果实的生长发育是一个非常复杂的过程, 许多调控途径参与其中。植物激素之间的相互调控在果实生长发育中具有重要作用^[1]。其中乙烯既影响营养器官的生长发育^[2], 又影响果实作物的坐果和果实大小^[3], 在呼吸跃变型果实的成熟过程中更是必不可少^[4]。

在模式植物番茄的果实成熟过程中, 许多转录因子可调控乙烯的生物合成。其中, RIPENING INHIBITOR(RIN)、COLOURLESS NON-RIPENING(CNR)和NON-RIPENING(NOR)转录因子为典型代表。番茄rin、cnr和nor突变体果实成熟受阻, 果实既不能合成高浓度的乙烯, 对外源乙烯处理也没有响应^[5]。大量研究表明RIN、CNR和NOR转录因子可以直接结合许多成熟相关基因的启动子, 包括乙烯合成和信号基因^[6]。Fujisawa等^[7]采用RIN抗体进行染色质免疫沉淀测序(ChIP-seq), 对RIN可能结合的下游基因启动子进行分析, 在番茄中共鉴定241个RIN可能直接结合的目标基因, ULTRAPETALA1(ULT1)基因便是其中之一。

ULT蛋白含有典型的SAND结构域和B-box基序^[8], 在绿色植物的进化后期出现, 可能来自于轮藻特有的SAND-Zf CW蛋白^[9]。SAND结合域最初是在果蝇的DEAF-1转录因子中发现的, 随后被定义为1个新的DNA结合蛋白家族^[10]。在植物中, 目前对ULT基因功能的研究主要集中在拟南芥和水稻中。拟南芥含有2个ULT基因:ULT1和ULT2, ult1突变体表现为花序和花分生组织变大, 导致产生过多的花和花器官, 而ULT2在ult1突变体中的过表达可使花和花器官的发育恢复正常^[11]。ULT1蛋白可招募组蛋白去甲基化酶ATX1结合到AGAMOUS(AG)基因的启动子和内含子区域, 通过调节这些区域的组蛋白甲基化状态来调节基因表达从而调控花的形成^[12]。水稻中ULT1的超表达(35S ∷ OsULT1)同样影响水稻花分生组织的正常分化^[13]。另外, 拟南芥ULT1还可以通过与KANADI转录因子的互作共同调控雌蕊的形成^[14]; 拟南芥ULT1基因还参与叶片腹背性的建立^[15]和根干细胞的发育^[16]。除了调节植物器官或组织的发育外, ULT基因还参与植物对胁迫的响应。拟南芥ULT1蛋白可通过调节靶基因组蛋白甲基化水平来调控植株的耐盐性^[17]; 而水稻ULT1蛋白可与含有SET结构域的H3K4甲基转移酶互作, 通过调控Dehydration Response Element Binding 1b(OsDREB1b)转录因子基因启动子区域的组蛋白甲基化水平来调控水稻对多种胁迫的响应^[18]。

之前对ULT的研究主要是利用模式植物拟南芥和水稻, 发现ULT基因与根、叶和花的发育有关, 而ULT在果实发育中的作用尚未见相关报道。调控番茄果实成熟的关键转录因子RIN可以结合ULT1基因启动子^[7]; 另外, ULT蛋白可调控下游许多基因的组蛋白甲基化水平, 而番茄果实成熟过程也涉及许多基因的组蛋白甲基化水平的改变, 因此ULT蛋白极有可能参与果实的发育或成熟。本研究运用生物信息学方法在肉果类作物中鉴定ULT基因, 并分析模式植物番茄中SlULT1基因在果实成熟中的表达变化, 为深入研究ULT基因在果实发育和成熟中的功能奠定基础。

1 材料与方法 1.1 数据来源

从JGI数据库(https://phytozome.jgi.doe.gov/pz/portal.html)下载番茄、水稻、玉米、番木瓜、拟南芥和桃的全基因组数据库、蛋白组库以及基因注释信息; 从蔷薇科基因组数据库(https://www.rosaceae.org/species/fragaria/all)获得森林草莓全基因组数据库、蛋白组库和基因注释信息; 从葫芦科数据库(http://cucurbitgenomics.org)下载葫芦、甜瓜、黄瓜、南瓜全基因组数据库、蛋白组库和基因注释信息。还下载了香蕉(http://banana-genome.cirad.fr/content/download-dh-pahang)、马铃薯(http://phytozome.jgi.doe.gov/pz/portal.html)、辣椒(https://solgenomics.net/organism/Capsicum_annuum/genome)、荠蓝(http://www.camelinadb.ca/downloads.html)、葡萄(http://genomes.cribi.unipd.it/DATA/V2/V2.1/)、萝卜(http://radish.kazusa.or.jp/)、苹果(https://iris.angers.inra.fr/gddh13/)、梨(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/genome/12793)的数据。所有数据下载完成后, 使用BioEdit 7.2.0软件建立本地蛋白数据库。

苹果、梨、桃、香蕉、草莓、番木瓜和葡萄转录组数据从fruitENCODE数据库(www.epigenome.cuhk.edu.hk/encode.html)下载; 葫芦、甜瓜、黄瓜、南瓜转录组数据从葫芦科数据库(http://cucurbitgenomics.org)下载。还下载了番茄(http://ted.bti.cornell.edu/cgi-bin/TFGD/digital/home.cgi)和辣椒(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi?acc=GSE45037)的转录组数据。下载到的所有转录组数据均是Fragments Per Kilobase Million(FPKM)值或Transcripts Per Million(TPM)值, 可直接反映基因表达水平。

1.2 ULT基因的鉴定和系统进化树的构建

在拟南芥数据库(https://www.arabidopsis.org/)中下载拟南芥ULT1和ULT2的蛋白序列, 用BioEdit 7.2.0软件在19个物种蛋白库中进行本地BLASTp, E值＜0.01的为初步候选序列。之后将得到的序列提交到Smart(http://smart.embl-Heidelberg.de/)、Pfam(http://pfam.xfam.org/)、CDD(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi)和InterPro(http://www.ebi.ac.uk/interpro)网站, 进行保守结构域预测。将含有SAND结构域的蛋白归为最终候选序列。利用ExPasy(http://www.expasy.org/tools)在线工具预测蛋白的基本理化性质。

利用筛选到的19个物种的ULT蛋白对应的CDS序列构建系统进化树:首先用MEGA 6.0软件的MUSCLE进行核苷酸序列比对, 然后用邻接法的P-距离(P-distance)模型构建系统进化树, Gaps设置为Partial deletion, Site Coverage Cutoff设置为50, bootstrap重复值设为1 000次。

1.3 ULT蛋白的motif组成分析

将所有物种候选蛋白序列提交到MEME网站(http://meme-suite.org/tools/meme)^[19], 设置参数如下:重复值为任意(any), 最大motif数为30, 最佳motif宽度为6~50个氨基酸残基, 并设定基序的筛选E-value小于10^-5, 其他参数为默认值。

1.4 ULT基因结构分析

从基因注释信息中获取ULT基因的外显子/内含子信息, 利用GSDS2.0(http://gsds.cbi.pku.edu.cn/)进行基因内含子/外显子的可视化^[20]。以ULT基因上游2 000 bp作为基因启动子序列, 利用PlantCARE(http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/)在线分析其顺式作用元件^[21]。

1.5 番茄SlULT 1 表达分析和激素处理

番茄3种果实成熟突变体cnr、nor、rin以及野生型(‘Ailsa Craig’品种)的SlULT1表达量数据从fruitENCODE数据库下载。选取番茄品种‘Micro Tom’的根、茎、叶、花、小绿果(花后10 d)、中绿果(花后20 d)、大绿果(花后30 d)、破色期果实(花后35 d)、黄熟期果实(花后38 d)、红熟期果实(花后42 d)进行SlULT1定量分析, 其中果实只取果皮进行RNA的提取。使用0.1 mmol · L^-1乙烯利(ETH)处理大绿期的番茄果实, 并在处理0.5、1、2和4 d时取样, 用蒸馏水处理作为对照, 每个处理取3个生物学重复。利用CTAB法提取总RNA, 根据Primerscript RT reagent Kit with gDNA Erase的说明反转成cDNA后, 用SYBR Premix Ex Taq Ⅱ(TaKaRa)试剂盒进行qPCR反应, 并选择Actin基因(Solyc11g005330.1.1)作为内参基因。引物序列如下:SlULT1-F:TGATGCTGTTGCTAGACTTAGG, SlULT1-R:CTCAAACGCAGACGGAGTAA; Actin-F: TGTCCCTATCTACGAGGGTTATGC, Actin-R:CAGTTAAATCACGACCAGCAAGAT。

2 结果与分析 2.1 ULT基因的鉴定和系统树的构建

以拟南芥的ULT1和ULT2全蛋白序列为查询序列在19个物种蛋白库中进行BLASTp, 将获得的蛋白序列进行保守结构域分析, 最终共鉴定出44个含有SAND结构域的ULT候选蛋白, 其中草莓、葡萄和辣椒各仅有1个ULT蛋白; 桃、黄瓜、葫芦、拟南芥、番茄、马铃薯、水稻和玉米各有2个ULT蛋白; 苹果、梨、南瓜、萝卜、番木瓜和香蕉各有3个ULT蛋白; 而荠蓝有5个ULT蛋白。所有ULT蛋白序列长度为167~377个氨基酸, 平均为240.2个氨基酸。ULT蛋白相对分子质量为19.19×10³~41.77×10³, 理论等电点为5.36~9.78, 不稳定指数为35.52~76.12, 平均亲水系数为-0.993~-0.202, 属于亲水性蛋白(表 1)。

将鉴定到的ULT基因的CDS序列构建系统进化树, 结果(图 1)显示, ULT基因可以按照物种所属的科进行聚类。根据系统树的拓扑结构将所有ULT基因分为2个大家族, 一个家族命名为ULT, 另一个家族命名为ULT-Like。其中ULT家族包含了所有19个物种的35个基因, 表明该家族成员在进化上非常保守; 而ULT-Like家族只包含了8个物种(番木瓜、桃、苹果、梨、葫芦、南瓜、甜瓜和黄瓜)的9个基因。表明ULT和ULT-Like家族虽然都含有SAND结构域, 但二者亲缘关系较远。

2.2 ULT蛋白的motif分析和基因结构分析

对所有ULT和ULT-Like蛋白进行motif组成分析, 结果(图 2)显示:在ULT家族35个成员中, 已鉴定功能的拟南芥AtULT1和AtULT2以及水稻的OsULT1均含有9个保守的motif(motif 1—motif 9), 另外32个ULT蛋白中, 其中27个均含有9个保守的motif(motif 1— motif 9), 表明这些ULT蛋白可能与拟南芥和水稻的ULT蛋白具有相同的功能。剩余5个ULT蛋白中, 葫芦的LsULT1缺少motif 8、motif 3、motif 9、motif 5, 番茄的SlULT2和马铃薯的StULT2缺少motif 8和motif 7, 荠蓝的CasaULT2 B缺少motif 8、motif 3、motif 9、motif 6, 水稻的OsULT2缺少motif 6(图 2-A)。另外, 19个物种中有18个都含有至少1个包含9个motif的ULT蛋白, 唯独葫芦没有。对LsULT1、SlULT2、StULT2、CasaULT2 B和OsULT2的氨基酸序列的重新核对和分析发现:最初使用的数据库将葫芦LsULT1第1外显子部分序列作为内含子剪切掉, 导致蛋白N端motif的缺失, 而水稻的OsULT2在NCBI数据库中的序列与最初使用的序列在C端有差异, SlULT2、StULT2和CasaULT2 B则没有发现类似情况。使用校正后的LsULT1和OsULT2蛋白序列再次进行motif组成分析, 结果显示这2个蛋白同样包含了9个保守的motif(motif 1—motif 9)(图 2-B)。上述结果表明在35个ULT蛋白中, 有32个由相似的motif组成, 而且每个物种都至少有1个包含9个保守motif(motif 1—motif 9)的ULT蛋白, 表明ULT基因在进化和功能上的保守性。

在ULT-Like家族中, 所有9个蛋白均与拟南芥和水稻的ULT蛋白具有不同的motif, 番木瓜的CpULT-Like A缺少motif 3和motif 9, CpULT-Like B缺少motif 9、motif 6和motif 4;梨的PbULT-Like和苹果的MdULT-Like缺少motif 8和motif 9;桃的PpULT-Like缺少motif 8、motif 9和motif 5;葫芦的LsULT-Like缺少motif 9和motif 6;南瓜的LsULT-Like缺少motif 8和motif 9;甜瓜的CmeULT-Like和黄瓜的CsULT-Like缺少motif 9(图 2-A)。这些结果表明ULT-Like家族成员的蛋白与ULT家族在motif组成上存在较大差异。

外显子/内含子分析结果(图 2-C)显示, 在35个ULT家族基因中, 有31个基因具有3个外显子和2个内含子; 甜瓜的CmeULT1含有4个外显子和3个内含子; 十字花科中荠蓝的CasaULT 2 A、CasaULT2 B和拟南芥的AtULT2具有2个外显子和1个内含子, 且这3个基因聚在一起。ULT-Like家族9个基因中, 5个基因(MdULT-Like、PpULT-Like、LsULT-Like、CmeULT-Like和CsULT-Like)含有3个外显子和2个内含子, 剩余4个基因CpULT-Like A、CpULT-Like B、PbULT-Like和LsULT-Like外显子数量分别为4、2、5、5。结果进一步表明ULT基因家族在进化过程中的相对保守性。

2.3 ULT基因的启动子顺式作用元件分析

由表 2可见:除了含有核心响应元件, 44个ULT和ULT-Like家族基因启动子都含有光响应元件, 36个基因含有脱落酸响应元件, 27个基因含有赤霉素响应元件, 11个基因含有生长素响应元件, 30个基因含有乙烯响应元件, 35个基因含有茉莉酸响应元件, 20个基因含有水杨酸响应元件, 17个基因分别具有低温和干旱响应元件。表明不同物种中的ULT基因可能会响应不同的环境因子, ULT基因的功能可能具有多样性。

2.4 各物种中ULT基因的表达分析

由图 3-A可见:在4种蔷薇科果实中, 苹果MdULT1 A在未成熟果实中表达量最高, 在成熟后期果实中表达量下降; MdULT B在叶、未成熟果实和成熟后期果实中均有表达, 在成熟后期果实中的表达最高; MdULT-Like在果实中有微量表达。梨PbULT1 A和PbULT1 B在叶、未成熟果实和成熟后期果实中均有表达, 其中PbULT1 A在叶中表达量最高, 而PbULT1 B在成熟后期果实中表达量最高; PbULT-Like在叶片中不表达, 在果实中可以检测到微量表达。桃PpULT1在叶、未成熟果实和成熟后期果实中均有表达。草莓FvULT1在果实中表达量高。

由图 3-B可见:在3种葫芦科果实作物中, ULT1基因的表达量都高于ULT-Like。葫芦LsULT1在根中的表达量最高, 在叶、花和果实中的表达量次之, 在茎中的表达量最低; LsULT-Like在花和果实中表达量最高, 根和茎次之, 叶中表达量最低。南瓜CmoULT1 A在根中的表达量高于CmoULT1 B, 并且高于其在茎、叶和果实中的表达量; 而CmoULT1 B在根、茎和果实中的表达量相当, 但高于在叶中的表达量; CmoULT-Like在各组织中几乎无表达。甜瓜CmeULT1在根中的表达量最高。

由图 3-C可见:葡萄VvULT1在叶、绿果、转色期果实和成熟期果实中都有表达, 叶片中的表达量高于果实。番木瓜CpULT1在叶片和果实中都有表达, 在果实表达量高于叶片, 尤其是在果实成熟时期的表达量较未成熟期增加了5~6倍。

由图 3-D可见:香蕉MaULT1 A在各组织中的表达量显著高于MaULT1 B和MaULT1 C。MaULT1 A在果实中的表达量高于叶片, 在未成熟的果肉中表达量显著高于成熟果肉, 而在未成熟果皮中的表达量显著低于成熟期的果皮; 另外, MaULT1 B和MaULT1 C在叶片和果实中均有低量表达。

由图 3-E可见:在茄科作物中, 番茄有2个ULT基因, SlULT1基因的表达量在各个组织都显著高于SlULT2。其中SlULT1在根、叶和早期发育的果实及绿熟期果实表达量相似, 在破色期的果实中表达量最高, 随后稍微下降; 而SlULT2基因主要在叶和早期发育的果实有表达。辣椒的CanULT1基因在发育中的果皮表达量高于根、茎和叶, 在早期的果皮发育过程中, CanULT1的表达量表现逐渐增加的趋势, 在绿熟期和破色期果实中表达量最高, 在随后的成熟期下降, 其在果实中的表达模式和番茄相似。

2.5 SlULT1基因在番茄果实成熟突变体中的表达变化以及对乙烯的响应

由图 4-A可见:SlULT1在番茄品种‘Micro Tom’根、茎和叶中有表达, 但表达量较低, 在花、小绿果、中绿果和大绿果中表达量中等, 而在破色期和黄熟期果实表达量显著上调, 在红熟期果实表达量又略微下降, 表明SlULT1可能参与了番茄果实的成熟过程。

由图 4-B可见:番茄野生型品种‘Ailsa Craig’中SlULT1基因在果实成熟过程中表现为先增加后降低的趋势, 在花后42 d表达量最高, 为27和37 d表达量的6倍和2.6倍; 但在cnr突变体中, 花后42 d的果实中SlULT1的表达量仅为27和37 d表达量的1.6倍和1.4倍; nor突变体果实中SlULT1的表达量随果实成熟进程几乎没有变化; rin突变体花后42 d的果实SlULT1的表达量为27和37 d表达量的2倍和1.8倍。表明番茄成熟过程中, SlULT1基因的表达完全受NOR的调控, 部分受CNR和RIN的调控。

由图 4-C可见:乙烯处理2和4 d后, 番茄果实SlULT1的表达量分别是对照的1.4倍和3.6倍, 表明番茄果实中SlULT1的表达受乙烯诱导, 进一步说明SlULT1可能参与乙烯诱导的番茄果实的成熟过程。

3 讨论

ULT蛋白含有典型的SAND结构域和B-box基序, 之前仅在绿藻、陆地植物和后生动物中发现含有SAND结构域的蛋白, 这些蛋白在细胞增殖和分化中起重要作用^[9]。绿藻中含有大量SAND结构域的蛋白, 但在陆地植物中仅发现2种主要类型:ATX和ULT。本研究鉴定的19种植物中, 除ULT-Like外, 有16种植物仅含有1~2个ULT基因, 最多的荠蓝也只有5个ULT(其中1个不具有完整的motif组成), 并且大部分ULT基因结构相同, 表明ULT在进化上非常保守。SAND结构域含有2个保守的核心元素:TPXXFE和KDWK。KDWK基序是结合DNA必不可少的^[22]。在已研究过ULT基因功能的植物中, 所有ULT基因都与茎顶端分生组织中花和花序分生组织的分化有关^{[11, 13]}; 并且在本研究的19种植物中, 凡是基因表达数据库中有花器官的植物, ULT基因在花中都有表达, 因此ULT基因在花发育过程中的功能可能是保守的。

ULT基因在植物组织器官发育中的功能已有报道, 拟南芥AtULT1基因参与叶片腹背性的建立^[15]和根干细胞的发育^[16]。AtULT1启动子驱动ULT1∷GFP融合蛋白表达的转基因拟南芥中, 在根中检测到GFP荧光信号, 表明AtULT1在拟南芥根中存在表达^[16]。本研究在果实作物中均发现ULT在根和叶中的表达, 尤其在葫芦科植物中, ULT基因在根中表达量普遍高, 黄瓜和甜瓜中ULT基因在根中的表达量高于花中表达量, 因此推测ULT在葫芦科植物根的发育中也起重要作用, 而ULT基因功能在植物根和叶的发育中具有保守性。本研究发现凡是有肉果的园艺作物, 在果实中都有ULT基因的表达, 且在一些物种的肉果中表达量甚至高于根、茎、叶和花等其他器官。鉴于ULT在基因组上数量较少且在进化上的保守性, 推测无论是在水稻、拟南芥等类似的干果中, 还是在番茄、辣椒、苹果、梨等许多园艺作物的肉果中, ULT都有可能参与了果实的生长和发育。

本研究发现, 肉果类作物苹果、梨、番木瓜、番茄、香蕉和辣椒中均至少有1个ULT基因在果实成熟时期表达量显著上调, 但ULT是否也参与这些作物果实的成熟过程尚不清楚。番茄是研究呼吸跃变果实成熟的模式植物, 且有许多果实成熟突变体可作为研究材料^[22]。植物激素乙烯是调控番茄成熟的主要激素, 在番茄成熟过程中, 乙烯合成是一个自我催化的过程, 转录因子RIN、NOR和CNR等可以直接结合乙烯合成基因ACS2和ACO1的启动子, 激活其表达进而合成乙烯, 而合成的乙烯反过来诱导乙烯信号传导过程中的转录因子EIN3重新结合到RIN基因的启动子上, 激活RIN的表达, 这样一个正反馈环造成了番茄果实中乙烯的自我催化合成^[23]。本研究发现SlULT1的表达完全受NOR转录因子的调控, 部分受CNR和RIN的调控, 并且RIN蛋白可以直接结合SlULT1基因启动子^{[7, 23]}, 推测SlULT1基因可能位于RIN、NOR和CNR的下游, 而且直接受RIN的调控; 加之乙烯处理可以显著上调SlULT1的表达, 因此推测番茄SlULT1极有可能参与了番茄果实的成熟过程。果实成熟是一个复杂的过程, ULT基因在果实成熟中具体作用还需进一步研究。