猪传染性胃肠炎(transmissible gastroenteritis, TGE)是由猪传染性胃肠炎病毒(transmissible gastroenteritis virus, TGEV)引起的猪的一种高度接触性消化道传染病, 临床表现以仔猪厌食、呕吐、水样腹泻、脱水和体质量减轻为主^[1]。各年龄段的猪均易感, 低于2周龄的仔猪在流行期间感染后死亡率高达90%~100%, 5周龄以上的猪死亡率低, 但往往发展成为僵猪, 生长迟缓, 饲料报酬低。每年的12月至第二年的4月为该病的流行性传染阶段^[2]。近年来, 猪传染性胃肠炎在我国呈上升趋势, 常伴随猪流行性腹泻病毒(porcine epidemic diarrhea virus, PEDV)、猪轮状病毒(porcine rotavirus, PRV)等混合感染, 流行形势颇为严峻, 是严重威胁养猪业的主要腹泻病原之一^[3]。其致病原因主要在于破坏猪小肠黏膜, 引起肠道黏膜上皮屏障功能受损。本文主要综述了TGEV感染对肠道屏障功能的影响, TGEV诱导先天免疫反应的作用机制及抵抗TGEV感染的营养调控措施, 旨在寻求有效缓解TGEV引起猪肠道损伤的营养调控手段。

1 猪传染性胃肠炎病毒

猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)属于尼多病毒目(Nidovirales)、冠状病毒科(Coronaviridae family)、冠状病毒属(Coronavirus), 是一种包膜、单股正链的RNA病毒。TGEV基因组长28.5 kb, 包含至少9个开放阅读框(open reading frames, ORF)^[4]。TGEV通过口鼻途径传播, 并在仔猪的肠黏膜上皮细胞和肺泡巨噬细胞中复制, 在恶劣条件下造成肺的广泛损伤, 并随后经消化道或血液侵入小肠^[5]。TGEV能抵抗胃酸的低pH值环境和蛋白水解酶, 感染高度敏感的小肠黏膜上皮细胞, 使其迅速受到破坏而脱落, 导致空肠和回肠绒毛萎缩甚至破裂, 渗透压失衡而腹泻脱水, 且使用抗生素治疗无效。因此, 2018年TGEV被国际兽医局(World Organisation for Animal Health, OIE)列为117种烈性传染病之一^[6]。在规模化和集约化养殖条件下, 猪传染性胃肠炎造成巨大的经济损失, 严重危害养猪产业的发展。

2 TGEV损伤肠道屏障功能

肠道不仅是营养物质消化和吸收的主要场所, 而且是抵抗外源致病微生物(病原体和毒素)入侵的重要生理屏障。完整的肠道屏障功能包括机械屏障、化学屏障、生物屏障及免疫屏障^[7-8]。仔猪感染TGEV后, 肠内充满白色至黄色液体, 肠壁变薄且缺乏弹性, 肠管扩张呈半透明状, 肠系膜充血; 小肠黏膜绒毛变短和萎缩; 肠上皮变性明显, 上皮细胞不是柱形而是扁平至方形的未成熟细胞; 黏膜固有层内可见浆液渗出和细胞浸润^[9]。对仔猪进行TGEV攻毒后, 仔猪回肠派伊尔氏结(Payer ’ s patches, PP)区域明显缩小, SIgA阳性细胞、CD₃⁺细胞和树突状细胞数量显著降低, 并能降低有益菌群数量, 增加有害菌群数量^[10]。TGEV感染猪小肠上皮细胞(IPEC-J2)20~60 min能够逐渐降低小肠的跨膜电阻, 紧密连接蛋白Occludin、ZO-1和黏着连接蛋白E-cadherin的表达均显著下降, 说明TGEV感染早期能破坏肠道上皮机械屏障的完整性^[11]。此外, TGEV引起肠道腹泻与小肠上皮细胞刷状缘膜中Na⁺/H⁺交换蛋白(Na⁺/H⁺exchanger-3, NHE3)的功能密切相关。细胞膜转运蛋白和离子通道转运蛋白在肠上皮细胞中的活性降低, 导致Na⁺转运中断或吸收分泌失衡, 导致肠上皮细胞营养物质和水电解质大量流失。随着Na⁺吸收的降低, 肠道渗透压异常升高, 导致腹泻脱水甚至死亡。研究发现TGEV感染能够显著降低Na⁺/H⁺交换蛋白NHE3表达, 从而影响Na⁺从细胞外到细胞内的转运^[12]。

3 TGEV诱导炎性免疫反应

TGEV的致病性与其诱导的炎症反应密切相关。炎性因子对病原体的清除非常重要, 而过度的炎症则可能造成组织损伤。病毒感染宿主后能够引起机体先天性免疫并产生获得免疫应答, 产生一系列细胞因子和趋化因子, 在TGEV诱导炎症反应和抵抗TGEV逃避宿主天然免疫反应中发挥重要作用。细胞因子和趋化因子主要通过NF-κB、MAPK及Ⅰ型干扰素3条信号途径产生。

3.1 NF-κB信号途径

NF-κB在TGEV诱导炎症和调控免疫反应过程中发挥重要作用^[13]。TGEV编码的非结构蛋白nsp2是参与炎症调节的关键病毒蛋白, 其N端1~120个氨基酸残基能显著激活NF-κB^[14]。荧光素酶试验结果表明, NF-κB活性随TGEV病毒复制量增加而显著升高; TGEV通过诱导p65的核转移激活NF-κB信号通路^[15], 显著提高下游IL-1β、IL-6、IL-8、TGF-β和TNF-α的mRNA表达水平^[16]。研究表明, NF-κB抑制剂(BAY11-7082)使TGEV诱导的炎性细胞因子表达量呈剂量依赖性下降, 说明细胞因子的表达依赖于NF-κB的调控^[17]。

3.2 MAPK信号途径

MAPK信号途径主要包括胞外信号调节激酶(extracellular signal-regulated kinase, ERK)、c-Jun氨基端激酶(c-Jun NH₂ terminal kinase, JNK)和p38蛋白激酶信号通路。ERK1/2主要介导细胞增殖和分化。JNK参与调控炎症反应, 短暂激活能够引起T细胞的活化, 而JNK的持续活化则会引起细胞凋亡。p38 MAPK信号转导参与机体炎症反应、免疫应答和细胞凋亡。TGEV感染通过激活MAPK信号通路, 调节肠上皮细胞紧密连接蛋白的表达和微丝重塑^[11]。TGEV感染早期能够激活IPEC-J2细胞的ERK1/2和JNK蛋白, 降低IPEC-J2细胞跨膜电阻, 增加细胞旁路渗透性, 下调IPEC-J2细胞的紧密连接蛋白Claudin-1和Occludin的表达, 破坏肠上皮细胞紧密连接完整性, 因此推测TGEV早期损伤IPEC-J2细胞可能与ERK1和JNK蛋白的激活相关。TGEV感染后期, ERK1/2和p38被抑制, 但JNK1/2的磷酸化表达增强, 由c-Jun和c-fos组成的转录因子AP-1的荧光素酶活性最高^[18-19], 表明TGEV通过激活JNK1/2, 进一步激活AP-1, 从而启动多种炎性因子的转录。

3.3 Ⅰ型干扰素信号途径

由于TGVE编码各种结构蛋白和非结构蛋白, 因此其与宿主先天免疫反应的相互关系更为复杂^[20]。通常由病毒感染产生的Ⅰ型干扰素(IFN-Ⅰ)可通过与其特异性受体IFNAR结合, 激活JAK-STAT信号通路, 使STAT1发生磷酸化和核转位, 诱导抗病毒因子和炎性细胞因子的表达。研究表明, TGEV感染产生大量IFN-Ⅰ, 同时上调抗病毒效应分子干扰素刺激基因15(ISG 15)、干扰素诱导蛋白1(IFIT1)和IFIT44的表达^[21-22], 但病毒仍能够高效复制^[23-25]。其原因可能是TGEV感染能够激活非折叠蛋白应答(unfolded protein response, UPR)的IRE1α(inositol-requiring enzyme 1 α)信号通路, 通过下调miR-30a-5p的表达, 提高SOCS1(suppressor of cytokine signaling protein 1)和SOCS3的表达水平, 从而抑制干扰素的抗病毒效应, 促进病毒感染^[26]。

4 TGEV诱导炎性免疫反应的信号机制

在病毒感染和复制过程中, 宿主先天免疫应答作为第一道防线, 能够利用模式识别受体(pattern recognition receptor, PRR)来感测和响应入侵病毒的病原体相关分子模式(pathogen-associated molecular pattern, PAMP)。模式识别受体主要包括维甲酸诱导基因Ⅰ(RIG-Ⅰ)样受体(RLR)、Toll样受体(TLR)、核苷酸结合寡聚化结构域样受体(nucleotide-binding oligomerization domain-like receptor, NLR)及黑色素瘤2样受体(absent in melanoma 2-like receptors, ALR)等^[15]。TGEV入侵宿主细胞后, 其基因组核酸、复制过程中产生的中间产物dsRNA和蛋白等主要通过介导天然免疫反应中2条重要的信号通路——RIG-Ⅰ样受体(RLR)信号通路和TLR信号通路, 发挥先天抗病毒免疫应答反应。

4.1 RLR信号通路

细胞在静息情况下, 未活化的RIG-Ⅰ处于自我折叠状态, 其阻遏域区遮盖了其他的功能域, 抑制了半胱天冬酶激活和募集域(Caspase activation and recruitment domains, CARD)发挥信号传递的功能。当细胞受到病毒感染时, RIG-Ⅰ的C端与病毒RNA结合后导致其构象改变, 将CARD区暴露于外侧, 招募下游接头蛋白线粒体抗病毒蛋白IPS-1, IPS-1被激活后通过其脯氨酸富集区与肿瘤坏死因子相关因子3(TNF receptor-associated factor, TRAF3)相互作用, 募集并激活TANK结合激酶1(TBK-1)和IκB激酶ε(IKKε), 进一步使下游分子IRF3和IRF7等磷酸化, 启动Ⅰ型干扰素的表达。除此之外, 活化的IPS-1还能通过脯氨酸富集区与TRAF6/2结合, 通过IKKa/β/γ复合物激活NF-κB, 诱导炎性细胞因子的表达。同时, IPS-1通过与具有凋亡结构域的Fas相关蛋白(Fas-associated protein with death domain, FADD)相互作用, 后者与Caspase-8和Caspase-10形成复合物共同参与NF-κB的激活。同样, 黑色素瘤分化相关基因5(MDA5)也能够识别病毒并激活下游因子IRF3、IRF7和NF-κB。两者的区别在于MDA5识别大于1 kb的长片段dsRNA, 而RIG-Ⅰ则识别较短的dsRNA片段^[27-28]。TGEV感染能够上调β干扰素TIR结构域衔接蛋白(TRIF)、肿瘤坏死因子受体相关因子(TRAF)、MDA5、RIG-Ⅰ和IPS-1 mRNA水平^[23]。TGEV感染PK-15细胞能够通过调控RIG-Ⅰ和MDA5而影响NF-κB的活性, 从而调控细胞因子的表达^[17]。

4.2 Toll样受体信号通路

TLR通路是另一条介导TGEV诱导宿主产生先天免疫应答的通路。TLR属于Ⅰ型跨膜蛋白家族, 能够招募具有TIR结构域的特异性衔接分子——MyD88和TRIF, 并启动下游信号传导, 导致炎症细胞因子、Ⅰ型干扰素、趋化因子和抗菌肽的分泌^[29-30]。TLR3、TLR7和TLR9分布于细胞内, 在内质网处于稳定状态, 需转运至核内体中与配体结合。TLR3主要识别dsRNA病毒基因组的RNA以及ssRNA病毒在复制过程中产生的dsRNA。其结构外域具有1个大的马蹄形形状, 可能起到增加其表面积和促进识别来自病毒或病毒感染细胞的dsRNA的作用。dsRNA结合到TLR3外域凸面外侧的N-和C-末端, 有助于通过C-末端区域形成同二聚体。TLR3依赖TRIF途径, 激活IRF3和NF-κB信号通路, 诱导Ⅰ型干扰素和炎症细胞因子的表达。在浆细胞样DC中, TLR7识别内溶酶体中来源于ssRNA病毒的ssRNA, 并通过MyD88分别激活NF-κB和IRF7以诱导炎症细胞因子和Ⅰ型干扰素。此外, 自噬还参与向表达TLR7的小泡传递ssRNA的过程。TLR9识别来自DNA病毒和细菌的DNA。下游信号转导需要细胞蛋白酶分解TLR9。TLR9招募MyD88而激活NF-κB和IRF7信号通路^[31]。研究表明, TGEV感染能够显著促进TLR1、TLR2、TLR3、TLR4、TLR6、TLR7和TRIF mRNA的表达^[32-33]。UV-TGEV(经紫外线处理的TGEV)能显著促进TLR1和TLR2 mRNA表达^[34]。因此, 推测TGEV的ssRNA能够被TLR3/7识别, 而TLR1、TLR2、TLR4和TLR6能够识别病毒蛋白, 从而激活下游NF-κB信号通路。

5 调控TGEV感染的营养途径

目前, 还没有针对TGEV病原体本身的有效治疗方法。由于病毒基因变异, 疫苗的普遍治疗性存在弊端, 处方药也只对临床症状产生作用。因此开发有效的营养方案成为调控TGEV感染的重要手段。

5.1 氨基酸

氨基酸一方面可以改善肠道物理结构的完整性, 维持正常的生理屏障功能; 另一方面通过调控细胞因子, 提高局部和整体免疫水平, 从而保护宿主免受疾病侵害^[35]。mTOR信号通路与肠道健康有关, 在肠道黏膜免疫调控中扮演着重要的角色。PEDV强毒株通过下调mTOR及其下游靶点4EBP1和p70S6k的活性来抑制Vero细胞的蛋白合成^[36], 而日粮中添加亮氨酸(Leu)能够提高PEDV感染仔猪的免疫功能, 进一步缓解PEDV感染仔猪引起的应激反应^[37]。添加Glu可以提高仔猪空肠绒隐比, 促进Claudin-1的蛋白表达以及mTOR(Ser²⁴⁴⁸)的磷酸化水平^[38]。以上结果提示:饲粮中添加氨基酸, 可能通过调控mTOR信号途径以抵抗TGEV感染。进一步研究表明, 抑制mTOR活性能够引起小鼠肠上皮细胞缺陷和肠道绒毛萎缩^[39]。Leu能够激活mTOR信号通路, 促进IPEC-J2细胞的紧密连接蛋白ZO-1、ZO-2和Claudin-3的表达, 调节蛋白质合成和代谢, 包括酶参与的生化反应^[40]。饲粮中添加10 g · kg^-1 Leu, 可能通过小肠mTOR磷酸化而有效缓解猪轮状病毒对仔猪空肠黏膜的损伤^[41]。当结节性硬化复合物2(TSC2)基因被敲除后能够激活mTOR, 使NF-κB活性下降, 并下调IL-6、IL-10和IL-12的表达^[42]。因此, 推测氨基酸通过调控mTOR活性来调节NF-κB活性, 两者在调控TGEV引起的肠道炎症反应过程中发挥重要作用。

5.2 中草药

体内与体外试验证明中草药具有预防TGE的作用。研究表明, 复方参术汤、复方连翁汤、复方参附汤和苦参碱能抑制TGEV对猪小肠黏膜上皮细胞的吸附作用, 保持细胞的活性, 起到抵抗TGEV的效果, 并通过提高相关抗病毒因子(IFN-β、TNF-α、TLR3、NF-κB)的表达来抑制TGEV的增殖^[43]。黄芪多糖能够显著增加巨噬细胞IL-1β、IL-6和TNF-α的分泌, 促进TLR4信号通路相关基因(TLR4、MyD88、TRAF-6、NF-κB和AP-1)及其蛋白的表达, 调节免疫功能^[44]。此外, 中草药能够促进补体C3和C4的生成, 提高自然杀伤细胞的活力^[45]。因此, 中草药能够通过增强机体的非特异性免疫发挥抗病毒作用。

5.3 维生素

饲粮中补充维生素有利于动物生长、肠道发育以及免疫功能, 并能够缓解不同应激带来的负面作用。研究表明, 饲粮中添加200或500 IU维生素D能够缓解猪轮状病毒对猪的损伤, 显著上调RIG-Ⅰ、IPS-1以及抗病毒因子IFN-β和ISG15的mRNA的表达, 说明补充维生素D可以激活RIG-Ⅰ信号通路, 从而减轻病毒引起的负面影响^[46]。维生素D还能够阻断NF-κB p65向细胞核转移, 抑制NF-κB表达, 从而调节炎症细胞因子的表达, 调控宿主的先天性免疫, 进而缓解应激源对机体的损伤^[47]。以上研究结果提示, 维生素D可能通过RLR信号通路激活下游NF-κB信号途径, 从而缓解TGEV对肠道的损伤。

6 总结和展望

猪传染性胃肠炎破坏肠道黏膜免疫屏障功能, 引起仔猪肠道损伤。受TGEV感染宿主通过调控RIG-Ⅰ/MDA5和TLR3/7, 进一步激活MAPK和NF-κB信号通路, 产生炎性细胞因子, 诱导Ⅰ型干扰素表达, 激活JAK-STAT信号通路产生抗病毒作用, 宿主启动天然免疫反应。氨基酸、维生素和中草药可以作为营养调控手段, 在调控TGEV逃避宿主天然免疫反应过程中发挥重要作用。因此, 有必要进一步深入研究不同营养策略对TGEV感染引起炎症反应的机制。