文章信息
- 张平, 伍洪铭, 张福鳞, 曹鹏辉, 蔡梦颖, 宋炜涵, 刘世家, 江玲
- ZHANG Ping, WU Hongming, ZHANG Fulin, CAO Penghui, CAI Mengying, SONG Weihan, LIU Shijia, JIANG Ling
- 通过RNAi技术下调OsLOX提高水稻种子耐储性
- Improving the storage tolerance of rice seeds by down-regulating OsLOX by RNAi
- 南京农业大学学报, 2019, 42(6): 996-1005
- Journal of Nanjing Agricultural University, 2019, 42(6): 996-1005.
- http://dx.doi.org/10.7685/jnau.201904043
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文章历史
- 收稿日期: 2019-04-20
水稻是我国重要的粮食作物之一, 稻谷存储不当不仅会引起种子活力降低, 种用价值丧失, 种业损失, 还可引起粮食的营养损失, 若有霉菌毒素的污染甚至丧失食用价值, 造成粮食浪费。我国每年稻谷存储量约占总产量的40%左右, 即每年有超亿吨的稻谷需要储藏, 平均储藏时间是16个月, 每年在储藏过程中引起的稻谷损失占总存储量的3%以上, 而在一些气候湿润地区如江浙一带损失更为严重[1]。目前, 通常通过改善稻米储藏条件来延长储藏时间, 但这种方法成本较高, 消耗巨大的人力和财力。稻米陈化是一个复杂过程, 涉及多方面因素, 稻米陈化过程中不同品种之间的耐储特性明显不同, 表现为籼稻比粳稻更为耐储[2], 表明稻米储藏特性存在基因型差异, 由遗传控制, 因此从种子自身的遗传来提高种子的耐储性是一条有效途径。
脂质代谢是膜脂降解和种子变质的主要原因, 进而影响种子活力[3-4]。已有研究表明, 引起种子在储藏过程中脂质降解的关键酶是脂氧合酶(lipoxygenase, EC 1.13.11.12, LOX), 包括LOX1、LOX2、LOX3这3种同工酶[5], 它们可特异催化不饱和脂肪酸发生加氧反应, 产生脂肪酸氢过氧化物, 如氧脂、环状脂肪族化合物[6]等。其中LOX2是从萌发3 d的幼苗中被克隆出来的[7], 降低其表达可导致发芽减缓同时还可减缓种子变质的速度[8]; LOX3是导致种子脂质氧化的主要同工酶, 其产物往往是易挥发的小分子化合物, 如丙二醛等, 造成种子耐储性降低, 种子活力下降, 最终丧失活性[9]。因此, 通过降低水稻种子中脂氧合酶的含量可以提高水稻的耐储性[10]。
为减缓种子劣变的速度, 延长种子在储存过程中的寿命, 本实验室前期已通过RNA干扰(RNAi)技术, 以‘宁粳1号’为受体, 创制了一批OsLOX干扰的转基因材料。本研究在此基础上经过多次鉴定和选择, 选出含有目的片段但不含潮霉素的转基因家系, 其耐储性较‘宁粳1号’有显著提高, 并对获得的改良家系进行生理生化特征及农艺性状的考察, 评价其利用价值。
1 材料与方法 1.1 试验材料‘W017’是本实验室以LOX3缺失品种‘DawDam’[11]为母本, 通过杂交、回交并结合分子标记辅助选择育成的LOX3缺失的优质水稻品种, 具有较好的耐储性[12], 其产量较低, 本研究将其作为耐储性对照。‘宁粳1号’为本实验室育成的优质高产抗病粳稻品种, 其耐储性较弱[10], 为改良其耐储性弱的缺点, 实验室前期通过利用LH-1390-RNAi, 以‘宁粳1号’为受体, 获得阳性RNAi T6代转基因家系XO3和XO6(表 1)。
| 家系Family | 受体亲本Receptor parent | 干扰/敲除基因Interference/knockout gene | 世代Generation |
| XO3 | 宁粳1号Ningjing 1 | LOX2-LOX3 | T6 |
| XO6 | 宁粳1号Ningjing 1 | LOX2 | T6 |
2016年11月和2017年11月及其次年5月, 将XO3和XO6家系的所有单株、阳性对照‘W017’和阴性对照‘宁粳1号’分别种于海南省陵水县南京农业大学南繁基地和南京市江宁区淳化街道土桥社区南京农业大学土桥水稻试验站。田间种植行距为20 cm, 株距为13.3 cm, 每穴1株, 10株1行, 宽窄行种植, 常规大田管理, 待种子黄熟后, 收获亲本及各单株种子。
1.3 分子标记鉴定 1.3.1 DNA样品的制备取新鲜叶片保存于-20 ℃备用, 并采用CTAB法提取DNA。通风橱晾干后加200 μL H2O即为DNA母液, -20 ℃保存。
1.3.2 PCR扩增反应PCR扩增采用10 μL反应体系:2 μL DNA, 4 μL ddH2O, 2 μL 10×Buffer(含Mg2+), 1 μL 2.5 mmol·L-1 dNTP, 1 μL引物(10 μmol·L-1的前、后引物), 0.1 μL rTaq酶。反应程序为:95 ℃ 5 min; 94 ℃ 30 s, 55 ℃ 30 s, 72 ℃ 40 s, 共36个循环; 72 ℃ 10 min; 4 ℃ 10 min, 得到的PCR产物于4 ℃保存。
潮霉素引物F/R:ACACAGCCATCGGTCCAGAC/ATCTTAGCCAGACGAGCGGG; XO3目的片段引物F/R:AGTCATCTCGAAGATTCCGCCGGCAGGAGATTCAGTTTGA/AATCATCTCGAAGTTTCGGCCGGAGAGA-GGCAAAAGTGAA; XO6目的片段引物F/R:AGTTTGTCCGGACGAACACGTCCCAGGAGATTCAGTTTGA/AATTTGTCCGGACCAACTCGTCCAGAGAGGCAAAAGTGA。
1.3.3 琼脂糖凝胶电泳鉴定潮霉素时, 用450 mmol·L-1 Tris-H3BO3、10 mmol·L-1 EDTA调节pH值为8.0, 配制成5×TAE缓冲液作为为母液; 将母液稀释为50×TAE的缓冲液, 作为电泳液及配制琼脂糖凝胶液, 配制10 g·L-1琼脂糖凝胶, 并加1滴EB, 待冷却凝固后点样(加Loading Buffer的PCR扩增产物)。电泳条件:电压110 V, 电流40 mA, 电泳20 min后取出, 在电泳成像仪下观察。
1.3.4 聚丙烯酰胺凝胶电泳鉴定目的片段时, 采用80 g·L-1聚丙烯酰胺凝胶电泳, 以0.5×TBE作为缓冲液, 待凝固后点样已加Loading Buffer的PCR扩增产物, 在150 V(220 mA)下电泳40 min; 用1 g·L-1硝酸银溶液银染12 min后弃废液, 再用蒸馏水冲洗, 弃废液; 加入显色混合溶液(显色液、甲醛溶液体积比为100 : 1), 显色5 min; 用自来水冲洗后包胶, 在灯箱上读胶。
1.4 RNA提取及RT-qPCR分析将吸胀4 h的2粒种子去壳, 吸干表面水分, 在液氮中迅速研磨成粉末后, 利用RNA Preprure Plant Kit(Tiangen)提取植物叶片中总RNA, 具体步骤参见试剂盒说明书。
将提取的总RNA反转录为cDNA, 荧光定量PCR反应体系为20 μL:2 μL cDNA、2 μL引物、10 μL SYBR Green荧光染料和6 μL RNase free H2O。采用Bio-Rad荧光定量PCR仪扩增, 设3个重复。内参基因为OsEF-Lα, OsLOX的RT-qPCR引物见表 2。
| 基因名称 Gene name |
基因编号 Gene number |
正向引物序列 Forward premier sequence(5′→3′) |
反向引物序列 Reverse premier sequence(5′→3′) |
| OsLOX2 | Os03g0738600 | GTGGGAGGTGGAGAAGATGG | CAGGAGTTGGCGACGAAGA |
| OsLOX3 | Os03g0700400 | GCCCAGCCGAGTTCCCATAC | GGTATCCACACAACGCTAATCTCTC |
| OsEF-Lα | Os03g0177900 | TCTTCCCCTTCAGGACGTGT | GGACCAAAGGTCACCACCAT |
利用植物脂氧合酶(LOX)ELISA检测试剂盒(南京建成生物工程研究所)测定脂氧合酶含量。该试剂盒使用双抗体夹心酶联免疫吸附法。
称取0.1 g过150 μm筛的糙米粉, 溶于0.9 mL生理盐水中, 3 000 r·min-1离心10 min; 在样品孔和标准孔中分别加待测样品10 μL和不同浓度标准样品50 μL, 然后分别在每孔加入100 μL辣根过氧化物酶(HRP)标记的检测抗体, 37 ℃恒温孵育1 h后弃上清液, 用洗涤液洗5次; 每孔加底物A、B(试剂盒内2种试剂)各50 μL, 37 ℃避光孵育15 min; 加入终止液50 μL, 15 min内测定在450 nm波长处每孔的D值; 对应的D值作为纵坐标, 绘制出标准品线性回归曲线, 按照曲线方程计算各样品的浓度值。设3个重复。
1.6 丙二醛(MDA)含量的测定利用植物丙二醛(MDA)测定试剂盒(南京建成生物工程研究所)测定MDA含量。详细步骤参见试剂盒。设2个重复。
1.7 种子耐储性表型鉴定 1.7.1 自然老化处理种子的自然老化处理参照Li等[13]的方法。将同季收获的‘宁粳1号’‘W017’和改良系XO3、XO6的种子在室内温度小于30 ℃、湿度40%~60%的条件下放置10个月。
1.7.2 人工老化处理种子的自然老化处理参照Zeng等[14]的方法。将同季收获的破除休眠的‘宁粳1号’‘W017’和改良系XO3、XO6的种子放在人工智能恒温恒湿箱中, 设置温度为40 ℃、湿度为80%, 老化处理的时间根据具体预处理结果确定。
1.7.3 发芽(速)率测定将老化处理后的种子随机数取50粒健康饱满的种子, 以胚根超过整粒种子长且胚芽超过半粒种子长为标准, 统计种子的发芽数。从放入培养箱后的2~7 d, 每天统计种子发芽率。设2个重复。
1.7.4 TTC(2, 3, 5-氯化三苯基四氮唑)法测定种子生活力参照Lopez del Egido等[15]的方法。挑选表面光滑老化处理的种子30粒泡在加水的培养皿中, 置于30 ℃培养箱处理48 h(中间换1次水), 在含有5 g·L-1 TTC(pH7.0)的PBS中避光处理2 h, 以胚被染红色的程度作为活力指标。
TTC还原量的测定参照Zhao等[16]的方法。将TTC染色后的种子表面水吸干后, 放入加有15 mL无水乙醇的试管中, 置于60 ℃水浴6 h, 把胚中红色物质提取出来, 12 000 r·min-1离心2 min, 取上清液, 测定其在490 nm处的D值, 以未经染色的种子进行同步处理作为空白对照。设2个重复。
1.8 品质相关指标测定 1.8.1 直链淀粉含量称取过150 μm筛的待测精米粉样品和4个标准样品各0.100 0 g放入100 mL容量瓶中, 加1 mL 95%(体积分数)乙醇和9 mL 1 mol·L-1 NaOH溶液, 沸水浴12 min后, 加蒸馏水定容至100 mL。吸5 mL定容后的溶液至新的100 mL容量瓶中, 加1 mL 1 mol·L-1乙酸酸化, 再加1.5 mL碘液显色, 并定容至100 mL, 静置20 min后, 在620 nm下测定D值, 计算‘宁粳1号’和改良系后代的直链淀粉含量。设3个重复。
1.8.2 总淀粉含量利用Total Starch Assay Kit(Megazyme公司)测定总淀粉含量。设置对照组:试管1为100 μL ddH2O+3 mL GOPOD(试剂酶); 试管2为100 μL D-葡萄糖+3 mL GOPOD, 50 ℃水浴30 min, 测定510 nm下的D值。总淀粉含量=D待测样品/DD-葡萄糖×0.9×100。设3个重复。
1.8.3 胶稠度称取过150 μm筛的精米粉100 mg, 放入10 mL玻璃试管内, 加0.2 mL 95%乙醇麝香草酚蓝溶液和0.2 mol·L-1的KOH溶液2 mL, 在水浴锅中煮沸8 min, 取出试管, 置于室温冷却5~10 min, 冰水浴20 min, 然后把试管水平放置在铺有方格坐标纸的水平台桌上静置1 h, 记录米胶流淌后的长度。设3个重复。
1.9 农艺性状调查在南京农业大学土桥实验基地, 将‘宁粳1号’和后代改良的转基因家系各种植3个小区, 以主穗抽出1 cm为标准调查抽穗期; 在黄熟期, 每个小区随机挑选20株调查株高、有效分蘖数; 收取相应单株的稻穗调查每株结实率, 脱粒烘干后, 用万深SC-G自动考种仪(杭州万深检测科技公司)测量千粒质量。
2 结果与分析 2.1 OsLOX-RNAi植株分子鉴定为挑选出含有目的片段但不含有潮霉素的植株, 对每个家系各世代的单株进行分子标记检测。表 3列出了XO3和XO6在T3-4、T4-5、T5-6代的选择情况, 每世代从待鉴定的植株中利用分子标记鉴定选择阳性植株, 再从中挑选不含潮霉素的植株, 发现随选择世代的提高, 选择效率也逐渐提高, 到T5-6代目的片段的选择效率已经接近100%。
| 家系 Family |
世代 Generations |
总株数 Total number of plants |
阳性植株数 No. of positive plants |
不含潮霉素株数 No. of no hygromycin strain |
选择效率/% Selection efficiency |
| XO3 | T3-4 | 181 | 181 | 85 | 46.9 |
| T4-5 | 160 | 160 | 132 | 82.5 | |
| T5-6 | 120 | 120 | 118 | 98.3 | |
| XO6 | T3-4 | 178 | 176 | 79 | 44.4 |
| T4-5 | 150 | 150 | 127 | 84.7 | |
| T5-6 | 120 | 120 | 116 | 96.7 |
利用目的基因和潮霉素抗性分子标记对每个世代的转基因水稻进行分子检测。如图 1所示:分别选择XO3和XO6两个改良家系的10个独立转基因植株进行分子鉴定, 发现挑选的这20个家系不含潮霉素(图 1-A、B), 但含有目的片段(图 1-C、D)。
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图 1 XO3(A、C)和XO6(B、D)的T4-5代植株基因型鉴定 Fig. 1 Identification of genotypes of T4-5 plants transgenic with XO3(A, C)and XO6(B, D) A, B. XO3和XO6转基因家系植株潮霉素鉴定; C, D. XO3和XO6转基因植株目的片段鉴定。M.分子量标准; “+”.阳性对照; “-”.阴性对照; 1~10分别为转XO3和XO6植株表达载体的阳性再生植株。 A, B. Identification of hygromycin in transgenic XO3 and XO6 plants; C, D. Identification of target fragments in transgenic XO3 and XO6 plants. M. Molecular weight marker; "+". Positive control lanes; "-". Negetive control; 1-10.Positive regenerated plants transformed with XO3 and XO6 plant expression vectors. |
如图 2所示:T442-1-4、T442-2-5和T443-2-2属于XO3家系, T454-1-5、T455-1-1和T455-2-7属于XO6家系。其中, XO3是双干扰(OsLOX2-OsLOX3)家系, XO6是单干扰(OsLOX2)家系, 经老化处理后, 检测吸胀4 h的种子中OsLOX2和OsLOX3基因的表达量。与‘宁粳1号’相比, 2个干扰家系中OsLOX2和OsLOX3的表达量均明显降低, 且OsLOX3降低更明显(图 2)。序列对比分析发现OsLOX2和OsLOX3基因有一定同源性, 且OsLOX2基因的干扰片段有20 bp与OsLOX3的核苷酸序列一致, 而OsLOX3基因的干扰片段只15 bp与OsLOX2的核苷酸序列一致, 即干扰OsLOX2时可能也干扰了OsLOX3, 这可能是OsLOX3干扰更显著的原因。
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图 2 自然老化处理10个月后再人工老化处理8 d种子中OsLOX3 (A)和OsLOX2 (B)的表达量 Fig. 2 Relative expression level of OsLOX3 (A)and OsLOX2 (B)in seeds under artificial aging treatment for 8 days after natural aging treatment for 10 months |
种子经过老化处理后, ‘宁粳1号’种子中脂氧合酶含量约为0.115 ng·mL-1, XO3家系的T441-1-3、T441-2-4和XO6家系的T454-1-5、T455-1-1种子中脂氧合酶含量分别为0.103、0.098、0.111、0.094 ng·mL-1(图 3), 改良系种子脂氧合酶含量比‘宁粳1号’有不同程度降低, 达到显著或极显著水平。
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图 3 自然老化处理10个月再人工老化处理8 d的种子中脂氧合酶含量 Fig. 3 The lipoxygenase content in seeds under artificial aging treatment for 8 days after natural aging treatment for 10 months *P < 0.05, **P < 0.01.The same as follows. |
老化处理后改良系种子中丙二醛的含量均低于4 nmol·mg-1, 而对照‘宁粳1号’的丙二醛含量约为6 nmol·mg-1(图 4), 表明在相同老化处理条件下, 种子中OsLOX表达量降低可减缓种子在储存过程中的脂质过氧化。
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图 4 自然老化处理10个月后再人工老化处理8 d种子中丙二醛含量 Fig. 4 MDA content in seeds under artificial aging treatment for 8 days after natural aging treatment for 10 months |
2018年5月海南收获的T5代种子, 经目的片段和潮霉素筛选后, 将种子完全破除休眠后进行人工老化或自然老化后, 进行发芽试验。自然老化处理10个月后, XO3家系的发芽率为90%左右, XO6家系的发芽率大多为95%左右, 此时, ‘宁粳1号’发芽率为74%, ‘W017’发芽率仍然是99%(图 5)。
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图 5 自然老化处理10个月XO3和XO6发芽情况 Fig. 5 The germination of XO3 and XO6 after 10 months of natural aging treatment A、B、C分别为‘宁粳1号’、XO3、XO6发芽情况; D、E分别表示XO3、XO6家系后代发芽率。 A, B, C represent the germination of 'Ningjing 1', XO3 and XO6;D, E represent germination rate of offspring of XO3 and XO6 families. |
在自然条件放置10个月又人工老化(温度40 ℃, 相对湿度80%)处理8 d后的种子进行TTC染色, 结果表明, ‘宁粳1号’被染红色的种胚数较少, 且染色较浅, 表明种子活力已显著降低, 而XO3(T441-1-3、T441-2-4)和XO6(T454-1-5、T455-1-1)的种胚染色较深, 表明其仍保持较高活力(图 6-A)。进一步量化TTCH(2, 3, 5-三苯基四唑氯化物)的含量(图 6-B), 与染色结果相符。
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图 6 自然老化处理10个月再人工老化处理8 d后XO3、XO6和‘宁粳1号’TTC染色(A)及TTCH(2, 3, 5-三苯基四唑氯化物)含量(B) Fig. 6 The tetrazolium assays(A)and TTCH(2, 3, 5-triphenyltetrazoliumchloride)content(B)of 'Ningjing 1' and XO3, XO6 under artificial aging treatment for 8 days after natural aging treatment for 10 months |
从图 7可见:7 d时, ‘宁粳1号’发芽率为31%, 而T442-1-4、T454-1-5和T455-1-1的发芽率分别为72%、71%、71%。表明OsLOX干扰后的改良系种子能保持较高活力, 耐储性得到显著提高。
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图 7 自然老化处理10个月再人工老化处理8 d后的种子发芽率 Fig. 7 Germination rate of seeds under artificial aging treatment for 8 days after natural aging treatment for 10 months |
‘宁粳1号’、XO3(T441、T442、T443)和XO6(T445、T454、T455)家系的种子, 在相对湿度80%、40 ℃条件下存储25 d后, 种子中直链淀粉含量均稍有增加, 但与未处理相比无显著差异。‘宁粳1号’在老化后直链淀粉含量增加7.1%, 而改良系在老化后直链淀粉含量增加1.4%~6.8%(图 8-A), 表明干扰家系种子的品质更为稳定。
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图 8 老化处理后种子淀粉含量和胶稠度的变化 Fig. 8 The changes in amylose content and gel consistency of seeds after different aging treatments |
自然存放10个月和老化处理25 d, XO3和XO6种子中总淀粉含量和胶稠度的变化幅度比‘宁粳1号’小(图 8-B、C), 改良系种子更为稳定。
2.7 OsLOX-RNAi植株农艺性状表现2017—2018年正季在南京土桥水稻试验站将‘宁粳1号’、XO3、XO6种植3个小区, 调查农艺性状。从表 5可见:与‘宁粳1号’相比, XO3和XO6抽穗期和千粒质量没有显著差异, XO3和XO6的分蘖数略有增加, 结实率和千粒质量有所降低, 2年结果趋势相近。表明可能是转基因只影响与育性相关的性状。
| 材料 Material |
2017 | 2018 | |||||||||
| HD/d | PH/cm | NT | SSR/% | TGW/g | HD/d | PH/cm | NT | SSR/% | TGW/g | ||
| 宁粳1号Ningjing 1 | 104.7±0.5 | 84.5±2.2 | 8.1±2.2 | 91.4±2.5 | 25.3±2.1 | 103.0±2.6 | 85.8±2.1 | 7.3±1.5 | 88.7±0.02 | 26.2±2.2 | |
| XO3 | 103.4±0.7 | 82.4±1.7 | 9.3±1.3* | 82.4±1.5** | 23.5±1.1 | 100.0±1.3 | 86.1±2.7 | 9.4±1.5* | 80.7±0.04** | 24.6±0.7* | |
| XO6 | 103.7±1.1 | 83.1±1.1 | 9.2±1.2* | 83.1±2.7** | 21.3±2.5** | 103.0±2.5 | 80.6±2.9* | 9.2±1.2* | 82.3±0.05** | 21.0±1.5** | |
| 注: 1) HD:抽穗期Heading date; PH:株高Plant height; NT:分蘖数Number of tillers; SSR:结实率Seed setting rate; TGW:千粒质量1 000-grain weight. 2) *和**表示与‘宁粳1号’相比在0.05和0.01水平上差异显著。* and ** mean significant difference at 0.05 and 0.01 probability levels compared with ‘Ningjing 1’. |
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稻米陈化是一个涉及贮藏物质淀粉、脂质、蛋白等氧化变质的复杂过程。研究表明, 影响种子寿命的主要因素有脂质氧化代谢[3-4]、蛋白质变性、DNA损伤[17-18]和热休克因子[19-20]等。水稻种子在陈化过程中表现出种子活力降低、糙米表面变黄变暗、稻米蒸煮成米饭后的营养成分变化、不良气味产生、食味品质下降、营养价值降低等。脂质代谢是脂质膜降解、细胞渗漏和种子变质的重要原因, 进而影响种子寿命。虽然可通过改善储存条件, 如降低储存环境的温度、湿度, 延缓劣变的进程, 但增加储存成本, 也不适用于农家稻谷日常存放。因此, 明确稻米陈化的遗传机制, 从遗传上改良水稻的耐储藏特性, 培育出耐储藏水稻品种是经济有效的途径。
在1993年, 日本学者Suzuki等[21]利用LOX-3的单克隆抗体, 鉴定1个泰国水稻地方品种‘Daw Dam’为LOX-3缺失的突变体, 进一步的储藏试验表明, LOX-3的缺失可有效延缓稻米的陈化, 提高其耐储性。如在4 ℃和37 ℃分别储藏30 d和60 d, ‘Daw Dam’米糠中不饱和脂肪酸的过氧化值(peroxide value)和羰基值(carbonyl value)均明显低于LOX-3正常品种(如‘越光’), 进一步的气质联用(gas chromatography-mass spectrometry, GC-MS)分析表明, 在37 ℃储藏8周, ‘Daw Dam’稻谷中乙醛、戊醛、己醛等陈化物质的积累量仅为LOX-3正常品种的20%~35%[22]。表明脂氧合酶对脂质降解起关键作用, 其缺失显著延缓脂质降解, 提高耐储性。但‘Daw Dam’的农艺性状很差, 高秆、易倒伏、产量很低; 将‘Daw Dam’作为供体, 经过十余年的改良, 我们培育出品质优耐储藏的‘W017’[12], 但其仍存在易倒伏、产量低的缺点。本研究在前期工作基础上, 通过RNA干扰技术, 以水稻品种‘宁粳1号’为受体, 转化OsLOX-RNAi进行遗传构建, 通过多年的分子鉴定和表型鉴定, 获得了能稳定遗传的具耐储性的2个干扰家系:XO3和XO6。分析发现无论是自然存放还是人工加速老化处理, 改良系的耐储性都比受体亲本‘宁粳1号’显著增强。OsLOX定量分析和脂氧合酶含量的测定结果表明, 2个干扰家系XO3和XO6的OsLOX表达量显著降低, 且酶含量也显著降低, 较好地解释了耐储性增强的原因。在人工老化和自然存放后, 2个干扰家系XO3和XO6的直链淀粉含量、总淀粉含量、胶稠度等品质性状的变劣速度均明显慢于受体品种, 表明改良系种子的品质变化更为缓慢; 抽穗期、穗长、长/宽和千粒质量等农艺性状没有显著性差异, XO3和XO6的分蘖数和有效穗数略有增加, 而结实率和千粒质量有所降低, 出现一些空壳、瘪粒, 因此, 这些材料还需要进一步改良结实率和粒质量。
在目前的转化系统中, 一般需要使用抗生素抗性基因或除草剂抗性基因作为选择标记基因筛选转化细胞, 然而转基因植物中存在选择标记基因可能会对环境和人类健康的安全性造成影响, 人们担心选择标记基因及其产物可能具有毒性或会引起过敏反应; 如选择标记基因转移到微生物中可能增强病原微生物的抗药性, 从而引起抗生素失效; 抗除草剂的抗性基因可能平行转移到杂草中, 使其成为难以控制的杂草, 造成生态平衡的破坏, 因此, 培育无选择标记基因的安全的转基因植物具有重要意义[23]。本研究利用双T-DNA载体系统, 将目的基因OsLOX-RNAi和选择标记基因分别插入2个独立的T-DNA结构域, 因此具有选择标记的T-DNA和含有目的基因的T-DNA可以被整合到水稻基因组的不同染色体上, 两者可以在水稻自交后代发生分离, 产生无选择标记基因但含目的基因的纯合转基因家系, 我们借助分子标记检测手段, 筛选目标转基因水稻家系, 从而满足转基因安全评价的要求。目前我们得到的改良系耐储性较‘宁粳1号’显著提高, 但较LOX3缺失的‘W017’仍有一定差距, 这可能是RNA干扰家系仅在mRNA水平上干扰了基因的表达, 并不能完全把靶基因从基因组中剔除, 导致脂氧合酶仍有一定活性。因此, 我们将考虑利用CRISPR-CAS9基因编辑的方法, 将OsLOX完全敲除, 以进一步提高种子的耐储性。
致谢: 农业部长江中下游粳稻生物学与遗传育种重点实验室、长江流域杂交水稻协同创新中心、现代作物生产省部共建协同创新中心给予支持。
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