文章信息
- 张亚南, 李轩, 陈慧子, 余凯凡, 朱伟云
- ZHANG Yanan, LI Xuan, CHEN Huizi, YU Kaifan, ZHU Weiyun
- 丙酸钠对IPEC-J2细胞紧密连接及炎症细胞因子的影响
- Effects of sodium propionate on the tight junction and inflammatory cytokines in IPEC-J2 cells
- 南京农业大学学报, 2019, 42(1): 137-144
- Journal of Nanjing Agricultural University, 2019, 42(1): 137-144.
- http://dx.doi.org/10.7685/jnau.201804030
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文章历史
- 收稿日期: 2018-04-18
肠道上皮细胞之间存在多种连接复合体, 其中, 紧密连接是肠道上皮细胞间最重要的连接方式之一, 由封闭蛋白(Claudins)、闭合蛋白(Occludin)等跨膜蛋白与外周胞浆蛋白闭合小环蛋白(ZO)构成, 位于细胞的最顶端。紧密连接在维护肠道上皮细胞屏障以及肠道健康等方面发挥了重要作用, 而细胞屏障功能与炎症反应联系密切。细胞屏障功能紊乱会造成肠道上皮细胞通透性的增加, 有害物质进入细胞后加速动物机体的炎症反应, 促进炎症因子的表达和分泌。因此, 保证动物机体肠道上皮的完整至关重要。动物肠道内产生的短链脂肪酸在维护肠道上皮健康方面发挥了重要作用。短链脂肪酸由肠道微生物发酵未被宿主消化吸收的营养素产生, 主要包括乙酸、丙酸和丁酸, 其约占短链脂肪酸总含量的95%[1]。短链脂肪酸不仅是肠道上皮细胞的主要能源物质, 而且能够调节肠道屏障功能以及抑制炎症反应。其中, 丁酸在肠道中的作用已被广泛研究。在肠道中, 丁酸能够被结肠上皮细胞吸收利用, 同时促进结肠上皮的分化以及损伤修复[2-3]。断奶仔猪饲喂丁酸钠后, 上调了结肠上皮中Claudin-3、Occludin和ZO-1基因的表达[4]。丁酸钠处理IPEC-J2细胞后, 降低了其通透性并选择性上调了紧密连接蛋白的表达[5]。
丙酸作为另一种主要的短链脂肪酸, 在调节肠道上皮屏障功能以及抑制炎症反应方面也发挥重要作用。有研究指出, 给哺乳期大鼠口服丙酸能够增强其近端结肠上皮屏障功能[6]。此外, 在小鼠饮水中添加丙酸能够缓解由DSS诱导的结肠炎症反应, 降低后肠组织损伤[7]。然而, 对丙酸的研究主要集中在大肠, 丙酸对小肠的影响还有待进一步研究。因此, 本文主要以来源于猪空肠上皮的IPEC-J2细胞系为模型, 探究不同水平丙酸钠对小肠上皮细胞紧密连接蛋白以及炎症细胞因子表达的影响, 旨在了解丙酸在调节小肠细胞屏障和炎症反应方面可能发挥的作用。
1 材料与方法 1.1 试验材料猪肠道上皮IPEC-J2细胞系, 分离自仔猪空肠上皮细胞, 由本实验室传代保存。丙酸钠购自美国Sigma公司; 基础培养基DMEM-F12购自Hyclone公司; 胎牛血清(FBS)、胰酶(Trypsin, 2.5 g·L-1)以及青(链)霉素均购自Gibco公司; 总RNA提取试剂盒(Trizol法)购自北京艾德莱公司; 反转录试剂盒以及荧光定量PCR(qPCR)试剂盒购自日本TaKaRa公司; 细胞活力试剂盒与炎症因子ELISA试剂盒均购自南京建成生物科技有限公司。
1.2 细胞的复苏与培养将冻存在液氮中的细胞取出, 迅速在37 ℃的水浴锅中解冻, 转移至15 mL的离心管中, 1 000 r·min-1离心3 min, 弃上清液, 加入7 mL完全培养基(含有10% FBS), 轻轻吹打混匀重悬沉淀, 接种至细胞培养瓶, 放入恒温细胞培养箱进行传代培养。当细胞铺满瓶底约80%时进行传代。弃培养基, 用PBS清洗2次, 加入1.5 mL胰酶37 ℃消化1~2 min, 使细胞从瓶壁上脱落下来, 加入2 mL的完全培养基终止消化, 转移至15 mL离心管中, 轻轻吹打混匀, 1 000 r·min-1离心3 min, 弃上清液, 加入完全培养基重悬沉淀, 接种至细胞培养瓶, 放入37 ℃、5% CO2、饱和湿度的培养箱中培养, 以此类推, 传至第3代具有足够的细胞数量后开始试验处理。
1.3 试验设计与处理本试验以IPEC-J2细胞为模型, 试验共分为3组:对照组、处理组Ⅰ和处理组Ⅱ, 3组丙酸钠的处理浓度分别为0、1和10 mmol·L-1, 每组6个重复。将消化后的IPEC-J2细胞以均等的浓度接种至6孔板中, 共接种6板, 待细胞生长至约80%融合时, 弃培养液, 用PBS清洗1次, 更换为用基础培养基配置的1和10 mmol·L-1丙酸钠溶液(不含血清)。每孔加入2 mL丙酸钠处理液, 分别在处理12和24 h后观察细胞形态, 测定细胞活力; 收集细胞上清液, 测定炎症细胞因子浓度; 收集细胞, 提取总RNA, 测定炎症细胞因子及紧密连接相关蛋白mRNA表达量。
1.4 细胞形态观察及活力测定使用YS100倒置光学显微镜观察细胞形态并进行拍照, 观察细胞轮廓和形态变化。细胞活力测定按照CCK-8细胞活力测定试剂盒说明书进行操作。
1.5 细胞跨膜电阻值(TEER)测定收集细胞瓶中生长良好的细胞, 将细胞稀释为5×104 μL-1, 随后接种100 μL细胞悬液于Transwell板的小室中(膜面积1.12 cm2), 加入400 μL完全培养基, 并在小室下方的孔中加入1.5 mL完全培养基。放入培养箱中培养8 d后(每2 d换1次培养基), 形成紧密单层细胞。随后将完全培养基更换为不同浓度丙酸钠溶液处理细胞, 每个处理8个重复。分别于处理12和24 h后, 应用细胞电阻仪(Millipore MERS00002 Millicell-ERS, 美国)测定各组细胞的TEER。每个孔选择3个不同方向的点进行测定, 取其均值乘以膜面积为该孔的TEER值。
1.6 细胞炎症因子水平的测定收集细胞上清液, 2 500 r·min-1离心20 min, 吸取1 mL上清液至1.5 mL离心管中, 待测。炎症细胞因子水平测定步骤按照试剂盒说明书操作。
1.7 炎症细胞因子和紧密连接相关蛋白mRNA的表达测定 1.7.1 细胞RNA的提取与反转录弃去6孔板中的培养基, 加入2 mL PBS清洗1次, 每孔加入1 mL Trizol裂解液, 反复吹打20 s后, 将裂解液转移至1.5 mL离心管中。细胞总RNA的提取步骤按照总RNA提取试剂盒说明书进行。将提取的RNA进行浓度和纯度测定后, -80 ℃冰箱保存备用。RNA的反转录(RT), 采用20 μL体系:总RNA 1 000 ng, 5×PrimeScript RT Master Mix 4 μL, 无RNase水补足至20 μL。反应条件:37 ℃ 15 min, 85 ℃ 5 s, 4 ℃保存。
1.7.2 相关基因表达的RT-qPCR测定RT-qPCR反应体系(20 μL):2×SYBR Premix Ex Taq Ⅱ 10 μL, 炎症细胞因子及紧密连接相关基因上、下游引物各0.4 μL, ROX Reference Dye Ⅱ 0.4 μL, 灭菌蒸馏水6.8 μL, cDNA模板2 μL。反应条件:95 ℃ 30 s; 95 ℃ 5 s, 60 ℃ 34 s, 共40个循环; 95 ℃ 15 s, 60 ℃ 1 min, 95 ℃ 15 s。引物序列见表 1。
| 基因名称Gene name | 引物对序列(5'→3')Primer pairs sequence | 参考文献Reference |
| β-actin | CCACGAAACTACCTTCAACTC/TGATCTCCTTCTGCATCCTGT | [8] |
| Claudin-1 | AGATTTACTCCTACGCTGGT/GCACCTCATCATCTTCCAT | [9] |
| Claudin-2 | CTCGTTGGCCTGTATCATCACC/CAGGGGGGAGTAGAAGTCCC | [9] |
| Claudin-3 | CCTACGACCGCAAGGACTAC/GACTGGTCTCGGATGCAAGG | [9] |
| Claudin-4 | CGTACCGACAAGCCCTACTC/GCAGTCCAGGGAGAAACCAA | [9] |
| Occludin | ATGCTTTCTCAGCCAGCGTA/AAGGTTCCATAGCCTCTCGGTC | [10] |
| ZO-1 | GAGGATGGTCACCGTGGT/GGAGGATGCTGTTGTCTCGG | [10] |
| ZO-2 | GCAGAGACAACCCCCACTTT/CGTTAACCATGACCACCCGA | [11] |
| TNF-α | CCACGCTCTTCTGCCTACTGC/GCTGTCCCTCGGCTTTGAC | [12] |
| IL-6 | CCTCTCCGGACAAAACTGAA/TCTGCCAGTACCTCCTTGCT | [12] |
| IL-8 | TAGGACCAGAGCCAGGAAGA/AGCAGGAAAACTGCCAAGAA | [12] |
| IL-18 | TATGCCTGATTCTGACTGTT/ATGAAGACTCAAACTGTATCT | [13] |
首先利用Microsoft Excel 2016对荧光定量的数据进行初步整理, 采用2-ΔΔCT法计算基因的相对表达量, 利用SPSS 20.0统计软件的ANOVA方法分析各组间的差异显著性, 所有数据均用"平均值±标准误"表示。利用Graphpad 7.0软件绘图。
2 结果与分析 2.1 不同浓度丙酸钠对IPEC-J2细胞形态的影响如图 1所示:处理12 h后, 与对照组相比, 处理组Ⅰ和Ⅱ中细胞的形态均无显著变化, 呈铺石路状, 细胞轮廓明显, 细胞间隙正常。处理24 h后, 各组中细胞形态完整, 细胞间隙正常, 但各处理组中细胞边界亮度较对照组降低, 细胞密度下降。
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图 1 丙酸钠(SP)对IPEC-J2细胞形态的影响 Fig. 1 Effects of sodium propionate(SP)on the morphology of IPEC-J2 cells |
如图 2所示:处理12 h后, 各组间细胞活力无显著变化(P > 0.05), 但各处理组中细胞TEER值显著高于对照组(P < 0.05)。处理24 h后, 与对照组相比, 各处理组细胞活力均显著下降(P < 0.05), 而细胞TEER值显著增加(P < 0.05)。
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图 2 丙酸钠(SP)对IPEC-J2细胞活力及跨膜电阻(TEER)的影响 Fig. 2 Effects of sodium propionate(SP)on the proliferation rate and trans-epithelial electrical resistance(TEER)of IPEC-J2 cells |
Claudin蛋白家族是构成紧密连接的最主要成分之一。由图 3可见:处理后12和24 h, 与对照组相比, 不同浓度丙酸钠均显著下调Claudin-1基因的表达(P < 0.05);上调Claudin-3和Claudin-4基因的表达, 其中10 mmol·L-1丙酸钠组与对照组相比差异显著(P < 0.05)。相较于对照组, 处理后12 h, 不同浓度丙酸钠下调Claudin-2基因的表达, 其中, 1 mmol·L-1丙酸钠组与对照组相比差异显著(P < 0.05);处理后24 h, 不同浓度丙酸钠则均显著上调Claudin-2基因的表达(P < 0.05)。
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图 3 丙酸钠(SP)对IPEC-J2细胞Claudin mRNA表达的影响 Fig. 3 Effects of sodium propionate(SP)on the expression of Claudin mRNA in IPEC-J2 cells |
ZO蛋白是一种胞内蛋白, 具有脚手架的作用; Occludin蛋白是一种相对分子质量为65×103的蛋白质, 是组成紧密连接的重要跨膜蛋白。由图 4可见:处理后12和24 h, 与对照组相比, 10 mmol·L-1丙酸钠显著上调ZO-1基因的表达(P < 0.05), 显著下调ZO-2基因的表达(P < 0.05);1 mmol·L-1丙酸钠显著上调ZO-2基因的表达(P < 0.05)。另外, 不同浓度丙酸钠对Occludin基因表达的影响较小(P > 0.05)。
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图 4 丙酸钠(SP)对IPEC-J2细胞Occludin以及ZO mRNA表达的影响 Fig. 4 Effects of sodium propionate(SP)on the expression of Occludin and ZO mRNA in IPEC-J2 cells |
如图 5所示:处理后12和24 h, 与对照组相比, 不同浓度丙酸钠均能够显著上调促炎因子IL-8、IL-18和TNF-α mRNA的表达(P < 0.05), 显著下调促炎因子IL-6 mRNA的表达(P < 0.05)。
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图 5 丙酸钠(SP)对IPEC-J2细胞炎症相关细胞因子表达的影响 Fig. 5 Effects of sodium propionate(SP)on the expression of genes related inflammatory cytokines in IPEC-J2 cells |
丙酸钠对炎症细胞因子水平的影响如图 6所示。处理后12 h, 与对照组相比, 10 mmol·L-1丙酸钠显著刺激炎症细胞因子IL-8和TNF-α的分泌(P < 0.05)。处理后24 h, 1 mmol·L-1丙酸钠显著促进TNF-α的分泌(P < 0.05)。处理后12和24 h, 不同浓度丙酸钠对IL-18和IL-6的分泌无显著影响(P > 0.05)。
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图 6 丙酸钠(SP)对炎症细胞因子水平的影响 Fig. 6 Effects of sodium propionate(SP)on the level of inflammatory cytokines |
紧密连接蛋白主要功能是维护肠道上皮屏障完整性, 调节上皮细胞通透性, 抵御抗原物质或致病菌进入机体, 进而保护肠道健康。短链脂肪酸作为肠道微生物发酵产生的终产物之一, 已被证明其在维护肠道屏障功能及在免疫反应以及肠道上皮细胞分化等生理过程中具有积极的作用。本研究以猪空肠上皮IPEC-J2细胞为模型, 探究不同浓度丙酸钠对小肠细胞紧密连接和炎症相关细胞因子表达的影响。结果显示, 不同水平丙酸钠对细胞形态无显著影响, 但显著增加了细胞的TEER值。此外, 丙酸钠选择性上调部分紧密连接蛋白相关基因表达, 上调炎症细胞因子的表达, 促进部分炎症细胞因子分泌。这些结果表明丙酸能够调节空肠上皮细胞的通透性, 影响紧密连接蛋白以及炎症相关细胞因子表达, 在维护细胞屏障以及调节炎症反应方面具有一定的作用。
TEER值是评价细胞屏障功能的主要指标之一, 其值越大表明细胞屏障功能越完整[14]。本试验结果表明, 不同浓度丙酸钠显著增加细胞TEER值, 暗示丙酸有助于降低细胞的通透性, 增强细胞屏障。Suzuki等[15]研究表明丙酸处理大鼠结肠组织或结肠细胞(Caco-2和T84)均能够增加其TEER值, 降低通透性, 本试验结果与之一致。众所周知, 由Claudin、Occludin和ZO构成的紧密连接复合体在维护肠道屏障完整性方面具有关键性作用, 同时影响细胞TEER值的变化。Claudin和Occludin等跨膜蛋白通过与胞内ZO-1蛋白的结合, 从而形成细胞间紧密连接[16]。本试验发现, 丙酸钠上调Claudin-2、Claudin-3和Claudin-4基因的表达, 但下调Claudin-1基因的表达。有报道, Claudin-1、Claudin-3和Claudin-4蛋白主要参与屏障功能的形成, 降低屏障通透性; Claudin-2主要参与细胞旁路离子通道的形成, 增加屏障通透性[17]。一般认为Claudin-2基因的表达上调会导致TEER值降低。本试验结果表明, 丙酸钠处理IPEC-J2细胞后, 上调Claudin-2基因的表达, 却增加细胞TEER值。丙酸钠增加细胞TEER值, 可能与其改变其他紧密连接蛋白如Claudin-3和Claudin-4的基因表达有关, 但其调控机制还有待进一步研究。此外, ZO-1是连接Claudin、Occludin与细胞骨架蛋白的纽带并起到固定作用[18]。Piche等[19]研究发现, 在Caco-2细胞中, 严重的炎症反应能够降低ZO-1的表达并损伤屏障功能。Occludin则是调节紧密连接的门控蛋白, 其在屏障功能中的作用还有一定的争议[18, 20]。本研究中丙酸钠上调了ZO-1基因的表达, 但对Occludin的表达影响很小。综上可知, 丙酸钠在调节肠道屏障功能中发挥了一定作用。
炎症细胞因子是一类调节机体炎症反应的多肽类物质的总称。本研究结果显示, 丙酸钠能够上调炎症因子IL-8、IL-18、TNF-α基因表达, 下调IL-6基因表达; 增加细胞中IL-8和TNF-α的分泌。这些结果表明丙酸促进了IPEC-J2细胞炎症因子的释放。短链脂肪酸具有抑制炎症, 促进免疫反应的作用。Hamer等[21]发现在全血与Caco-2细胞共培养体系中, 丙酸降低了促炎细胞因子的产生。LPS诱导炎症的嗜中性粒细胞中, 丙酸能够降低TNF-α的产生与释放[22-23]。在体内, Tong等[7]给予结肠炎小鼠丙酸后, 下调了促炎因子IL-6、IL-1β和TNF-α mRNA表达。然而, Yan等[5]研究发现, 1 mmol·L-1丁酸处理正常的IPEC-J2细胞, 显著上调了促炎因子IL-8和TNF-α mRNA的表达。此外, 在Caco-2细胞上也具有类似的作用[24]。Mirmonsef等[25]研究发现, 20 mmol·L-1短链脂肪酸诱导IL-8、IL-6和TNF-α的释放, 但较低浓度(0.02~2 mmol·L-1)的短链脂肪酸不能诱导细胞因子释放。因此, 一些研究者认为, 炎症细胞因子的释放依赖于短链脂肪酸的类型, 剂量以及细胞的生理状态。此外, 短链脂肪酸的早期促进细胞炎症反应可能对细胞免疫调节具有一定的刺激作用。这种微弱的刺激作用导致炎症因子的产生, 有助于加强肠道黏膜免疫防御而不是损伤肠道上皮的完整性, 对肠道健康具有一定的保护作用[26]。
综上, 不同水平丙酸钠降低了IPEC-J2细胞的通透性, 选择性上调了紧密连接蛋白及炎症细胞因子的表达, 一定程度上维护细胞屏障功能, 揭示了丙酸在小肠细胞屏障功能以及炎症反应过程中具有一定的调节作用。
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