文章信息
- 余倩, 张玉宇, 张曾娣, 朱伟云, 黄赞
- YU Qian, ZHANG Yuyu, ZHANG Zengdi, ZHU Weiyun, HUANG Zan
- 荧光素酶报告系统检测大肠杆菌代谢产物调控STC-1细胞表达胆囊收缩素研究
- Detection of Escherichia coli metabolites by luciferase reporter system to regulate secretion of cholecystokinin by STC-1 cells
- 南京农业大学学报, 2019, 42(6): 1133-1140
- Journal of Nanjing Agricultural University, 2019, 42(6): 1133-1140.
- http://dx.doi.org/10.7685/jnau.201810007
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文章历史
- 收稿日期: 2018-10-12
2. 南京市儿童医院, 江苏 南京 210029
2. Nanjing Children's Hospital, Nanjing 210029, China
肥胖是目前备受关注的健康问题, 全球约1/3的人口被超重或肥胖问题所困扰。科学家正致力于研究肥胖病的发病机制并制定改善及治疗肥胖的方法。宿主肠道中存在数以万亿计的肠道微生物, 研究报道指出肠道微生物的自然代谢产物可影响宿主的生理代谢[1]。肠道微生物代谢产物能够调节饱腹激素的表达, 如短链脂肪酸(SCFA)能作为一种特异性配体与G蛋白偶联受体41(GPR41)和GPR43结合, 促进饱腹激素胰高血糖素样肽(GLP-1)、多肽YY(PYY)、胆囊收缩素(CCK)的分泌, 增加动物的饱腹感, 减少能量摄入从而减轻肥胖[2]。CCK是一种由肠道I细胞和脑中枢分泌的多肽类激素。CCK可以结合并激活CCK-1与CCK-2受体, 调节CCK靶器官的生理活动, 如促进胆囊收缩, 促进胰腺分泌胰酶等[3]。迄今为止, 有关CCK的生理功能研究主要集中在其对短期饱腹感的诱导作用等方面。由肠道内分泌细胞产生的CCK是一种饱腹激素, 具有短期控制食欲、减少动物摄食、降低血糖等生理功能, 目前CCK多肽类似物被广泛应用于肥胖及二型糖尿病的预防及治疗, 因此, CCK的分泌和调控是目前研究的热点[4-5]。
通过筛选大肠杆菌的单个基因敲除文库, 找到影响动物机体代谢的具体物质是目前颇具前景的研究方向。Han等[6]用3 983个单基因突变的大肠杆菌文库作用于秀丽隐杆线虫, 发现有29种大肠杆菌突变体能够调节秀丽隐杆线虫的新陈代谢进而显著延长其寿命, 最后发现实质上是这29种大肠杆菌突变体的代谢产物延长了宿主寿命。因此本文拟将大肠杆菌突变体文库与饱腹激素CCK结合, 探索影响肠道CCK分泌的大肠杆菌突变体及其代谢产物, 为肥胖、糖尿病的预防和治疗及家畜肉品质的调控提供新思路。
腐胺作为生物胺的一种, 广泛存在于动物、植物及微生物中, 对细胞的生长发育必不可少。生物胺在生物体核酸、蛋白质的合成中起重要作用, 影响着细胞的功能, 此外其还参与生物体内糖、脂质、激素等的代谢过程[7]。近年来, 微生物生物胺的研究表明生物胺还参与微生物细胞膜成分构建, 且大肠杆菌的外膜上就有腐胺的成分参与[8]。在微生物体内, 腐胺的合成主要有2种途径, 一种是由L-鸟氨酸在鸟氨酸脱羧酶的催化作用下形成腐胺, 另一种是由L-精氨酸在一系列酶的催化作用下生成腐胺[9]。腐胺在大肠杆菌中的转运主要由ABC(ATP-binding cassette)转运蛋白和逆向转运载体PotE调控[10-11]。
荧光素酶报告系统通常在O2、镁离子及ATP存在条件下催化底物荧光素氧化为氧化荧光素, 在氧化过程中会发出生物荧光, 生物荧光则可通过化学发光仪或者液闪测定仪进行测定[12]。通过荧光素和荧光素酶这一生物发光系统可以非常灵敏高效地检测目的基因的表达水平。但是由于目前一般进行瞬时转染的荧光素酶系统不能长期稳定表达, 因此具有一定的应用局限性, 而构建一个稳定表达含有荧光素酶报告基因的慢病毒载体则尤其必要。来源于人类免疫缺陷病毒1(HIV-1)的慢病毒载体在包装质粒的辅助下, 可包装成有感染性的病毒颗粒, 通过感染靶细胞, 能在目的细胞及其分化的子细胞中持续、长期、稳定表达目的基因[13]。荧光素酶报告系统和慢病毒载体的结合对于快速筛选影响肠道内分泌细胞分泌CCK的大肠杆菌突变体具有重要作用。
本试验拟构建CCK启动子与荧光素酶基因共表达的慢病毒表达载体, 转导细胞, 结合抗生素标记筛选获得能够稳定、长期共表达CCK启动子与荧光素酶基因的STC-1细胞系, 并利用该细胞系快速筛选影响STC-1细胞表达CCK的大肠杆菌突变体。
1 材料与方法 1.1 试验材料小鼠肠道内分泌细胞株(STC-1细胞)获赠于浙江工商大学邓少平教授, 大肠杆菌突变体文库(Keio)获赠于南京大学林兆宇研究员, 质粒pLVX-CCK Promoter-GFP获赠于哈佛大学Ressler教授。HEK293FT细胞株、感受态大肠杆菌及pLVX-Luciferase、psPAX2、pMD2G质粒均由本课题组常规保存。
DMEM培养基、胎牛血清(FBS)购于Gibco公司。LipofectamineTM2000购于Invitrogen公司。青/链霉素、Peptone-A、腐胺购于Sigma公司。限制性核酸内切酶ApaLⅠ、PstⅠ、Bgl Ⅱ、ClaⅠ、BamHⅠ和T4连接酶购于TaKaRa公司。RNAiso Plus、PCR高保真酶2×Phanta Max Master Mix、逆转录试剂盒和Real-time qPCR试剂盒购于南京诺维赞生物科技有限公司。无内毒素质粒中提试剂盒购于南京伟沃生物科技有限公司。慢病毒浓缩试剂盒购于南京建成生物科技有限公司。胶回收试剂盒、萤火虫萤光素酶报告基因检测试剂盒购于碧云天生物技术公司。CCK抗体购于Proteintech公司。羊抗鼠IgG-HRP、羊抗兔IgG-HRP和荧光二抗试剂盒(BD5003)购于南京巴傲德公司。杀稻瘟菌素(BSD)购于上海翊圣生物公司。
1.2 慢病毒载体构建及细胞系建立 1.2.1 慢病毒载体构建与鉴定将质粒pLVX-CCK Promoter-GFP用ClaⅠ和BamHⅠ酶切, 电泳后胶回收CCK启动子片段; 将质粒pLVX-Luciferase-BSD以ClaⅠ和Bgl Ⅱ双酶切, 电泳后胶回收载体片段; 将回收片段16 ℃连接过夜, 连接产物转化DH5α后37 ℃培养过夜。挑克隆提取质粒后以PstⅠ和ApaLⅠ双酶切鉴定。
1.2.2 慢病毒包装及感染目的细胞培养HEK293FT细胞至95%汇合后, 使用LipofectamineTM2000将穿梭质粒pLVX-CCK Promoter-Luciferase-BSD、包膜质粒pMD2G、辅助质粒psPAX2共转染入HEK293FT细胞。转染8 h后吸去培养液, 换成含有双抗的完全培养基继续培养, 每隔24 h收集慢病毒上清液, 共收取3次。将离心后的慢病毒上清液用0.45 μm滤器过滤, 利用慢病毒浓缩纯化试剂盒浓缩病毒液。
将STC-1细胞传代至6孔板中, 当细胞生长至约50%汇合时, 将培养基更换为含有10%慢病毒浓缩液的完全培养基, 12 h后换成完全培养基继续培养至细胞完全汇合。将感染后的细胞传代至10 cm培养皿中, 并加入5 μg · mL-1杀稻瘟菌素直至细胞生长至汇合。将筛选出的细胞系命名为STC-1/CCK-Luc。
1.2.3 Peptone-A验证STC-1/CCK-Luc活性将STC-1/CCK-Luc细胞传代于24孔板中, 当细胞达到80%汇合时, 将原培养基换为含2% FBS的完全培养基。添加Peptone-A至终含量分别为为0、0.5、1.0、2.0 mg · mL-1, 每组4个重复。培养24 h后弃培养基, 收获细胞, 依试剂盒说明书用RNAiso Plus提取细胞总RNA, 逆转录反应合成cDNA, Real-time PCR检测细胞内CCK mRNA的表达水平; 同时检测内参基因36B4。所用引物对序列如下: CCK-F/R:5′-ACTGCTAGCGCGATACATCC-3′/5′-TTATTCTATGGCTGGGGTCC-3′; 36B4-F/R:5′-CAGCAAGTGGGAAGGTGTAATCC-3′/5′-CCCATTCTATCATCAACGGGTACAA-3′。同样的试验处理STC-1/CCK-Luc细胞后, PBS洗涤细胞1次, 加入100 μL荧光素酶裂解液处理细胞15 min, 收集裂解液, 15 000 g离心5 min; 取50 μL上清液加入酶标板, 再加入100 μL荧光素酶检测试剂, 用多功能酶标仪测定。
1.3 大肠杆菌敲除株(ΔSapD)菌液上清对CCK表达的影响 1.3.1 大肠杆菌ΔSapD株的鉴定将野生型大肠杆菌和大肠杆菌敲除SapD株(简称大肠杆菌ΔSapD株)接种于2 mL液体LB培养基中, 置于37 ℃摇床中200 r · min-1培养12 h。根据突变菌株基因组序列设计鉴定引物, SapD-F:5′-CGCACTGTCGATGGCAATTC-3′和Kan-R:5′-CAGTCATAGCCGAATAGCCT-3′。吸取1 μL野生型或突变菌液作为模板, 以超纯水为对照, 用Phanta Max Master Mix扩增条带。程序如下:95 ℃ 30 s, 56 ℃ 30 s, 72 ℃ 30 s, 30个循环。电泳后切胶并回收唯一条带后送交公司测序。
1.3.2 大肠杆菌ΔSapD株菌液上清对CCK表达的影响将野生型大肠杆菌和大肠杆菌ΔSapD株接种于5 mL液体LB培养基中, 置于37 ℃摇床中200 r · min-1培养12 h。培养结束后, 立即以15 000 r · min-1离心菌液15 min, 取1 mL上清液待用。STC-1/CCK-Luc细胞传代于24孔板中, 待细胞80%汇合后吸去原培养基, 加入含有10%大肠杆菌ΔSapD株菌液上清及2%FBS的培养基, 每组4个重复。处理24 h后, 如前所述测定荧光素酶活性。
同样STC-1/CCK-Luc细胞传代于24孔板中, 待细胞80%汇合后吸去原培养基, 加入含有5%野生型大肠杆菌菌液上清液且含有2%FBS的培养基, 或分别含有5%、10%、20%大肠杆菌ΔSapD株菌液上清及2% FBS的培养基, 每组4个重复。处理24 h后, 提取细胞总RNA, 逆转录合成cDNA, Real-time PCR检测细胞内CCK mRNA表达水平, 内参为 36B4 基因。
将STC-1/CCK-Luc细胞传代于灭菌盖玻片上, 如前述处理24 h; 以福尔马林固定15 min, PBS洗涤3次后以30 g · L-1 BSA封闭1 h, 加入CCK一抗4 ℃孵育过夜; 第2天按荧光二抗试剂盒说明书检测CCK表达。
1.4 腐胺影响CCK表达的机制研究 1.4.1 腐胺处理STC-1细胞后CCK表达水平的检测STC-1细胞传代于6孔板内, 细胞达到80%汇合后吸去原培养基, 替换成腐胺含量分别为0、20、100 μg · mL-1的完全培养基, 每组4个重复。处理24 h后待细胞生长汇合后, 收获细胞。以Trizol试剂提取细胞总RNA, 逆转录合成cDNA, Real-time PCR检测细胞内CCK基因的表达水平, 内参基因为36B4。
1.4.2 腐胺处理肠道类器官后CCK表达水平的检测肠道类器官按Mahe等[14]的方法培养。将小鼠10 cm小肠清洗干净后, 刮去肠绒毛, 用2 mmol · L-1 EDTA消化获得隐窝; 将隐窝以10 μL-1重悬于基质胶(Matrigel)(50 ng · mL-1表皮生长因子, 100 ng · mL-1 Noggin, 250 ng · mL-1 R-spondin), 24孔板每孔加入50 μL基质胶, 凝固后补充500 μL类器官培养液DMEM/F12。显微镜下观察, 当类器官发育成熟后, 换入新鲜的类器官培养液, 添加腐胺处理24 h。吸去培养液, 收集类器官, 每个类器官团加入100 μL十二脘基硫酸钠(SDS)上样液, 95 ℃加热10 min。将样品进行Western blot检测, 每孔25 μL样品, 进行100 g · L-1 SDS-聚丙烯酰胺凝胶(SDS-PAGE)电泳后转膜, 50 g · L-1脱脂奶粉封闭1 h, 加入一抗, 4 ℃过夜。TBST洗涤3次, 二抗室温孵育1 h, 再经过3次10 min的TBST洗涤, 加入化学发光检测试剂检测CCK和Actin的表达。或依照上述处理后, 吸去培养液加入福尔马林固定过夜, 5 μm冰冻切片。加30 g · L-1 BSA封闭1 h, 以1 : 100加入CCK抗体结合过夜, 按荧光二抗试剂盒说明书检测CCK表达。
1.5 统计学方法应用SPSS 20.0统计软件进行数据分析, 数据以均值±标准差(x±SD)表示, 组间差异采用t测验。利用Graphpad 7.0软件进行绘图。
2 结果与分析 2.1 慢病毒载体的构建及鉴定经SnapGene软件分析, 重组质粒结构如图 1-A所示, 大小为12 447 bp。对慢病毒载体pLVX-CCK Promoter-Luciferase-BSD使用PstⅠ和ApaLⅠ进行双酶切鉴定, 获得大小分别为5 192、2 361、1 606、1 246、911、635、396和100 bp的8个条带。经琼脂糖凝胶电泳, 条带大小均符合预期(图 1-B), 此结果表明CCK启动子控制的荧光素酶报告基因构建成功。
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图 1 pLVX-CCK Promoter-Luciferase-BSD慢病毒载体图谱(A)及琼脂糖凝胶电泳鉴定(B) Fig. 1 Structure map(A)and agarose gel electrophoresis identification(B)of the lentiviral vector pLVX-CCK Promoter-Luciferase-BSD M. DNA marker; 1.载体的双酶切产物Enzyme products of lentiviral vector. |
将载体pLVX-CCK Promoter-Luciferase-BSD与慢病毒辅助质粒共转染293FT细胞, 获得慢病毒液。使用慢病毒感染STC-1细胞, 经过杀稻瘟菌素筛选, 显微下观察, 可见未感染病毒的STC-1细胞完全被杀死, 而感染了病毒的细胞则能增长存活(图 2-A、B)。将筛选出的细胞系命名为STC-1/CCK-Luc。
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图 2 STC-1/CCK-Luc细胞系的建立及peptone-A对其影响鉴定
Fig. 2 The establishment and identification of STC-1/CCK-Luc cell line
A.无慢病毒处理; B.慢病毒pLVX-CCK Promoter-Luciferasec-BSD处理; C. Real-time PCR检测CCK的表达水平(n=4);D.荧光素酶值。
A. Without lentivirus; B. With pLVX-CCK Promoter-Luciferase-BSD; C. Real-time PCR analysis of CCK expression level(n=4);D. Luciferase value(n=4). *P < 0.05;* * *P < 0.001. The same as follows. |
为了证明此细胞系和野生型细胞一样表达CCK, 我们使用了不同浓度Peptone-A处理慢病毒感染的STC-1细胞, 通过Real-time PCR检测CCK表达水平, 使用荧光素酶报告基因试剂盒检测荧光素酶表达水平。结果表明, CCK基因的表达和荧光素酶的表达均随Peptone-A的浓度上升而增加(图 2-C、2-D)。
以上试验证明稳定感染pLVX-CCK Promoter-Luciferase的STC-1建立成功, 可以使用荧光素酶的强度来反映CCK表达水平。
2.3 大肠杆菌敲除株ΔSapD的鉴定及其代谢产物对CCK表达的影响Keio文库中包含了3 985个菌株, 每个菌株各敲除1个大肠杆菌基因, 这些基因的缺失会造成大肠杆菌的代谢产物不同。因此在建立STC-1/CCK-Luc细胞系后, 我们使用此文库中菌株的菌液上清进行了高通量筛选。此文中我们以ΔSapD敲除株为例说明筛选鉴定过程。
根据大肠杆菌ΔSapD株基因组信息设计位于SapD上游基因组和敲除区内部的引物, 使用高保真Taq酶进行菌落PCR鉴定, 琼脂糖凝胶电泳检测到大小为728 bp目的片段(图 3-A), DNA测序结果与预期ΔSapD株基因组序列相符(图 3-B), 说明筛选到的大肠杆菌突变体的确缺失了SapD基因。
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图 3 大肠杆菌敲除株ΔSapD的鉴定及其菌液上清液对CCK表达的影响 Fig. 3 Identification of ΔSapD mutation and effect of ΔSapD mutation culture supernatant on CCK expression A.大肠杆菌ΔSapD株基因片段扩增电泳图; B.大肠杆菌ΔSapD株基因测序结果; C.荧光素酶值; D. CCK mRNA的表达; E. STC-1/CCK-Luc细胞免疫荧光检测(绿色Anti-CCK, 蓝色DAPI)。 A. PCR amplification of ΔSapD mutation; B. Gene sequencing of ΔSapD mutation; C. Luciferase value; D. CCK mRNA expression; E. Immunofluorescence of STC-1/CCK-Luc cells(Green:Anti-CCK, blue:DAPI). |
将ΔSapD株的菌液上清液加入STC-1/CCK-Luc细胞系, 24 h后检测荧光素酶表达水平, 发现ΔSapD株的菌液上清液可以显著降低荧光素酶表达水平(图 3-C)。为进一步确定ΔSapD株的菌液上清液是否降低了CCK的表达水平, 我们将不同浓度的ΔSapD株菌液上清液与STC-1/CCK-Luc细胞共培养, 并用野生型大肠杆菌菌液上清液作为对照, 用qPCR直接检测CCK mRNA的转录水平。结果显示, ΔSapD株菌液上清液可以显著抑制CCK转录, 且抑制水平与上清液的添加量呈正相关(图 3-D)。而用野生型和ΔSapD株菌液上清液处理STC-1/CCK-Luc细胞24 h, 以免疫荧光检测CCK蛋白水平, 可以看到随着ΔSapD株菌液的增加, CCK的表达量显著下降(图 3-E)。
2.4 腐胺对CCK表达的影响根据文献报道, SapD基因突变会导致腐胺无法传递到细胞外, 导致细菌培养上清液中腐胺浓度下降[15]。为了验证是否是腐胺导致了CCK表达水平改变, 我们用不同浓度的腐胺处理STC-1/CCK-Luc细胞24 h, qPCR检测各组细胞CCK mRNA的表达水平。结果表明, 20 μg · mL-1的腐胺即可显著促进STC-1/CCK-Luc细胞CCK mRNA的表达, 更高浓度的腐胺有升高CCK表达趋势(图 4-A)。为了研究腐胺在肠道中是否也有刺激CCK表达的作用, 我们用不同浓度的腐胺直接作用于肠道类器官, 进行Western blot和免疫荧光检测。Western blot检测结果表明, 25 μg · mL-1的腐胺能显著促进CCK蛋白的表达(图 4-B), 免疫荧光结果显示, 在腐胺处理肠道类器官中CCK阳性细胞数量显著增加(图 4-C、4-D)。
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图 4 腐胺(Put)对CCK表达的影响 Fig. 4 Effect of putrescine(Put)on CCK expression A.腐胺处理STC-1/CCK-Luc细胞后CCK mRNA的表达; B.腐胺处理肠道类器官后CCK蛋白的表达; C. 0 μg · mL-1腐胺处理肠道类器官; D. 25 μg · mL-1腐胺处理肠道类器官(箭头指示CCK表达细胞)。 A. CCK mRNA expression in STC-1/CCK-Luc cells treated with putrescine; B. Protein expression of CCK in intestine organoid treated with putrescine; C. Intestine organoid treated with 0 μg · mL-1 putrescine; D. Intestine organoid treated with 25 μg · mL-1 putrescine(White arrow indicates CCK expression cells). |
近年来, 肠道菌群“脑肠轴”引发国内外学者的高度关注, 肠道菌群通过神经、代谢、内分泌和免疫等途径与大脑进行双向调节, 能够影响宿主对于食物的摄取。有研究表明其主要机制为肠道微生物及其代谢产物通过调节CCK、GLP-1、PYY等食欲抑制激素的分泌, 这些激素能作用于下丘脑弓状核, 抑制神经肽(NPY)/刺鼠基因相关蛋白(AgRP)神经元活性并激活POMC神经元从而刺激大脑产生饱腹感抑制食欲[16]。目前, 许多学者对于肠道菌群及其代谢产物的作用机制仍然存在异议, 本试验探索大肠杆菌突变体文库中能够影响饱腹激素CCK分泌的新型大肠杆菌突变体基因及其代谢产物, 进而探索其作用机制, 为预防、治疗肥胖及家畜肉品质的改善提供新思路。
为了建立可快速筛选大肠杆菌突变体的体外模型, 首先就要获得稳定并且共同表达CCK启动子与荧光素酶基因的STC-1细胞株。在本研究中, 我们选择含有CCK启动子、荧光素酶基因以及BSD筛选基因的慢病毒载体, 包装慢病毒感染目的细胞, 通过BSD筛选可以得到慢病毒转导的目的细胞。Peptone-A添加至慢病毒感染的细胞后进行Real-time PCR和荧光素酶检测结果均显示, 随着Peptone-A的添加, CCK和Luciferase基因变化趋势一致, 同时也表明慢病毒感染的细胞系构建成功。慢病毒载体是以HIV-1为基础发展起来的逆转录病毒, 与一般的逆转录病毒、腺病毒载体相比, 慢病毒载体的感染谱更广, 且可以整合入宿主基因组长期表达, 不会因传代而丢失[17-19]。
本实验室通过筛选大肠杆菌基因敲除文库中不同菌株的菌液上清液, 发现大肠杆菌突变体ΔSapD菌液上清液能显著抑制细胞和肠道类器官中CCK的分泌。已有研究报道指出大肠杆菌细胞中具有多种腐胺转运蛋白, 其中SapB、SapC、SapD、SapF能促进转运蛋白将腐胺从大肠杆菌细胞内转运至外界环境中[15]。SapD主要是作为ABC转运蛋白的ATP结合酶, 对于转运大肠杆菌细胞内分泌的腐胺进入大肠杆菌培养液中具有重要作用[20]。因此SapD基因的敲除, 势必会抑制转运蛋白转运腐胺功能, 最终减少大肠杆菌培养液中腐胺含量。由此我们猜测腐胺可能会促进CCK分泌, 因此我们用纯化的腐胺处理STC-1/CCK-Luc细胞及肠道类器官, 结果证实腐胺确实能显著促进细胞及肠道类器官CCK的分泌, 这一研究结果也间接验证了前人的研究结论。
自2009年Sato等[21]首次在体外培养出肠道类器官, 肠道器官培养技术逐渐发展并成熟。肠道类器官衍生于肠道前体祖细胞或多能干细胞, 在组织结构和相应功能上与对应的活体肠道器官高度相似[22]。与体内研究相比, 肠道类器官培养可从单一的供体获得多个体外培养类器官, 便于观察和操作, 同时避免了动物试验周期长、非人道主义等问题。但是肠道类器官培养亦存在一定的局限性, 如肠道类器官缺少肠道微生物群体、免疫细胞、神经元等参与, 只能反映局部组织器官的生理代谢特征, 不能完全代替体内试验等[23-25]。本试验中我们采用肠道类器官培养代替动物试验验证了腐胺对于CCK分泌的作用, 减少了动物试验的繁杂性, 且较高程度还原了动物小肠内激素的代谢活动, 为进一步筛选更多影响CCK分泌的大肠杆菌突变体提供了依据。
总之, 本试验成功构建了含受CCK启动子调控的Luciferase慢病毒载体, 并成功使慢病毒感染STC-1细胞, 通过BSD筛选, 获得STC-1/CCK-Luc细胞系。通过该细胞系我们成功筛选到1株大肠杆菌敲除株ΔSapD, 其代谢产物中腐胺含量下降, 可见其代谢产物能够抑制STC-1细胞的CCK表达。相反, 腐胺含量增加能够促进肠道类器官中CCK的表达, 为后续研究奠定了坚实的基础。
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