马铃薯(Solanum tuberosum L.)为茄科(Solanaceae)一年生双子叶草本植物^[1], 其单产水平是谷类作物的2~4倍, 水分利用效率比谷类作物高7倍(http://cipotato.org/potato/facts)。我国小麦、玉米主产区正遭受水资源短缺困境, 马铃薯作为主粮可持续增产的战略替代作物, 已被列为我国第四大主粮作物。在生产过程中, 由于病毒的侵染, 马铃薯容易出现生长势衰退、薯块变小或畸形等一系列的退化现象, 导致其产量及质量的下降, 严重影响马铃薯的生产。可靠的繁种技术是确保马铃薯高产优质的基础。传统繁种技术使病毒在种薯中世代积累和传递, 种性退化, 造成马铃薯减产20%~50%^[2]。脱毒试管薯技术能有效解除病毒侵染的制约, 以该技术为核心构建种薯工厂化生产的现代繁种工业体系, 能实现周年稳定的规模产出, 为种植业提供优质脱毒种薯。此外, 试管薯也是研究马铃薯碳水化合物代谢的一个适宜模式, 同时它还是进行遗传转化的良好受体^[3-6]。

试管薯的诱导是受“基因型-环境-生物化学因子”相互作用、共同调节的复杂过程^[7-9]。基因型的差异是影响试管薯诱导的主要因素之一。在相同的诱导条件下, 早熟品种的试管苗结薯能力强于晚熟品种^[10]。温度对试管薯的诱导有一定的影响, 昼夜变温环境条件下, 试管薯诱导率较高^[11]。外源激素能显著提高试管薯的产量, 缩短生产周期, 但受制于薯块畸形率高、方法繁琐等缺点^[12-15]。光为植物光合作用提供能源, 对植物的生长、发育有重要的调节作用。由于组培容器透光, 且试管薯可在试管苗的任何腋芽处形成, 所以马铃薯组培苗的光合作用、形态建成、物质代谢, 以及后续试管薯的诱导形成、膨大等生育进程势必会受到光的影响。

关于试管薯诱导的研究已取得了长足进展, 目前主要集中在培养基类型、外源激素、光周期等方面。吴秋云等^[16]发现相较于固体培养基, 在液体培养基中, 试管薯诱导率较高; Abbott等^[17]发现培养基中添加6-BA有利于试管薯的形成; Perl等^[18]认为短日照有利于试管薯的形成, 长日照利于试管薯的发育。而关于光密度与光谱分布影响试管薯诱导与膨大的研究, 不同的试验结果间存在差异与争议, 甚至相互矛盾。有研究认为全黑暗条件下, 试管薯诱导率较高^[5], 也有研究认为弱散射光下的试管薯诱导率比全黑暗及强散射光条件下的高, 且大薯较多^[19]; 有研究认为白光下诱导的试管薯多且大^[20], 也有研究表明蓝光条件下能形成优质试管薯^[21]。马铃薯试管苗产生的光合产物既要向试管薯中转运, 也要供给自身的生长发育。然而, 光密度与光谱是否影响以及如何调控马铃薯组培苗的形态建成和物质代谢, 进而如何影响试管薯的形成与膨大, 相关的系统性研究有待完善。

在组织培养条件下, 马铃薯试管薯的形成受到多种环境因素的调控, 光照、温度以及培养基类型等都会影响试管薯的形成及发育。光不仅作为光合作用的能量来源, 而且还作为一种重要的信号源, 调节基因的表达、影响酶活性以及形态建成等, 以促使植物更好地适应外界环境^[22-23]。光密度直接影响植物光合作用的强弱。光密度过高时, 会破坏原生质引起叶绿素分解, 或者使细胞失水过多而使气孔关闭, 造成光合作用减弱, 出现光抑制现象。当光密度低于光补偿点时, 光合作用制造的有机物质少于呼吸消耗, 植物不能正常生长发育。而在光形态建成过程中, 光谱作为信号, 植物通过光受体感应这种信息后, 通过信号传导途径而引导相关基因的表达与调控, 从而激活一系列生理生化代谢过程^[24], 最终导致马铃薯试管苗形态结构特征的建成, 以便更好地完成试管薯的生长发育。因此组织培养条件下, 光密度以及光谱可以被用来调控马铃薯组织或器官的生长发育^[25]。

1 光密度与光谱对马铃薯试管苗壮苗的影响

试管苗的状况直接影响试管薯的形成和产量, 试管薯的结薯率及大薯率均与试管苗有密切的联系^[19]。只有在试管薯诱导前期, 培养出叶色浓绿、茎粗壮、根系发达、较高生物量和干物质的试管苗, 才有可能诱导出高产优质的试管薯^[26]。试管薯的诱导分为两个阶段, 即壮苗阶段和试管薯诱导阶段。在试管薯诱导之前, 需先经过一段时间的壮苗培养, 再进行试管薯诱导。高效率地培养试管苗壮苗, 是试管薯繁种技术得以运用和推广的关键。形成马铃薯试管薯的物质, 部分来自于试管苗光合作用所合成的碳水化合物, 碳水化合物的形成与马铃薯试管苗光合作用有着密切联系。因此, 有必要了解光密度和光谱对马铃薯试管苗壮苗培养的影响, 探索光合产物的形成及转运。

1.1 光密度对马铃薯试管苗壮苗的影响

一般来说, 植物中的干物质有90%~95%是来自光合作用, 在光饱和点以下, 光合强度随光密度的增加而增加^[24]。在试管苗壮苗培养的不同试验中, 所采用的光密度差异较大, Wang等^[27]、Forti等^[28]、卢娟^[29]、金建钧^[30]分别采用2 000 lx、3 000 lx、4 000 lx进行试管苗培养; Ahn等^[31]也分别以3 000 lx和300 lx进行试管苗的培养, 发现在高光密度下, 试管苗长势好, 其鲜样质量和干物质均高于低光密度处理。孔繁春等^[32]研究了不同培养方式和光密度对马铃薯脱毒试管苗微繁的影响, 发现3 000 lx光照下的植株生长最好, 其次是自然光, 1 000 lx和2 000 lx处理与3 000 lx处理相比, 差异不明显, 这与陈凯等^[33]的研究结果一致。在实际应用中, 目前多参考使用2 000~2 500 lx的光密度, 用以培养马铃薯试管苗^[34-36]。

陈兆贵等^[37]的研究表明60 μmol·m^-2·s^-1的光密度适宜于培育马铃薯组培苗; 柳红^[38]和Ma等^[39]采用LED(light-emitting diode)光源开展试验, 分别发现65 μmol·m^-2·s^-1和72 μmol·m^-2·s^-1的光密度均适宜于马铃薯试管苗生长。Ma等^[39]认为较高的光密度有利于培养马铃薯试管苗壮苗。但过高的光密度会对植物的光系统造成伤害, 出现光抑制现象。有研究发现马铃薯试管苗在高光密度下生长不旺盛, 并且发现24 h连续光照下, 马铃薯组培苗出现萎黄和坏死斑点^[40], 但是温变周期能够缓解高光密度对马铃薯组培苗的危害^[41]。由于品种和环境的差异, 适宜于马铃薯试管苗壮苗光密度参数的研究仍有待系统性实施, 目前的研究积累还不足以担当起向实际生产提供适宜光密度推荐值的重任。

1.2 光谱对马铃薯试管苗壮苗的影响

植物光形态建成所需要的光, 主要集中在光谱的近紫外光区(300~380 nm)、蓝光区(430~490 nm)、红光区(640~700 nm)以及远红光区(700~760 nm)^[24]。光谱是指能被植物光受体感知并被吸收的各波长光的组合^[25]。采用LED补充红光或远红光的光密度来重构光谱, 能控制马铃薯组培苗的茎长与生长状况^[42], 光谱中红光比例的增加可以促进马铃薯试管苗叶面积的增加^[43]。Seabrook等^[44]研究了黄色树脂滤膜对马铃薯试管苗生长的影响, 发现去除光谱中的蓝光可以增加试管苗的株高。常宏等^[45]研究了不同光谱(白光、红光、蓝光)对马铃薯试管苗生长和试管薯形成的影响, 发现在红光下试管苗叶片的净光合速率、可溶性糖含量和生物量最多; 蓝光有利于试管苗干物质含量的提高, 而在白光条件下, 试管苗净光合速率和干物质含量最低。

采用高频闪烁的红、蓝光LED培养马铃薯组培苗, 在不提高耗电成本下, 能提高马铃薯组培苗的生长速率^[46-47]; 但又有研究指出马铃薯组培苗的生长速率在无闪烁的红、蓝光LED光照下最高^[48-49]。陈兆贵等^[37]选择6个LED光谱组合处理, 分别是RL(红光):BL(蓝光):GL(绿光)=20:20:20、RL:BL:GL=20:25:15、RL:BL:GL=20:30:10、RL:BL:GL=10:30:20、RL:BL:GL=10:40:10以及白炽灯(光密度均为60 μmol·m^-2·s^-1), 30 d培养后的结果表明:在RL:BL:GL=10:30:20处理下, 马铃薯试管苗的形态指标、可溶性蛋白和氨基酸含量等高于其他光谱组合处理; RL:BL:GL=20:30:10处理各项指标次之。随着蓝光比例的增加, 马铃薯试管苗的鲜样质量和干样质量均增加, 说明了蓝光光谱有利于光合产物的运转和积累。总的来说, 蓝光光谱比例较高的光谱组合RL:BL:GL=10:30:20较有利于马铃薯试管苗的生长。柳红^[38]的研究发现, 红蓝紫光谱下马铃薯茎粗、根数和株高等生长指标较好, 生理指标适中, 是较适宜的光谱。Ma等^[39]研究认为, 红蓝绿是适合于马铃薯试管苗培育的光谱。

基于迄今为止的研究结果, 我们试图得出如下的阶段性认识, 即红光可以促进马铃薯试管苗株高和叶面积的增加, 并且叶片的净光合速率、可溶性糖含量和生物量较多; 蓝光下生长的试管苗矮小健壮, 叶片较大, 干物质含量较高; 白光下生长的试管苗净光合速率和干物质含量较低。红、蓝光是马铃薯试管苗壮苗所必需的光谱, 红蓝紫和红蓝绿组合光是马铃薯试管苗生长的较适宜的光谱, 但是, 在红蓝背景光谱下, 添加其他不同的光谱对马铃薯组培苗的生长发育和形态建成的研究还不够全面, 需要进一步完善。

2 光密度与光谱对马铃薯试管薯诱导的影响

试管薯诱导率能直接反映马铃薯组培苗的结薯能力^[20], 是试管薯产量形成的重要指标之一, 在保证大小符合要求的情况下, 生产较多数量的试管薯, 提高试管薯诱导率, 是马铃薯脱毒技术能够大面积应用的前提。已有的研究表明, 短日照有利于试管薯的形成。每天8 h光照、16 h黑暗的光周期处理可以增加结薯数^[50]。若每天光照时间超过15 h, 则马铃薯茎叶与匍匐茎生长旺盛, 而块茎的形成却延迟发生, 以致产量下降, 而短日照条件则会使块茎的形成提前^[51]。对生长4周的试管苗黑暗处理2 d, 再进行短日照诱导, 与直接在短日照条件下诱导的处理比较, 前者单株试管薯形成数量显著增多^[52]。

2.1 光密度对马铃薯试管薯诱导的影响

常规的试管薯诱导多在全黑暗条件下进行。贾长盛等^[53]开展了散射光诱导结薯的试验, 张颙等^[54]开展了大范围光密度(0~3 000 lx)处理的结薯试验, 均发现结薯数随光密度的减弱而增加, 从弱光到黑暗的低光密度处理, 结薯效果较好, 从自然光到强光的高光密度处理, 结薯效果较差。虽然黑暗处理有利于试管薯的形成^[55-58], 但长时间的黑暗处理易导致试管苗黄化、枯死, 对马铃薯试管苗的继续生长发育极为不利, 进而会降低试管苗的结薯率^[59]。因此, 在试管薯诱导阶段, 每天保持适当时间的光照是非常有必要的。

Dobránszki等^[60]指出, 短时间的高光密度处理有利于试管薯提早。虽然高光密度可缩短试管薯形成的起始时间, 但这种影响与光周期和试管薯的基因型密切相关, 诱导完成后, 高光密度对试管薯膨大的影响不大。有研究发现, 在强散射光条件下, 组培苗徒长严重, 分枝多, 苗色浅, 处理14 d才有少量试管薯形成; 在弱散射光环境下, 试管薯结薯时间比全黑暗条件下多1 d, 但茎段生长势强, 既形成了许多匍匐茎, 又形成了许多均一的试管薯, 结薯数分别为全黑暗和强散射光条件下的1.4和1.5倍^[61]。金明石等^[62]也提出了相同观点, 全黑暗使试管薯发生提前, 结薯集中, 但对试管薯质量增加不利, 而每天8 h散射光照(500~1 000 lx)对试管薯诱导率和大薯率都有所提高。

关于光密度对马铃薯试管薯诱导率的影响, 已有的试验只是以弱光或散射光作宽泛的界定, 并没有给出一个确切的光密度或者光密度范围, 也并没有得出一致的结论。因此, 光密度如何影响试管薯诱导以及适宜于试管薯诱导的光密度范围的界定, 有待系统、深入的探究。

2.2 光谱对马铃薯试管薯诱导的影响

光谱可在植物组织培养中对一些形态的建成起到一定的调节作用^[63]。单建伟^[20]以白、红、蓝3种光谱开展试验, 以单株结薯数作为考察指标, 发现光谱在基础苗繁殖和试管薯诱导期以及基因型方面对试管薯形成有显著影响, 且各因素间存在显著的交互作用; 白光光谱更利于马铃薯试管薯的形成, 当完成试管薯形态建成后, 蓝光光谱更利于试管薯的持续膨大, 红光光谱对试管薯的形态建成及生长具有阻碍作用。常宏等^[45]也发现, 在红光下, 马铃薯试管苗叶片净光合速率、可溶性糖含量和生物量均高于蓝光处理和白光处理; 蓝光对试管苗的干物质含量、后期的结薯数以及结薯期提前有明显的促进作用。据此, 上述研究认为壮苗培养阶段采用红光, 试管薯诱导阶段采用蓝光有利于提高试管薯的产量。

而Fixen等^[64]得出了不一致的研究结果:蓝光对日中性马铃薯试管薯的形成有抑制作用, 而其他品种的马铃薯却能够在蓝光条件下形成试管薯。短日照条件下, 黑暗期短暂的红光处理可以打破短日照对马铃薯块茎的诱导作用, 而在红光处理后立即用远红光处理则可以恢复红光处理对马铃薯块茎的抑制作用^[65]。Aksenova等^[66]研究发现, 组织培养条件下, IAA和红光对栽培种Miranda single-node cutting存在协同影响, 红光条件下, IAA使试管苗的茎长缩短, 并可以诱导试管薯的形成; 蓝光条件下, Kinetin对马铃薯试管薯的形成具有较强的促进作用。

单色光谱并不能满足马铃薯试管苗的正常生长发育, 这对后期提高试管薯诱导率势必存在影响, 因此在单色光谱研究的基础上, 不同光谱组合如何影响试管薯诱导率有待于进一步探究。

3 光密度与光谱对马铃薯试管薯膨大的影响

在种薯生产中, 人们通常把薯质量大于50 mg的试管薯定义为有效薯, 大薯率同样是试管薯诱导中的一项重要指标。太小的试管薯在贮藏过程中容易散失水分、瘪缩, 造成发芽率不高或者出苗不整齐; 较大的试管薯, 其发育能力和出芽率都比较高, 能够获得整齐一致的幼苗, 有利于下一代的繁殖。所以, 在试管薯诱导过程中, 在保证试管薯较高诱导率的前提下, 如何增加大小薯的数量和比例, 是试管薯生产的关键^[67]。

短日照有利于试管薯的形成, 黑暗是诱导试管薯和增加结薯数的必要条件^[68]。但是, 长时间的黑暗处理会导致试管苗黄化, 以致枯死, 试管苗不能进行光合作用, 没有光合产物的形成, 势必会影响试管薯的膨大。所以, 在试管薯诱导阶段, 黑暗处理一段时间后给予一定时间的光照, 使试管苗恢复光合作用是很有必要的。每天8 h光照、16 h黑暗处理可以增加单薯质量^{[50, 69]}。

3.1 光密度对马铃薯试管薯膨大的影响

早期的研究认为黑暗条件更有利于试管薯的诱导^[55-58], 但有学者经过后续试验提出了不同的观点, 认为:虽然全黑暗的环境下, 试管薯结薯时间较短, 但茎段生长势弱, 量少, 小薯率高; 强散射光条件下的试管薯质量轻、大薯率低, 多为畸形薯; 在弱散射光环境下, 茎段生长势强, 既形成了许多匍匐茎, 又形成了许多均一的试管薯, 大薯率也得到了显著提高^[59]。光照时间不够导致试管苗过于纤细以致死亡, 严重影响试管薯的产量; 光照时间过长则无法满足试管薯形成对黑暗的需求, 同样对试管薯造成负面影响^[70]。而光照时间的长短, 又直接决定了光合阶段的光密度累积量的多少, 进而影响到光合产物的积累量。马铃薯品种‘Red Pontiac’和‘Shepody’在8 h光照下产生的试管薯鲜质量是全黑暗处理所产生试管薯鲜质量的2倍以上^[55]。史俊等^[57]研究表明, 每天8 h光照、16 h黑暗有利于试管薯的形成, 并可提高试管薯的产量和大薯率。

在试管薯膨大期给试管苗一定的光照, 有利于提高试管薯大薯率, 但是, 早期的研究只是粗略地给出是否有光以及光照强弱的定性描述, 并未给出具体的光密度或者光密度范围。直至2010年, 马伟清等^[71]的试验发现, 80 μmol·m^-2·s^-1的光密度能提高马铃薯品种‘费乌瑞它’的大薯率, 20 μmol·m^-2·s^-1有利于马铃薯品种‘大西洋’的大薯率的提高。很显然, 适宜于提高大暑率的光密度因品种不同而有差异, 相关的研究还远远不够。马铃薯试管薯膨大与光合产物向试管薯中转运量相关, 光密度影响马铃薯试管苗光合产物转运及积累的生理机制, 目前还未见报道, 需要我们进一步探究。

3.2 光谱对马铃薯试管薯膨大的影响

光谱(波长)同样影响试管薯的膨大。用白光、单色红光、单色蓝光处理马铃薯试管苗, 在试管薯完成形态建成以后, 单色蓝光更利于试管薯的持续膨大^{[20, 45]}; 红光对试管薯的形态建成、持续膨大均有明显的抑制作用^[45]。这与Che等^[72]的研究结果一致, 红光能明显提高组培苗的生物量, 对试管苗的生长有促进效应; 蓝光下试管苗的生物量不高, 但其干物质量/生物量较高。

单色光谱条件下, 马铃薯试管苗的生长发育会受到限制, 这对后期提高试管薯膨大势必存在影响, 因此在单色光谱研究的基础上, 需进一步研究不同光谱组合对试管薯膨大的影响。马铃薯被诱导之后, 要确保马铃薯试管植株具有持续高效的光合作用, 并促使更多的光合产物转运到试管薯中, 才会促进诱导后的试管薯持续膨大, 收获高质量的试管薯。

4 展望

试管薯的诱导受多方面因素的影响, 光密度和光谱是其中重要的影响因子。光密度直接影响马铃薯试管苗光合作用, 从而影响光合产物的形成; 而在光形态建成过程中, 不同的光谱作为一种信号, 通过光受体激活一系列生理生化代谢过程, 最终影响试管薯的生长发育。因此组织培养条件下, 光密度和光谱可以被用来调控马铃薯组织或器官的生长发育。

光密度和光谱影响马铃薯试管薯形成与膨大的研究有了初步进展, 但相关研究还不够系统, 缺乏足够的关键数据支撑。试管薯产量与质量的提高与光合产物的形成、转运以及转化相关, 因此, 研究光密度与光谱如何影响马铃薯组培苗光合生长、光合产物向试管薯中的转运以及在试管薯中的转化, 并在此基础上揭示光密度与光谱影响试管薯诱导、光合产物转运与转化的机制, 将有助于提升马铃薯试管薯的产量与质量, 为马铃薯试管薯的规模化、工厂化生产应用提供理论和技术支持。