脱氧雪腐镰刀菌烯醇(deoxynivalenol, DON), 又名呕吐毒素, 是一种B型单端孢霉烯族类毒素, 主要由禾谷镰刀菌产生。在适宜条件下, DON广泛污染粮谷类作物, 如小麦、大麦、燕麦和玉米等, 其造成的危害已成为全球农业领域的重要问题之一。动物摄入DON可引起拒食和呕吐等行为^[1]。由于不同物种对DON的吸收、分布、代谢和清除方面的差异, 导致不同动物对DON的敏感性从大到小依次为猪、小鼠、大鼠、家禽或反刍动物。DON可减少猪的体质量和采食量, 严重损害内脏器官, 并对其神经系统、免疫系统、肠屏障和生殖功能等均产生毒性作用^[2-6]。DON具有广泛的细胞毒性, 并通过抑制蛋白质、DNA和RNA合成以及破坏线粒体功能从而诱导细胞凋亡^[7], 其特征是引发DNA损伤和线粒体膜通透性增加以及一系列细胞生化改变^[8]。线粒体信号通路是细胞凋亡最主要的路径之一。一般认为线粒体途径是指细胞受到外源性刺激导致线粒体对离子选择性通过作用减弱, 进而引起线粒体膜电位降低, 导致相关凋亡蛋白和基因的表达发生改变, 主要包括半胱天冬酶(caspase)活化和Bcl-2家族基因表达水平的调控^[9-12]。Zhang等^[13]证明DON在HepG2细胞中诱导氧化应激相关的DNA损伤。Li等^[14]证明DON作用于小鼠胸腺上皮细胞, 引起线粒体功能障碍, 影响相关蛋白水平从而诱导细胞凋亡。

目前有关DON对细胞毒性的研究较多, 而DON对猪神经细胞的毒性作用及凋亡信号通路的研究较少。因此, 本试验以仔猪海马细胞为对象, 观察DON染毒后对其细胞形态的改变, 对细胞活力和线粒体膜电位的影响以及凋亡相关酶活性和基因表达水平的变化, 以探讨DON诱导仔猪海马神经细胞凋亡的作用机制, 为深入研究DON的毒性作用提供试验依据。

1 材料与方法 1.1 试验材料和仪器

DON标准品(含量不小于99%)为美国Sigma公司产品。仔猪海马神经细胞(CPCR423)购于上海赛齐生物工程有限公司。DMEM高糖培养基、胎牛血清为美国Thermo公司产品。CCK-8细胞活性检测试剂盒为同仁化学研究所产品。乳酸脱氢酶检测试剂盒为南京建成生物科技有限公司产品。胰酶细胞消化液、线粒体膜电位检测试剂盒(JC-1)、caspase-3活性检测试剂盒均为碧云天生物技术公司产品。Trizol裂解液为TaKaRa公司产品。First Strand cDNA Synthesis Kit为美国Biomiga公司产品。BIOMIGA SYBR qPCR Mix试剂盒为日本Toyobo公司产品。

BB-15二氧化碳恒温培养箱、Multiskan Mk3酶标仪、Smart2Pure 12UV/UF超纯水一体机以及荧光定量PCR仪均购于美国Thermo公司; XDS-1B倒置生物显微镜购于日本Nikon公司; IX51/IX71倒置荧光显微镜购于日本Olympus公司; JEM-1230投射电子显微镜购于日本电子株式会社; TC-XP基因扩增仪购于杭州博日科技有限公司。

1.2 仔猪海马神经细胞的传代培养

细胞采用单层贴壁法培养。DMEM高糖培养基中需补加100 mL·L^-1胎牛血清(FBS)、100 U· mL^-1青霉素和100 g·mL^-1链霉素。将仔猪海马细胞从液氮中取出, 复苏后转移至4 cm×6 cm培养瓶中, 置于37 ℃、5% CO₂细胞培养箱中培养。待细胞覆盖瓶底80%以上进行传代。传代时, 吸弃培养上清液, PBS洗涤后加入0.5 mL胰酶消化, 待细胞间隙增大, 立即加入3 mL培养液终止消化; 1 000 r·min^-1离心5 min, 收集细胞, 加入适量新鲜培养基, 吹匀细胞, 按需传代培养。

1.3 DON母液配制及试验分组

将1 mg DON标准品溶于5 mL培养基中, 配成200 μg·mL^-1的DON母液。将处于对数生长期的仔猪海马细胞分别使用终质量浓度为0、125、250、500、1 000和2 000 ng·mL^-1的DON进行处理。

1.4 细胞形态学观察

将处于对数生长期的仔猪海马细胞以1×10⁵ mL^-1的密度接种于6孔细胞培养板, 置于37 ℃、5% CO₂饱和湿度条件下培养至细胞贴壁, 更换含不同质量浓度DON(0、125、250、500、1 000和2 000 ng·mL^-1)的培养液分别处理6、12和24 h后, 于倒置显微镜下观察细胞形态并摄片。

将处于对数生长期的仔猪海马细胞以1×10⁵ mL^-1的密度接种于6孔细胞培养板, 置于37 ℃、5% CO₂饱和湿度条件下培养至细胞贴壁, 更换含不同浓度DON(0、125、250、500、1 000和2 000 ng·mL^-1)的培养液处理24 h后, 收集各组细胞, 2 000 r·min^-1离心10 min, 弃上清液, 用戊二醛将细胞固定并制片, 于电子显微镜下观察并摄片。

1.5 CCK-8法检测细胞存活率

将处于对数生长期的仔猪海马细胞以1×10⁵ mL^-1的密度接种于96孔细胞培养板, 每孔100 μL, 置于37 ℃、5% CO₂饱和湿度条件下预培养24 h, 更换含不同质量浓度DON(0、125、250、500、1 000和2 000 ng·mL^-1)的培养液, 分别处理6、12和24 h后向每孔加入10 μL CCK-8溶液, 继续放入培养箱中孵育1~4 h, 直至有明显的黄色物质出现, 用酶标仪测定A₄₅₀值, 按如下公式计算各试验组的细胞存活率。

1.6 线粒体膜电位的检测

将密度为1×10⁵ mL^-1的仔猪海马细胞接种于6孔细胞培养板, 分别用0、125、250、500、1 000和2 000 ng·mL^-1DON处理贴壁细胞24 h后, 用PBS洗涤细胞1次, 加入1 mL细胞培养液和1 mL JC-1染色工作液, 混匀, 37 ℃、5% CO₂培养箱中避光孵育20 min后, 吸弃上清液, 用JC-1染色缓冲液洗涤2次, 加入2 mL细胞培养液, 荧光显微镜下观察。

将密度为1×10⁵ mL^-1的仔猪海马细胞接种于6孔细胞培养板, 分别用0、125、250、500、1 000和2 000 ng·mL^-1 DON处理贴壁细胞24 h后, 用胰酶消化收集细胞, PBS清洗后重悬于0.5 mL细胞培养液中, 加入0.5 mL JC-1染色工作液, 混匀, 37 ℃、5% CO₂培养箱中避光孵育20 min后, 4 ℃、3 000 r·min^-1离心5 min收集细胞, JC-1染色缓冲液洗涤2次, 用适量JC-1染色缓冲液重悬细胞, 流式细胞仪检测细胞线粒体膜电位。结果以平均荧光强度表示。

1.7 Caspase-3酶活性的检测

按照caspase-3活性检测试剂盒的说明操作。取处于对数生长期的仔猪海马细胞, 经不同质量浓度DON(0、125、250、500、1 000和2 000 ng·mL^-1)分别处理24 h后, 吸弃细胞培养液, 备用; 用胰酶消化贴壁细胞, 收集至备用的细胞培养液中。4 ℃、600 r·min^-1离心5 min, 收集细胞, PBS洗涤后加入200 μL裂解液重悬沉淀, 冰浴裂解15 min, 4 ℃、16 000~20 000 g离心10~15 min, 把上清液转移到预冷的离心管中, 每个细胞样品中加入终浓度为0.2 mmol·L^-1的caspase-3底物(Ac-DEVD-AMC), 37 ℃孵育2 h。用酶标仪检测样品A₄₀₅值。

1.8 Bcl-2和Bax mRNA表达水平测定

将处于对数生长期的仔猪海马细胞以1×10⁵ mL^-1的密度接种于6孔细胞培养板, 置于37 ℃、5% CO₂饱和湿度条件下预培养24 h, 更换含不同质量浓度DON(0、125、250、500、1 000和2 000 ng·mL^-1)培养液处理24 h后, Trizol法抽提RNA并测定浓度, 使用First Strand cDNA Synthesis Kit将RNA反转录成cDNA。根据GenBank相关序列设计合成目的基因Bcl-2、Bax和GAPDH内参基因引物的序列, 引物序列及参数见表 1。按照StepOne^TM Real-Time PCR System和BIOMIGA SYBR qPCR Mix试剂盒的说明配制实时荧光定量PCR(qPCR)反应液。

采用三步法qPCR程序:预变性(95 ℃ 2 min); PCR反应(95 ℃ 10 s, 60 ℃ 30 s, 72 ℃ 30 s, 40循环); 55 ℃ 1 min, 55 ℃→98 ℃, 每0.01 s升温0.05 ℃, 20 ℃ 10 s。每个样品基因和内参基因GAPDH均在相同条件下进行扩增反应, 重复3次。

1.9 数据处理

试验数据均以x±SD表示, 利用SPSS 20.0统计软件进行单因素方差分析; 采用GraphPad Prism 5.0软件绘制柱形图。

2 结果与分析 2.1 仔猪海马神经细胞的形态学变化

在倒置显微镜下观察各组细胞的生长状况, 如图 1所示:经DON作用6 h后, 视野中对照组海马神经细胞均已贴壁, 呈梭形、三角形或不规则形, 部分细胞长出胞突, 随DON质量浓度的增大, 圆形细胞数量增多。DON作用12 h后对照组海马神经细胞数量与6 h相比明显增多, 胞体饱满清晰, 突起明显, 分支较多。随着DON质量浓度增大, 各处理组的细胞数量逐渐减少, 排列稀疏, 细胞形态受损。DON作用24 h后, 可见对照组细胞胞体更加饱满, 突起明显且交织成网络。由此可见:随着DON染毒浓度的增大, 仔猪海马细胞的数量减少, 悬浮细胞增多, 细胞严重受损且变形。

2.2 仔猪海马神经细胞超微结构的变化

电子显微镜下观察对照组仔猪海马细胞的超微结构(图 2), 可见清晰的细胞核和细胞器, 细胞质内胞浆致密(图 2-A1);线粒体结构完整(图 2-A2)。仔猪海马细胞经125 ng·mL^-1 DON处理后, 细胞核皱缩, 胞质中出现少量空泡(图 2-B1);线粒体肿胀并出现少量空泡化(图 2-B2)。仔猪海马细胞经250 ng·mL^-1 DON处理后, 可见细胞核染色质聚集, 核体积进一步缩小, 线粒体空泡化增多(图 2-C1);线粒体肿胀和空泡化(图 2-C2)。仔猪海马细胞经500 ng·mL^-1 DON处理后, 神经细胞染色质聚集并靠近核膜, 核仁消失, 胞质中空泡化现象严重, 出现空泡区, 细胞间失去接触, 细胞器结构被破坏(图 2-D1);线粒体肿胀和空泡化现象严重(图 2-D2)。仔猪海马细胞经1 000 ng·mL^-1 DON处理后, 神经元细胞肿胀, 呈核固缩、分裂, 染色质聚集, 胞质中出现空泡区, 细胞器严重损伤至不可见(图 2-E1);细胞线粒体仍表现为肿胀和空泡化(图 2-E2)。仔猪海马细胞经2 000 ng·mL^-1 DON处理后, 可见细胞核体积进一步缩小, 基本不可见细胞器, 可见结构完整的凋亡小体(图 2-F1);线粒体肿胀且严重空泡化(图 2-F2)。这表明随DON浓度的增加, DON的毒性作用主要表现为诱导仔猪海马细胞凋亡的发生, 出现细胞核皱缩, 染色质聚集并边缘化, 胞浆肿胀, 细胞器的变化主要为线粒体肿胀和空泡化。

2.3 DON对仔猪海马细胞存活率的影响

如图 3所示:与对照组相比, 仔猪海马细胞经DON作用6 h后, 500 ng·mL^-1组的细胞存活率呈显著降低(P < 0.05), 1 000和2 000 ng·mL^-1组的细胞存活率呈极显著降低(P < 0.01);DON作用12 h后, 500、1 000和2 000 ng·mL^-1组的细胞存活率呈极显著降低(P < 0.01);DON作用24 h后, 125 ng·mL^-1组细胞存活率显著降低(P < 0.05), 其余组均极显著降低(P < 0.01), 且DON浓度为1 000 ng·mL^-1时细胞的存活率达到最低; 而同一浓度组的细胞存活率随DON处理时间的增加而降低。结果表明:仔猪海马神经细胞的存活率随着DON浓度增加和处理时间的延长而降低, 呈现出明显的量效和时效关系。

2.4 DON对仔猪海马细胞线粒体膜电位水平的影响

在荧光显微镜下观察不同质量浓度DON对仔猪海马细胞线粒体膜电位的影响, 如图 4-A所示:对照组细胞的红色荧光强, 而绿色荧光较弱; 随着DON质量浓度的增加, 对照组细胞的红色荧光逐渐减弱, 而绿色荧光逐渐增强。流式细胞仪检测细胞散点图(图 4-B)显示, 与对照组相比, DON处理组细胞的绿色荧光强度随DON质量浓度的增加逐渐增强。红、绿荧光强度的比值如图 4-C所示, 与对照组相比, DON处理组红、绿荧光强度比值均极显著下降(P < 0.01)。

2.5 DON对caspase-3酶活性的影响

Caspase-3酶活性检测结果如图 5所示:与对照组相比, DON质量浓度为125、250和500 ng·mL^-1处理组的caspase-3酶活性略有增加, 但差异不显著(P > 0.05);1 000 ng·mL^-1组的caspase-3酶活性显著增加(P < 0.05);DON质量浓度增加到2 000 ng·mL^-1时, caspase-3酶活性极显著增加(P < 0.01)。

2.6 DON对Bax和Bcl-2 mRNA表达水平的影响

通过荧光定量PCR法测定Bax和Bcl-2 mRNA表达量并计算两者的比值, 结果如图 6所示:与对照组相比, DON质量浓度达到250 ng·mL^-1时, Bax mRNA表达水平极显著增加(P < 0.01), 且随着DON质量浓度的增加而提高; Bcl-2 mRNA表达水平随着DON质量浓度的增加极显著降低(P < 0.01), 在1 000 ng·mL^-1时达到最低; 与对照组相比, 当DON质量浓度达到500 ng·mL^-1时, Bax/Bcl-2值显著增加(P < 0.01), 在1 000 ng·mL^-1时达到最高。

3 讨论

猪是对DON最敏感的物种之一, 国内、外的研究较多集中在DON对人、鼠、禽类和猪的胃肠道及生殖以及免疫系统的毒性作用机制方面^[15-17], 而对猪的神经细胞毒性研究仍不深入。Ma等^[18]研究了DON对HT-29细胞毒性作用的分子机制的结果表明, DON诱导细胞出现经典晚期凋亡形态, 包括核收缩和碎裂、染色质聚集、缺乏微绒毛、出现凋亡体以及线粒体细胞器溶胀和空泡化。本试验用倒置显微镜观察的结果显示, 仔猪海马细胞经DON处理后, 细胞数量随着DON质量浓度的增加而减少, 部分缩小变圆的细胞和死亡裂解的细胞从培养板壁脱离, 悬浮于培养液中。电镜观察同样出现细胞凋亡的典型超微结构变化, 包括核固缩、染色质聚集以及空泡变性, 且结果均呈时间和剂量依赖性。这表明线粒体通路可能是DON诱导细胞凋亡的作用机制之一。细胞存活率的检测结果显示, DON对仔猪海马细胞的毒性呈时间和剂量依赖性。经DON处理后的细胞存活率极显著降低, 同时形态学观察显示细胞形状异常, 细胞数量随着DON质量浓度的增加而降低, 表明DON抑制仔猪海马细胞的增殖。本研究的形态学结果与细胞存活率的检测结果是一致的, 而2 000 ng·mL^-1 DON作用于仔猪海马细胞24 h后细胞存活率上升, 推测其可能与Bax和Bcl-2 mRNA相对表达量有关, 该结果与Ma等^[18]的研究报道一致。

线粒体是细胞生命活动的控制中心, 不仅调控细胞呼吸链和氧化磷酸化, 而且也是细胞凋亡的调控中心。细胞内线粒体跨膜电位(mitochondrial membrane potential, MMP, ΔΨm)在细胞凋亡中起重要作用。线粒体通透性转变孔道(permeability transition pore, PTP)是跨越线粒体外膜和内膜的通道, PTP周期性开放, 以维持线粒体内电化学平衡及稳定状态。线粒体内ΔΨm的降低甚至崩解是细胞凋亡的特异性早期指标之一。线粒体是DON细胞毒性损伤的主要细胞器^[18], 其损伤可以直接或间接氧化或损伤DNA、蛋白质和脂质, 进而导致细胞凋亡或坏死^[19]。近年来的研究发现多种细胞在DON作用下发生凋亡时均伴有ΔΨm的下降。Deng等^[20]研究DON对人类脐静脉内皮细胞凋亡的作用机制, 结果显示DON通过降低线粒体膜电位引起线粒体损伤。Li等^[14]研究DON诱导MTEC1细胞凋亡过程中的线粒体机制, 发现DON通过引起线粒体功能障碍等毒性作用诱导细胞凋亡。本试验结果显示, DON可以诱导仔猪海马细胞的线粒体膜电位降低且呈剂量依赖性, 这与Wang等^[21]研究结果一致。

Caspase家族成员介导的蛋白酶级联反应是细胞凋亡的主要途径之一。其中caspase-3是多种凋亡途径的共同下游效应因子, 凋亡的最后实施是通过caspase-3的激活而实现的。因此其又被称为“死亡执行蛋白酶”^[22]。线粒体ΔΨm的降低, 可活化caspase蛋白酶家族, 引起细胞凋亡级联反应, 使细胞进入不可逆的凋亡过程。已有研究证实caspase-3在DON诱导凋亡的线粒体通路过程中发挥重要作用^[18]。Bensassi等^[23]证明了DON在人结肠癌细胞中通过激活caspase-3诱导DNA片段化而最终导致细胞凋亡。本试验中, DON作用后的仔猪海马细胞中caspase-3酶活性随着DON质量浓度的增加而升高, 呈剂量依赖性; 当施加的DON质量浓度达到1 000 ng·mL^-1时, 仔猪海马细胞中的caspase-3酶活性显著升高, 结果与流式细胞仪检测到的线粒体膜电位结果相符。Bensassi等^[7]的研究结果表明线粒体相关凋亡途径参与了DON诱导细胞体外毒性的过程, 且呈半胱氨酸蛋白酶依赖性。

Bcl-2家族在细胞凋亡的线粒体途径中发挥重要的作用^[24-25]。其中Bcl-2 是主要的抗凋亡因子, 抑制细胞色素C的释放, 使细胞色素C无法达到激活下游caspase的阈值, 保护细胞不发生凋亡。而Bcl-2家族中的Bax是促凋亡蛋白, 其可能在其他凋亡因子激活下, 易位到线粒体膜上, 破坏线粒体的结构和功能。因此, Bax/Bcl-2 值是评价许多作用因子介导细胞凋亡的重要指标^[26]。本试验结果显示, Bax mRNA表达水平随着DON剂量的增加而升高, 而Bcl-2 的趋势与之相反, 因而Bax/Bcl-2 值增加。仔猪海马细胞表现为促凋亡作用增强, 抗凋亡作用减弱, 均呈剂量依赖性。本结果与Deng等^[20]的研究结果一致。Bcl-2家族蛋白对线粒体的影响在细胞凋亡的早期起内源性作用^[27]。Qin等^[28]的研究结果表明Bcl-2蛋白能够抑制线粒体的PT通道的开放, 稳定线粒体膜电位; 沉默Bax后可显著抑制细胞凋亡, 表明Bax在细胞凋亡的内源性通路中起关键作用。Bensassi等^[7]研究也发现促凋亡蛋白Bax通过促进PTP开放和ΔΨm上调调节DON介导的细胞毒性。DON作用使Bax易位到线粒体上从而激活caspase-3并导致细胞凋亡^[29]。

因此, DON引起仔猪海马细胞的ΔΨm下降, 进而破环线粒体膜结构, 导致Bcl-2家族Bax/Bcl-2 值增大, 与细胞凋亡率和caspase-3酶活性呈正相关, 这说明DON在诱导仔猪海马细胞凋亡的过程中, Bax拮抗Bcl-2的保护作用, 导致线粒体膜电位降低, 线粒体膜的通透性增大, 从而启动线粒体凋亡途径, caspase家族的级联反应被激活, 其下游凋亡执行蛋白caspase-3活性增加, 最终引起细胞凋亡。