50%N₂表现出更稳定更持续的抑菌效果。

3.4 不同气调包装的荠菜猪肉馅在贮藏过程中菌群结构的变化

本研究中, 对照组嗜冷菌(Psychrobacter sp.)在2~3 d时相对丰度下降, 可能是由于嗜冷菌是需氧菌, 其数量随氧气的消耗逐渐减少, 而肉食杆菌(Carnobacterium sp.)是兼性厌氧菌, 因此其相对丰度由4%增至35%左右。在缺氧条件下, 嗜冷菌无法与兼性厌氧的肉食杆菌在含蛋白质的食物中竞争, 因此肉食杆菌可能在塑料袋包装的样品中发挥了主要致腐作用^[27-28]。本试验气调包装组中, 假单胞菌在贮藏前期占据优势, 但其对CO₂敏感, 因此3 d之后几乎消失^[29]; 气单胞菌(Aeromonas sp.)是肠杆菌科的兼性厌氧菌, 在贮藏全程一直处于优势地位, 它可能来自制作过程中所用的水^[30]; 沙雷氏菌(Serratia sp.)是肉中的主要致腐菌之一, 其常见于气调包装的生肉中, 随着贮藏时间的延长, 沙雷氏菌持续占据优势^[31]。本研究中, 贮藏末期50%CO₂+50%N₂组的菌群组成与其他处理组出现了差异, 其拥有与其他处理组相似丰度的气单胞菌(12%)和肉食杆菌(5%), 也拥有丰度相对较低的沙雷氏菌(23%)和较高丰度的乳球菌(25%)。

基于以上分析, 我们认为在100%N₂组中发挥主要致腐作用的是肠杆菌(主要是沙雷菌属、气单胞菌属)和乳酸菌(肉食杆菌属), 在含CO₂气调包装组中发挥主要致腐作用的是肠杆菌(沙雷菌属、气单胞菌属)和乳酸菌(乳球菌属)。

本研究表明, 相比其他处理组, 50%CO₂+50%N₂气调包装组中CO₂比例更高, pH值更低, 最利于样品的贮藏, 感官指标表现良好, 对乳酸菌和肠杆菌抑制能力最强。对菌群结构的研究表明, 气调会显著改变样品的菌群组成, 对照组样品中的优势腐败菌是乳酸菌(肉食杆菌属), 气调包装组样品在贮藏末期主要优势菌是肠杆菌科细菌(沙雷菌属、气单胞菌属)和乳酸菌(乳球菌属), CO₂浓度不同会导致不同处理间优势腐败菌相对丰度的差异。本研究可以为气调包装在荠菜猪肉馅中的应用提供一定的理论参考。