脂肪干细胞(adipose-derived mesenchymal stem cells, ADSC)被认为是一类来源于脂肪组织的间充质干细胞^[1]。脂肪组织在动物体内储存充分, 获取脂肪组织的操作简单, 损伤较小。同时ADSC性状稳定, 各种临床研究和应用中证明ADSC具有分化为肌肉、骨、表皮、内皮及血细胞等多种细胞的潜能^[2], 还可以通过旁分泌作用降低目标组织的炎性反应, 加速损伤的复原。ADSC已经成为组织工程和再生医学的研究热门之一。

犬是最常见的伴侣动物以及新型实验动物之一。随着生活水平的提升, 犬的老年疾病在临床上变得更加常见, 尤其是多种慢性疾病, 比如骨关节炎(osteoarthritis, OA)^[3]、髋关节发育不良(canine hip dysplasia, CHD)^[4]等。这些疾病目前没有特别有效的治疗方法, 不仅影响了患病动物的生活质量, 还需要主人投入大量时间和金钱。目前已经有学者开始进行干细胞治疗各种犬类疾病的研究。Pérez-Merino等^[5]研究发现, 静脉注射同种异体ADSC可改善炎症性肠病患犬的胃肠道病变及炎症。在OA的治疗中, 张贝莹等^[6]通过移植犬脐带间充质干细胞, 明显抑制了犬关节损伤导致的炎症反应。滕鑫^[7]在使用ADSC修复犬膝关节软骨组织损伤的试验中也获得了相似结论。夏菁等^[8]发现通过移植ADSC治疗犬心肌梗死时, ADSC可以在心肌细胞内存活, 并在一定程度上改善急性心肌梗死后心力衰竭犬的心脏功能。将间充质干细胞与组织支架结合进行器官修复也是近期研究热门之一, 郭宇^[9]发现应用胶原支架材料结合骨髓间充质干细胞(bone narrow mesenchymal stem cells, BMSC)重建犬膀胱后, 犬的泌尿功能得到恢复。以上研究报道说明干细胞在治疗犬疾病的临床研究中愈加受到人们的重视。

ADSC作为一种具有优势的干细胞, 在犬的各种慢性疾病的治疗中具有极大的临床应用潜能。因此, 分离和建立ADSC系将会对干细胞的临床转化应用及进一步进行犬疾病模型的干细胞治疗评价奠定基础。

1 材料与方法 1.1 试验材料 1.1.1 试验动物

健康比格犬由南京农业大学动物医学院提供, 雄、雌各2只, 12~24月龄, 体质量7~10 kg。动物实验方案经南京农业大学实验动物使用与管理委员会批准。

1.1.2 主要试剂与仪器

试剂:胎牛血清、DMEM、PBS、25 g · L^-1胰蛋白酶和EDTA均购自Gibco公司; 成骨、成软骨、成脂诱导分化培养基均来自于Cyagen公司; 1 g · L^-1Ⅰ型胶原酶和茜素红、阿尔新蓝及油红O染料分别购自Sigma公司和Amresco公司; 抗人CD29-PE单克隆抗体、抗犬CD45-FITC荧光单克隆抗体及抗犬CD34-PE单克隆抗体均来自美国Pharmingen公司。

仪器:流式细胞仪(Aria Ⅱ, Becton Dickinson), 倒置相差显微镜(Olympus), CO₂培养箱、低温离心机(Thermo)。

1.2 试验方法 1.2.1 犬脂肪组织的提取与ADSC分离培养

将犬常规麻醉后剪毛, 碘酊、乙醇消毒, 在无菌条件下于腹部做十字切口, 皮下游离至腹股沟, 采取腹部和腹股沟处皮下脂肪, 用生理盐水冲洗脂肪组织, 再用75%乙醇消毒, 将脂肪组织置于保存液中2~8 ℃恒温保存。用0.9 g · L^-1氯化钠注射液冲洗获得的脂肪组织, 重复2~3次, 去除血渍。75%乙醇浸没整块脂肪组织消毒灭菌。用氯化钠注射液重复洗涤去除残留乙醇。用眼科镊子剥除包绕脂肪组织的筋膜和血管, 放入无菌平皿中, 加入适量PBS, 去除血污并充分剪碎。获得的脂肪组织用1 g · L^-1胶原酶Ⅰ型37 ℃振荡消化60 min后, 将消化好的脂肪组织放入冷冻离心机, 4 ℃、400 g离心5 min; 去除离心产物中的上层油脂及上清液, 加入适量PBS混匀沉淀, 经过100 μm细胞筛网过滤, 离心并去上清液; 向所得沉淀中加入红细胞裂解液重悬细胞, 静置5 min后, 加入PBS终止红细胞裂解液的作用, 离心并取细胞沉淀, 加入适量含10% FBS的DMEM培养液重悬后计数, 接种于培养瓶中(接种密度为5×10³ cm^-2)。原代细胞培养:将上述培养瓶放置于CO₂培养箱培养, 37 ℃、5% CO₂及饱和湿度培养24 h, 使ADSC贴壁, 更换培养液去除未贴壁细胞, 之后每2~3 d更换培养液; 待细胞汇合率达70%~90%, 使用0.25 g · L^-1胰蛋白酶进行常规消化收获得到原代细胞, 用自设冻存程序冻存细胞, 建立原代细胞主细胞库; 将所述原代细胞接种于培养瓶中(接种密度为5×10³ cm^-2), 置于37 ℃、5% CO₂培养箱中培养不超过4 d, 每2~3 d更换培养基。在此期间, 在显微镜下观察细胞形态及生长状态, 当细胞融合度达到70%~90%后, 用胰酶消化收获得到第1代细胞, 按上述方法传代, 获得第3代细胞, 进行表面抗原及体外分化潜能鉴定。

1.2.2 流式细胞术检测犬ADSC表面特异性蛋白

将第3代犬ADSC样品移入相应流式管内, 加入1 mL PBS充分混匀, 500 g离心5 min, 取细胞沉淀, 重复洗涤2次; 加入适量PBS混悬细胞, 过滤, 计数, 将细胞浓度调整为(2.0~6.0)×10⁶mL^-1待用; 取出若干支流式管, 分别加入各组抗体5 μL及同型对照试剂(避光操作)。然后将准备好的细胞样品加入已加入抗体试剂的流式管内, 每管100 μL, 充分混匀, 置4 ℃冰箱避光孵育30 min; 孵育完成后每管加入1 mL PBS, 充分混匀, 500 g离心5 min, 取细胞沉淀, 重复洗涤1次, 调整细胞悬液体积至200 μL左右, 上流式细胞仪检测。鉴定来自所有供体犬的各个表面抗原的荧光强度并比较其差异性。

1.2.3 ADSC的分化潜能鉴定

选取生长状态良好的第3代细胞, 将用于成骨、成脂以及成软骨诱导分化的细胞分别按照合适密度接种于24孔板(每项诱导重复4个孔), 添加常规培养基培养24 h后观察。当细胞汇合率达到80%以上时, 每项诱导选择2孔, 添加相应的诱导培养基作为处理组, 而另2孔更换常规培养基作为对照组, 该日期记作D0。随后每3 d换液1次。经过21 d诱导后, 用相应的染色试剂盒进行染色(成骨诱导用茜素红, 成软骨诱导用阿尔新蓝, 成脂诱导用油红O), 以鉴定该样本三系分化的结果。

1.3 数据统计处理

试验数据均以平均值±标准误(x±SE)表示, 用SPSS 20.0软件对数据进行处理, 并进行单因素方差分析(One-way ANOVA)。

2 结果与分析 2.1 ADSC的形态学观察

原代细胞培养24 h后可见梭形贴壁细胞(图 1-A), 48 h首次换液后可见贴壁细胞开始呈现长梭形、多角形(图 1-B)。约7 d后细胞密度达80%~90%时, 细胞形态均一, 为长梭形(图 1-C)。

2.2 ADSC表面特异性蛋白的流式细胞术检测

从图 2可见:本试验从1只犬获得的ADSC的表面抗原CD34、CD45表达率分别为0.5%和0.3%, 而CD29的表达率为99.9%。在其他3只供体犬中分离出的ADSC中也获得了类似的检测结果, 各表面抗原表达差异性不显著(P > 0.05)。以上结果表明分离获得的细胞符合间充质干细胞的基本特征。

2.3 ADSC分化潜能鉴定 2.3.1 成骨分化及鉴定

诱导21 d后, 处理组细胞茜素红染色可以看到大量红色的钙化结节(图 3-A)。而对照组细胞形态无明显变化, 且最终不能被茜素红着色(图 3-B)。

2.3.2 成软骨分化及鉴定

处理组样本在诱导7 d后已成球(成骨的标志之一), 最终可以成功被阿尔新蓝染成蓝色(图 3-C)。对照组细胞形态无明显变化, 且无法被阿尔新蓝染色(图 3-D)。

2.3.3 成脂分化及鉴定

处理组样本在诱导21 d时细胞收缩明显, 脂泡汇聚成大脂滴, 经油红O染色后明显被染成红色(图 3-E)。对照组细胞形态无明显变化, 无法被油红O染色(图 3-F)。

3 讨论

ADSC来源于发育早期的中胚层和外胚层, 是间充质干细胞的一种, 它可从机体脂肪组织中分离获得, 离体培养的脂肪干细胞呈纺锤状, 具有贴壁生长的特点^[10]。因其具有多向分化潜能、造血支持和促进干细胞植入、免疫调控和自我复制等特点^[11-12]已经成为组织工程和再生医学最受欢迎的干细胞之一。在本研究中, 我们依照文献[13]的方法成功地从犬腹腔脂肪组织中分离并鉴定了犬ADSC。该法简便易行, 在不同年龄、性别和品种的狗中均可复制。本试验中分离出来的细胞生长旺盛。在形态学上, P3代起细胞形态稳定, 表现为细长梭形, 大量增殖后细胞群呈旋涡状排列, 符合脂肪间充质干细胞的形态特征。此外, 本试验获得的犬ADSC具有良好的自我更新能力, 可在较短的时间内获得较多的细胞数量, 以满足临床研究需要。

细胞表面抗原是ADSC鉴定的关键, 但是目前尚未发现其特异性抗原表型。研究表明间充质干细胞的表面分子CD73、CD29及CD105表达阳性, CD31、CD45、CD34、CD11b/CD14、CD79α/CD19及人类白细胞抗原DR(human leukocyte antigen-DR, HLA-DR)表达阴性^[14]。本研究中, 我们对分离出的细胞进行了流式细胞学检测, P3代细胞都高表达间充质干细胞表面标志CD29(>90%), 而几乎不表达造血细胞标志CD34、CD45(< 2%)。整体阳性抗体的高表达和阴性抗体的低表达结果, 提示分离细胞具备间充质干细胞的特点且没有被血管内皮细胞污染, 表明按本试验方法分离获得的细胞为间充质干细胞且纯度很高。间充质干细胞具有三系分化的能力, 即成脂、成骨、成软骨分化^[15]。本试验中我们利用已发表的技术对获得的细胞进行三向诱导分化, 分离的细胞都表现出分化特性。成骨诱导中, 诱导21 d, 茜素红染色后镜下可见细胞外有大量钙结节出现。在成软骨诱导分化7 d即可观察到代表成骨标志之一的细胞球; 最终对诱导21 d的石蜡包埋切片进行阿尔新蓝染色后可见蓝色的软骨胶原基质。成骨和成软骨鉴定结果说明ADSC在治疗骨和关节相关疾病(如OA)中具有巨大的潜力。用油红O染色进行成脂分化鉴定, 油红O染色结果显示:细胞中红染颗粒为脂滴; 细胞两端的突起缩短, 细胞逐渐变圆; 随着诱导时间的增加脂滴数量不断增多。以上结果说明按本试验方法分离得到的ADSC具有成骨、成脂和成软骨分化能力。

综上所述, 本研究初步建立了从犬腹部分离获得ADSC的培养体系, 该体系能保持培养的ADSC快速生长能力, 同时维持细胞纯度和向脂肪、骨、软骨分化的潜能, 对于研究犬ADSC的生物学特性和其功能具有重要的意义。但因本试验结果只验证了犬ADSC的三向分化能力, 为使其能更广泛地应用于临床疾病的治疗, 我们还需要验证犬ADSC向更多细胞类型的分化潜能, 比如神经细胞、心肌细胞等, 并验证分化细胞的功能, 为犬ADSC在兽医临床的应用提供理论基础。