文章信息
- 郭荔, 李香秀, 何方, 刘洋, 张瑜娟, 黄金虎, 王丽平
- GUO Li, LI Xiangxiu, HE Fang, LIU Yang, ZHANG Yujuan, HUANG Jinhu, WANG Liping
- 鸡小肠原位单向灌流法和MDCK细胞系测定美托洛尔渗透性的影响因素
- Influence factors of metoprolol permeability determination in MDCK cell lines and chicken intestine
- 南京农业大学学报, 2019, 42(3): 505-512
- Journal of Nanjing Agricultural University, 2019, 42(3): 505-512.
- http://dx.doi.org/10.7685/jnau.201810015
-
文章历史
- 收稿日期: 2018-10-14
生物药剂分类系统(Biopharmaceutical Classification System, BCS)是基于药物溶解性和渗透性测定的药物分类预测系统, 据此可将药物分为4类, 即Ⅰ类药物(高溶解度-高渗透性)、Ⅱ类药物(低溶解度-高渗透性)、Ⅲ类药物(高溶解度-低渗透性)和Ⅳ类药物(低溶解度-低渗透性)[1]。该预测系统的核心为具有相同体外溶出和渗透性能的药物具有相同的体内吸收过程, 基于此可用于指导仿制药物上市前的生物等效性豁免, 为药物的研发上市节约成本和时间[2-6]。目前该理论已被世界卫生组织(World Health Organization, WHO)[7]、美国食品及药物管理局(Food and Drug Administration, FDA)[8-9]、欧洲药品管理局(European Medicines Agency, EMA)[10]等权威机构认可。若能将BCS概念应用于兽用仿制药研发领域, 将会大大降低药物的研发成本, 加快兽药研发速度。但是, 人与畜禽在解剖学、生理学等方面以及在临床使用的药物种类上均存在较大差异, 导致药物在胃肠道中的溶解度和渗透性存在差异, 如Musther等[11]对450种化合物的分析结果显示, 相同药物的生物利用度在人与大鼠、小鼠、犬之间的相关性均较差。由此可知, 不能将人用药物BCS的研究结果直接进行种间外推, 尚待深入研究以解决局限性和方法问题, 才能付诸应用于兽药研发领域, 故本课题组率先开展的兽用药品的BCS相关研究具有重要意义。
药物在小肠的渗透性测定是BCS研究的核心内容之一。目前, 人药BCS研究中药物渗透性测定的方法主要包括体内试验法和体外细胞试验法[12]。体内试验有绝对生物利用度法、质量平衡法和小肠原位灌流法等[13-15]; 体外方法主要包括PAMPA生物膜渗透性试验、体外单层细胞模型试验、动物离体肠测定渗透性试验等[16-17]。在渗透性测定过程中, 通常采用2~3种方法进行互证, 以确保药物渗透性的正确分类。目前, FDA建议采用Caco-2细胞或者过表达人ABC转运蛋白的MDCK细胞系进行人用药物的跨膜转运和渗透性测定[18-19]。2种细胞各有特点, Caco-2细胞为人源细胞系, 虽然更能客观反映药物在人体内的情况, 但该细胞表达多种ABC转运蛋白, 无法反映每个转运蛋白对渗透性测定影响的独立作用。MDCK细胞系为犬肾细胞系, 可以快速分化生长为致密的单细胞层, 并且自身低表达或不表达各种转运蛋白, 不但能够满足药物跨膜转运研究的要求, 而且适合过表达人或其他动物的转运蛋白, 可用于独立研究每个转运蛋白对药物渗透性测定的影响, 因此目前渗透性测定的体外试验更倾向采用MDCK细胞系进行。另外, FDA建议体外细胞法测定药物渗透性时可以选用美托洛尔、普萘洛尔等高渗透性药物和甘露醇、聚乙二醇等低渗透性药物作为高、低渗透性的分类标准[6, 20]。目前兽药BCS研究刚刚起步, 渗透性测定方法仍未建立, 因此, 优化各种测定条件, 建立畜禽药物渗透性测定模型至关重要, 这是顺利开展兽药BCS研究的重要环节。本研究拟选择FDA推荐的高渗透性药物美托洛尔作为参考药物, 探讨鸡小肠原位单向灌流方法和MDCK细胞系体外转运方法测定渗透性时的相关影响因素, 为建立兽药渗透性测定方法奠定基础。
1 材料与方法 1.1 试验材料 1.1.1 试验动物健康3周龄AA白羽肉鸡30羽, 购于南京某养鸡场, 体质量(1.2±0.02)kg, 充足饮水, 饲喂不含任何药物的全价日粮。
1.1.2 MDCK细胞株及其培养MDCK细胞(犬肾细胞)购于中国科学院上海生命科学研究院细胞资源中心, 过表达鸡源Abcb 1 基因的MDCK-chAbcb1细胞为本课题组构建并保存。
1.1.3 试剂和材料酒石酸美托洛尔、庚烷磺酸钠、潮霉素B、盐酸维拉帕米(Sigma)均购自阿拉丁公司; 乙腈(TEDIA, 色谱级)购自上海安普科学仪器有限公司; DMEM培养基、胰蛋白酶、胎牛血清、Hank ’ s液、Millicell悬挂式12孔培养小室等购自南京辉亚生物科技有限公司。高效液相色谱仪购自Thermo Fisher公司; HL-2B恒流泵购自上海沪西仪器公司; Millicell® ERS-2细胞电阻仪购自Millipore公司)。
1.1.4 主要工作液配制K-R(小肠营养)液配制:精确称取CaCl2 0.37 g、MgCl2 0.02 g、KCl 0.35 g、NaCl 7.8 g、NaH2PO4 0.32 g、葡糖糖1.4 g于1 000 mL烧杯中, 待三蒸水溶解后添加NaHCO3 1.37 g, 置1 000 mL容量瓶定容, 并采用1 mol · L-1 HCl和1 mol · L-1 NaOH调节pH值分别至5、6、7。
美托洛尔标准液配制:精确称取0.004、0.04、0.4 g美托洛尔分别置于1 000 mL烧杯中, 用不同pH值(5、6和7)K-R小肠营养液溶解后置1 000 mL容量瓶定容, 得4、40和400 μg · mL-1的药物K-R液。细胞试验时, 按如上方法配制成4、40和400 μg · mL-1的药物Hank ’ s液, 采用1 mol · L-1 HCl和1 mol · L-1 NaOH调节pH值分别至5、6、7。
1.2 试验方法 1.2.1 鸡的小肠原位单向灌流法在文献[14]方法基础上加以改进建立鸡小肠原位单向灌流法, 具体过程如下。选取体型匀称AA白羽肉鸡, 试验前禁食12~18 h, 自由饮水。采用200 g · L-1乌拉坦按剂量0.5 mL · kg-1进行腹腔注射麻醉。观察针刺鸡爪如无疼痛反应, 全身松软, 翻正反射消失, 进入麻醉维持期, 开始手术。首先沿下腹打开腹腔3~4 cm, 充分暴露肠段, 轻柔取出十二指肠、空肠和回肠并确保血液的供应和肠系膜完整。分别取憩室下方2~3 cm处空肠段约10 cm、上方2~3 cm回肠约10 cm以及十二指肠约10 cm。沿肠蠕动方向在所选肠段两端分别剪开小口采用预温K-R液冲洗后, 上端插入硅胶进液管, 下端插入收液管进行结扎, 然后将预温41 ℃ K-R液以0.2 mL · min-1流速灌流平衡肠段30 min, 更换含有美托洛尔的K-R液以10 mL · min-1的流速快速平衡2 min, 最终以0.2 mL · min-1流速进行药物灌流100 min。此外, 药物收集中, 进液处采用已知质量美托洛尔供液管进行灌流, 收液处采用已知质量的集液管收液; 每隔10 min更替新的供液管和集液管, 共更换10次。试验结束后剪下灌流肠段并测量其长度和内径, 称量试验前、后供液管和集液管的质量, 于-20 ℃保存待测。小肠灌流示意图见图 1。
|
图 1 鸡小肠原位单向灌流示意图 Fig. 1 Diagram of in situ single-pass small intestinal perfusion model in chicken |
试验设置生理环境下3段小肠(十二指肠、空肠和回肠)400 μg · mL-1美托洛尔灌流组, 不同pH值(5、6和7)美托洛尔十二指肠、空肠、回肠段灌流组, 不同质量浓度(4、40和400 μg · mL-1)美托洛尔空肠段灌流组, 每组6个平行, 每个平行5羽鸡。
本试验中, 对在体小肠单向灌流进行校正, 灌流前的供液管和集液管质量为min和mout, 灌流后为min1和mout1。入肠液体质量(m1)=min-min1, 出肠液体质量(m2)=mout1-mout, 入肠灌流液体积(Vin)= m1/ρ1, 出肠灌流液体积(Vout)=m2/ρ2。ρ1、ρ2为灌流前后药液的密度, 假设液体密度为1 g · cm-3。按下述公式计算药物有效渗透系数(Peff)值, 其中, Cin和Cout分别为灌流初始和结束的药物浓度(μg · mL-1); Q为灌流速度(0.2 mL · min-1)；2πr为灌流肠段的周长；l为灌流肠段的长度。
|
MDCK细胞的传代培养, 采用含10%胎牛血清的高糖培养基, 在37 ℃ 5% CO2, 湿度95%细胞培养箱中培养。当细胞长满培养孔底部达到80%~90%时进行传代。MDCK-chAbcb1细胞培养传代方法相似, 但培养基为含有100 μg · mL-1潮霉素B的选择性高糖培养基。采用MTT法检测不同浓度美托洛尔对MDCK、MDCK-chAbcb1细胞的毒性作用。采用酶标仪测量各孔的吸光值A490, 以确定在转运试验中适合的药物浓度。
1.2.4 药物转运试验根据文献[14]方法进行。将MDCK、MDCK-chAbcb1细胞以每孔5×104的密度接种至12孔Transwell小室膜A室, 每孔补液至500 μL; B室仅加入1 500 μL培养液, 隔天换液。在接种后每天记录Transwell小室内细胞跨膜电阻值(transepithelial electrical resistance, TEER), 绘制“电阻-时间”曲线图。待电阻稳定, 弃去培养基在Transwell A、B室分别加入500、1 500 μL预热的Hank ’ s液(37 ℃), 洗涤3次(置于37 ℃细胞培养箱中平衡30 min)后弃去, 然后进行药物的双向转运试验, 测定吸收表观通透系数(AP-BL)和分泌表观渗透系数(BL-AP)。在AP-BL测定中, A侧加入500 μL含有美托洛尔的Hank ’ s液, B侧加入1 500 μL空白Hank ’ s液, 2 h后从B侧收样; BL-AP测定中, B侧加入1 500 μL含有美托洛尔的Hank ’ s液, A侧加入500 μL空白Hank ’ s液, 2 h后从A侧收样。取样后均置于-20 ℃待测。试验分别设置不同浓度(4、40和400 μg · mL-1)美托洛尔转运组、100 μmol · L-1 P-gp抑制剂维拉帕米处理组、不同pH值(5、6和7)处理组, 每组3个平行。
表观渗透系数(Papp)、细胞外排率(ER)、细胞净外排率(NER)采用以下公式计算:
|
式中:Q代表药物转运能力的大小; A为小室表面积(本试验中为1.12 cm2)。dQ代表dt时间内药物从供药侧向取样侧的转运速率; Papp(BL-AP)为分泌表观渗透系数; Papp(AP-BL)为吸收表观通透系数。
1.2.5 美托洛尔浓度的HPLC检测1) 美托洛尔标准曲线、检测限和定量测定。参考洪小栩等[21]建立的高效液相色谱(HPLC)方法进行测定。检测波长222 nm, 流动相组成为乙腈(55%)和盐溶液(45%)(950 mg庚烷磺酸钠、82 mg无水醋酸钠、0.57 mL冰醋酸和1 L水), 流速1 mL · min-1。用K-R液和Hank ’ s液分别配制0.1、0.5、1.0、10.0、50.0、100.0、200.0、400.0和800.0 μg · mL-1美托洛尔标准溶液, 每个浓度设5个重复。根据液相方法检测, 以美托洛尔峰面积为纵坐标(Y)对美托洛尔浓度(X)进行线性回归, 得出美托洛尔标准曲线方程。按信噪比(s/n)=3求出检测限(LOD), 以s/n=10求出定量限(LOQ)。
2) 方法的稳定性考察。鉴于细胞培养的最适温度为37 ℃, 而鸡体温41 ℃, 本试验将含有美托洛尔的K-R灌流液和Hank ’ s液分别置于37 ℃和41 ℃恒温水浴锅中孵育1、2、4、6、8 h后取样, 采用HPLC方法检测, 以峰面积计算美托洛尔浓度。
1.3 数据处理数据均以平均值±标准差(x±SD)表示, 各组间差异显著性采用SPSS 18.0软件进行分析。
2 结果与分析 2.1 美托洛尔的标准曲线、检测限和定量限由图 2-A可知:HPLC测定空白K-R灌流液、Hank ’ s液在0~10 min内基线平稳且无干扰峰。添加1.5 μg · mL-1美托洛尔后测定其平均保留时间均约2.6 min, 目标峰分离度良好。由图 2-B可知:美托洛尔在0.05~500 μg · mL-1范围内, 浓度(X)与峰面积(Y)线性关系良好, 标准曲线方程为Y=0.034 6X+0.017(R2=0.999 4)。检测限0.05 μg · mL-1, 定量限0.15 μg · mL-1。且美托洛尔在37 ℃、41 ℃时稳定性良好, 满足鸡小肠原位单向灌流试验对灌流药物温度的要求。
|
图 2 美托洛尔(M)的HPLC色谱图(A)及标准曲线(B) Fig. 2 HPLC chromatogram(A)and standard curve(B)of metoprolol(M) |
通过MTT检测不同质量浓度(1 000、400、100、40、10、4 μg · mL-1)美托洛尔对MDCK和MDCK-chAbcb1细胞活性的影响。由图 3可知:上述浓度美托洛尔对MDCK和MDCK-chAbcb1的细胞活性均无显著影响。由图 4可知:MDCK和MDCK-ch-bcb1细胞接种于Transwell小室培养后, 电阻值均随细胞生长时间延长而升高。在4~5 d时, MDCK和MDCK-chAbcb1细胞各孔平均电阻值分别约为600和400 Ω · cm2, 表明细胞生长至稳定状态并形成单层完整紧密连接。
|
图 3 不同质量浓度美托洛尔(M)对MDCK和MDCK-chAbcb1细胞活力的影响 Fig. 3 Effects of different concentration metoprolol(M)on the viability of MDCK and MDCK-chAbcb1 cells |
|
图 4 MDCK和MDCK-chAbcb1细胞在不同时间点的跨膜电阻(TEER) Fig. 4 Transepithelial electrical resistance(TEER)of MDCK and MDCK-chAbcb1 cell at different culturing time points |
参照文献[22], 在鸡小肠不同部位各自的生理pH值条件下, 在小肠的十二指肠、空肠和回肠部位分别进行美托洛尔的灌流试验。由图 5可知:相同浓度的美托洛尔在回肠部位测得的Peff值极显著高于十二指肠段和空肠部位(分别为2.2倍和2.3倍, P < 0.01), 而在十二指肠和空肠测得的数值无显著差异(P>0.05)。
|
图 5 美托洛尔在小肠不同部位测定的渗透性比较 Fig. 5 The comparison of permeability of metoprolol in different intestinal segments *P < 0.05; **P < 0.01. The same as follws. |
鸡小肠原位灌流试验结果显示(图 6-A), 分别采用pH值为5、6和7的灌流液进行灌流时, 美托洛尔在不同pH值条件下测得的Peff有一定差异, 尤其在十二指肠和回肠测定的Peff受pH值影响较大, 十二指肠在pH5时测得的Peff值极显著或显著高于pH6和pH7(P < 0.01, P < 0.05), 回肠段在pH7时测得的Peff值显著高于pH5(P < 0.05), 而空肠段测得的Peff受灌流液pH值变化的影响不显著。细胞转运试验的结果显示(图 6-B), 在MDCK细胞中, 随着pH值升高, 美托洛尔渗透性也升高, 且差异均极显著(P < 0.01), 在MDCK-chAbcb1中, pH7时美托洛尔的渗透性显著高于pH5和pH6(P < 0.05)。
|
图 6 美托洛尔在不同pH值时的渗透性比较 Fig. 6 The comparision of permeability of metoprolol in different pH value |
根据2.4结果, 在空肠段测定Peff值时受pH值影响较小, 故采用空肠部位进行灌流并结合体外细胞试验探讨不同浓度的美托洛尔(4、40和400 μg · mL-1)对渗透性测定的影响。由图 7可知:原位灌流法测定Peff的结果显示, 400 μg · mL-1美托洛尔的Peff值极显著高于40和4 μg · mL-1(P < 0.01);采用MDCK和MDCK-chAbcb1细胞测定时, 发现40和400 μg · mL-1美托洛尔的Papp值均极显著高于4 μg · mL-1美托洛尔的值(P < 0.05)。同时体外试验结果显示, 4 μg · mL-1美托洛尔的净外排率(NER)最高, 且NER大于2, 添加100 μmol · L-1维拉帕米后, NER降至0.97, 提示低浓度美托洛尔受转运蛋白P-gp影响较大, 而高浓度时影响较小(表 1)。
|
图 7 不同浓度美托洛尔(M)的渗透性比较 Fig. 7 Comparison of metoprolol(M)permeability at different concentrations A.空肠单向灌流Single-pass intestinal perfusion in jejunum; B.细胞双向转运Bidirectional transport in cells. |
| ρ(M)/ (μg·mL-1) |
c(V)/ (μmol·L-1) |
MDCK | MDCK-chAbcb1 | 净外 排率 NER |
|||||
| Papp(AP-BL)/ (10-6 cm·s-1) |
Papp(BL-AP)/ (10-6 cm·s-1) |
外排率 ER |
Papp(AP-BL)/ (10-6 cm·s-1) |
Papp(BL-AP)/ (10-6 cm·s-1) |
外排率 ER |
||||
| 4 | 0 | 18.63±0.44cB | 15.81±6.26dB | 0.84 | 17.20±1.27dC | 32.59±1.74bA | 1.89 | 2.23 | |
| 100 | 41.66±3.95aA | 23.76±4.41bA | 0.57 | 58.26±1.59aA | 32.50±0.84bA | 0.55 | 0.97 | ||
| 40 | 0 | 27.45±0.43bB | 24.15±0.63bA | 0.87 | 32.86±2.50cB | 25.21±0.94cB | 0.76 | 0.87 | |
| 100 | 39.89±2.47aA | 25.10±0.33bA | 0.63 | 41.61±1.67bA | 30.70±3.75bA | 0.73 | 1.15 | ||
| 400 | 0 | 26.34±0.12bB | 20.13±2.19cA | 0.76 | 37.23±0.95bA | 37.83±6.04aA | 1.01 | 1.32 | |
| 100 | 40.84±0.94aA | 29.54±0.96aA | 0.72 | 28.48±1.64cB | 23.35±0.90cB | 1.13 | 1.13 | ||
| 注: 1) ER:Efflux rate; NER:Net efflux rate; Papp(AP-BL):The apparent permeability from apical side to basal side; Papp(BL-AP):The apparent permeability from basal side to apical side. 2)同列数据不同小写字母和大写字母表示在0.05和0.01水平上差异显著。 Different lowercase and uppercase letters indicate significant difference at 0.05 and 0.01 levels. |
|||||||||
小肠原位单向灌流法最能模拟生理条件下体内药物吸收过程, 且与体内试验相比, 具有易操作和低成本等优点[23], 体外细胞转运模型可有效控制各种影响因素, 故其结果可有效佐证原位灌流模型。鸡小肠原位单向灌流模型用于药物渗透性的测定目前尚无相关研究, 故本试验率先建立鸡小肠原位单向灌流方法用于测定药物渗透性, 并对该法测定时的影响因素进行探讨, 同时选取MDCK和MDCK-chAbcb1细胞模型进行验证。美托洛尔被FDA推荐作为药物高/低渗透性的分界参考药物, 是一个相对保守的参考标准, 目前已广泛应用于人药BCS研究时药物渗透性分类[24]。但兽药BCS研究时仍无理想的参考药物。因此, 本试验也探讨了美托洛尔作为兽药BCS研究时高/低渗透性分界标准的可行性, 以期为禽类药物BCS研究提供参考。
本试验建立的鸡小肠原位灌流方法测得美托洛尔在回肠部位的Peff值极显著高于十二指肠和空肠部位(分别为2.2倍和2.3倍), 该结果与Amidon等[1]在大鼠原位灌流法测得的美托洛尔在回肠的渗透性约为空肠2倍的结果一致。但Masaoka等[25]研究显示大鼠口服美托洛尔后90%在空肠前段吸收, 10%在空肠后段吸收; Jobin等[26]通过人肠道插管法测定, 发现60%的美托洛尔在人十二指肠吸收, 其余的在空肠和回肠吸收。分析存在一定差异的原因, 可能与人、啮齿类动物以及禽类在小肠与药物的暴露面积、肠道蠕动速度等生理参数以及测试条件等方面存在差异有关。Musther等[11]也指出同一药物在人、大鼠、小鼠及犬等不同物种间的口服生物利用度相关性较差, 由此可见不同物种间生理结构等方面的差异对药物渗透性测定会产生影响, 尽管人用药物的BCS研究日渐成熟, 但其研究方法和结果不能直接外推给动物。另外, 兽用药物的种类也与人用药物存在差异, 有关兽医临床专用药物的BCS相关研究尚属空白, 因此有必要建立适于兽用药物渗透性测定的方法。鸡的十二指肠、空肠和回肠的pH值不同, 小肠从前到后其pH值由酸性(pH≈5)逐渐向碱性(pH≈7)变化[22]。本试验中我们也检测了美托洛尔在不同肠段的Peff值, 结果显示在回肠测定的Peff值极显著高于十二指肠和空肠部位, 并且发现在小肠不同部位进行灌流时, pH值变化对美托洛尔渗透性测定也会产生影响(空肠部位受影响较小), 且细胞试验的结果也证实pH值对渗透性测定有一定影响。Incecayir等[14]的研究显示, 采用Caco-2细胞测定的拉贝洛尔和美托洛尔的渗透性随pH值升高而升高, 与小鼠在体灌流结果有相同趋势, 本试验结果与之也一致。同时, Lee等[18]在Caco-2细胞上测定美托洛尔和拉贝洛尔渗透值均随pH值升高而升高, Thiel-Demby等[27]在pH5.5和pH7.4时测得美托洛尔渗透系数分别为(48±22)nm · s-1和(410±12)nm · s-1, 均证实pH值对渗透性测定有一定影响。由此可见, 小肠不同部位进行灌流测得的美托洛尔渗透性有差异。对于人药肠渗透性测定时, 有学者提出一个折中标准, 即以空肠近端测得的美托洛尔Peff值为高/低渗透性分界线, 若待测化合物在整个小肠任何部位测得的Peff值等于或高于美托洛尔的Peff值, 则认为是高渗透性药物[28]。我们比较倾向于该判断标准, 因本试验中发现美托洛尔在空肠段测定渗透性时受pH值影响较小, 相对比较稳定, 当然这仍需要进行鸡体内试验的结果进一步验证。另外, 鸡小肠原位单向灌流法具有维持体内环境、神经支配、血液供应稳定等特点, 且有黏液层、活性载体和酶的表达等优势[15, 29], 且该法可操作性较强, 因此作为鸡用药物渗透性测定模型具有一定的可行性。
采用鸡小肠原位单向灌流法测定药物渗透性时不仅考虑鸡胃肠道内环境因素, 药物本身也需考虑, 如药物吸收机制及转运体表达等, 本试验选取pH值条件较稳定的空肠段进行美托洛尔渗透性测定, 探讨了药物浓度对测定的影响, 结果提示随着药物浓度的升高, Peff值均极显著升高, 采用MDCK和MDCK-chAbcb1细胞测定时也发现40、400 μg · mL-1美托洛尔的Papp值均极显著高于4 μg · mL-1, 而40、400 μg · mL-1美托洛尔的Papp值之间无明显差异。采用细胞试验进一步证实美托洛尔是鸡小肠高表达的P-gp底物, 故可以解释低浓度时测得的Peff值较低是因为P-gp介导了美托洛尔的主动外排。Incecayir等[14]对大鼠小肠灌流拉贝洛尔的研究结果显示, 该药的渗透性与其初始灌流浓度相关, 随着药物浓度的升高, 拉贝洛尔渗透性呈上升趋势, 且该药的渗透性测定与小肠的P-gp等转运蛋白有关。体外细胞转运试验发现仅有低浓度(4 μg · mL-1)美托洛尔的NER值大于2, 添加P-gp竞争抑制药物维拉帕米后NER值小于2, 进一步提示低浓度美托洛尔受转运蛋白P-gp作用明显, 但高浓度时可以饱和外排泵, 从而降低P-gp对高浓度美托洛尔渗透性测定的影响[19, 30]。由此我们认为, 美托洛尔可以作为高低渗透性参考药物, 并且在进行灌流研究或者采用细胞系测定美托洛尔渗透性时宜采用较高浓度。
本试验结果提示小肠不同部位、pH值、药物浓度对离体和原位肠灌流模型渗透值测定均有影响, 因此建立原位肠灌流模型前应充分考虑其特殊性, 采用标准药物并通过多种方法验证成功后, 再进行药物的渗透性分类, 这样才真正具有准确性和可参考性。
| [1] |
Amidon G L, Lennernäs H, Shah V P, et al. A theoretical basis for a biopharmaceutic drug classification:the correlation of in vitro drug product dissolution and in vivo bioavailability[J]. Pharmaceutical Research, 1995, 12(3): 413-420. DOI:10.1023/A:1016212804288 |
| [2] |
Borbás E, Nagy Z K, Nagy B, et al. The effect of formulation additives on in vitro dissolution-absorption profile and in vivo bioavailability of telmisartan from brand and generic formulations[J]. European Journal of Pharmaceutical Sciences, 2018, 114: 310-317. DOI:10.1016/j.ejps.2017.12.029 |
| [3] |
Porat D, Dahan A. Active intestinal drug absorption and the solubility-permeability interplay[J]. International Journal of Pharmaceutics, 2017, 537(1/2): 84-93. |
| [4] |
Miyaji Y, Fujii Y, Takeyama S, et al. Advantage of the dissolution/permeation system for estimating oral absorption of drug candidates in the drug discovery stage[J]. Molecular Pharmaceutics, 2016, 13(5): 1564. DOI:10.1021/acs.molpharmaceut.6b00044 |
| [5] |
Cheng Y, El-Kattan A F, Zhang Y, et al. Involvement of drug transporters in organ toxicity:the fundamental basis to drug discovery and development[J]. Chemical Research in Toxicology, 2016, 29(4): 545. DOI:10.1021/acs.chemrestox.5b00511 |
| [6] |
许鸣镝, 王琳, 王铁松, 等. 生物药剂学分类系统差异比较及应用探讨[J]. 中国药学杂志, 2016, 51(10): 777-779. Xu M D, Wang L, Wang T S, et al. Comparison of different biopharmaceutics classification systems(BCS)and discussion of its application[J]. China Pharmacy Journal, 2016, 51(10): 777-779 (in Chinese with English abstract). |
| [7] |
World Health Organization. WHO technical report series No. 937. Annex 7: multisource(generic)pharmaceutical products: guidelineson registration requirements to establish interchangeability; Annex 8: proposal to waive in vivo bioequivalence requirements for WHO model list of essential medicines immediate-release, solid oral dosage forms[R]. Geneva: WHO, 2006.
|
| [8] |
高杨, 耿立冬. FDA、WHO和EMA关于基于生物药剂学分类系统的生物等效性豁免指导原则的比较[J]. 中国新药杂志, 2012, 21(24): 2861-2869. Gao Y, Geng L D. Comparison and discussion of FDA, WHO and EMA guidelines on BCS-based biowaiver[J]. Chinese Journal of New Drugs, 2012, 21(24): 2861-2869 (in Chinese with English abstract). |
| [9] |
Mehta M U, Uppoor R S, Conner D P, et al. Impact of the US FDA "Biopharmaceutics Classification System"(BCS)guidance on global drug development[J]. Molecular Pharmaceutics, 2017, 14(12): 4334. DOI:10.1021/acs.molpharmaceut.7b00687 |
| [10] |
The European Agency for the Evaluation of Medicinal Products(EMEA). Note for guidance on the investigation of bioavailability and bioequivalence CPMP/WEP/QWP/1401/98 Revl, Appendix Ⅲ[R]. London: EMEA, 2001.
|
| [11] |
Musther H, Olivares-Morales A, Hatley O J D, et al. Animal versus human oral drug bioavailability:do they correlate?[J]. European Journal of Pharmaceutical Sciences, 2014, 57: 280-291. DOI:10.1016/j.ejps.2013.08.018 |
| [12] |
Lennernas H. Human jejunal effective permeability and its correlation with preclinical drug absorption models[J]. The Journal of Pharmacy and Pharmacology, 1997, 49(7): 627-638. DOI:10.1111/jphp.1997.49.issue-7 |
| [13] |
Ku M S. Use of the biopharmaceutical classification system in early drug development[J]. Aaps Journal, 2008, 10(1): 208-212. DOI:10.1208/s12248-008-9020-0 |
| [14] |
Incecayir T, Tsume Y, Amidon G L. Comparison of the permeability of metoprolol and labetalol in rat, mouse, and caco-2 cells:use as a reference standard for BCS classification[J]. Molecular Pharmaceutics, 2013, 10(3): 958-966. DOI:10.1021/mp300410n |
| [15] |
慈小燕, 武卫党, 李亚卓, 等. 不同BCS分类药物的肠道渗透性研究[J]. 中国新药杂志, 2018, 27(1): 63-68. Ci X Y, Wu W D, Li Y Z, et al. Investigating intestinal permeability of different BCS classification drugs[J]. Chinese Journal of New Drugs, 2018, 27(1): 63-68 (in Chinese with English abstract). |
| [16] |
Gozalbes R, Jacewicz M, Annand R, et al. QSAR-based permeability model for drug-like compounds[J]. Bioorganic & Medicinal Chemistry, 2011, 19(8): 2615-2624. |
| [17] |
Ghafourian T, Freitas A A, Newby D. The impact of training set data distributions for modelling of passive intestinal absorption[J]. International Journal of Pharmaceutics, 2012, 436(1/2): 711-720. |
| [18] |
Lee C A, Cook J A, Reyner E L, et al. P-glycoprotein related drug interactions:clinical importance and a consideration of disease states[J]. Expert Opinion on Drug Metabolism & Toxicology, 2010, 6(5): 603-619. |
| [19] |
Ferreira A, Rodrigues M, Fortuna A, et al. Flavonoid compounds as reversing agents of the P-glycoprotein-mediated multidrug resistance:an in vitro evaluation with focus on antiepileptic drugs[J]. Food Research International, 2018, 103: 110-120. DOI:10.1016/j.foodres.2017.10.010 |
| [20] |
张宁, 平其能. 生物药剂分类系统(BCS)及应用进展介绍[J]. 中国新药杂志, 2008, 17(19): 1655-1658. Zhang N, Ping Q N. Introduction of biopharmaceutics classification system(BCS)and its application progress[J]. Chinese Journal of New Drugs, 2008, 17(19): 1655-1658 (in Chinese with English abstract). DOI:10.3321/j.issn:1003-3734.2008.19.004 |
| [21] |
洪小栩, 许华玉, 尚悦, 等. 2015年版《中国药典》四部增修订概况[J]. 中国药学杂志, 2015, 50(20): 1782-1786. Hong X X, Xu H Y, Shang Y, et al. Brief introduction of Chinese Pharmacopoeia 2015 edition volume Ⅳ[J]. China Pharmacy Journal, 2015, 50(20): 1782-1786 (in Chinese with English abstract). |
| [22] |
Sethi V K, Bhatt D, Kumar A. Avian biology[J]. Current Science, 2009, 96(5): 636-637. |
| [23] |
Lozoyaagullo I, Zur M, Wolk O, et al. In situ intestinal rat perfusions for human Fabs prediction and BCS permeability class determination:Investigation of the single-pass vs. the Doluisio experimental approaches[J]. International Journal of Pharmaceutics, 2015, 480(1/2): 1-7. |
| [24] |
U.S. Department of Health and Human Strvice, Food and Drug administration(FDA). Guidance for industry-waiver of in vivo bioavailability and bioequivalence studies for immediate-release solid oral dosage forms based on a biopharmaceutics classification system[R]. Rockville, MD: FDA, 2015.
|
| [25] |
Masaoka Y, Tanaka Y, Kataoka M, et al. Site of drug absorption after oral administration:assessment of membrane permeability and luminal concentration of drugs in each segment of gastrointestinal tract[J]. European Journal of Pharmaceutical Sciences, 2006, 29(3/4): 240-250. |
| [26] |
Jobin G, Cortot A, Godbillon J, et al. Investigation of drug absorption from the gastrointestinal tract of man. Ⅰ. metoprolol in the stomach, duodenum and jejunum[J]. British Journal of Clinical Pharmacology, 2012, 19(S2): 97-105. |
| [27] |
Thiel-Demby V E, Humphreys J E, La S J W, et al. Biopharmaceutics classification system:validation and learnings of an in vitro permeability assay[J]. Molecular Pharmaceutics, 2009, 6(1): 11-18. DOI:10.1021/mp800122b |
| [28] |
Fairstein M, Swissa R, Dahan A. Regional-dependent intestinal permeability and BCS classification:elucidation of pH-related complexity in rats using pseudoephedrine[J]. Aaps Journal, 2013, 15(2): 589-597. DOI:10.1208/s12248-013-9462-x |
| [29] |
Escribano E, Sala X G, Salamanca J, et al. Single-pass intestinal perfusion to establish the intestinal permeability of model drugs in mouse[J]. International Journal of Pharmaceutics, 2012, 436(1/2): 472-477. |
| [30] |
Cao X, Yu L X, Barbaciru C, et al. Permeability dominates in vivo intestinal absorption of P-gp substrate with high solubility and high permeability[J]. Molecular Pharmaceutics, 2005, 2(4): 329. DOI:10.1021/mp0499104 |