南京农业大学学报  2018, Vol. 41 Issue (1): 190-194   PDF    
http://dx.doi.org/10.7685/jnau.201703035
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文章信息

郭阳鑫, 卫志明, 佘跃辉, 朱木兰
GUO Yangxin, WEI Zhiming, SHE Yuehui, ZHU Mulan
大豆叶柄离体再生体系研究
Research on plantlet regeneration from petiole explants in soybean
南京农业大学学报, 2018, 41(1): 190-194
Journal of Nanjing Agricultural University, 2018, 41(1): 190-194.
http://dx.doi.org/10.7685/jnau.201703035

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收稿日期: 2017-03-24
引用本文
郭阳鑫, 卫志明, 佘跃辉, 等. 大豆叶柄离体再生体系研究[J]. 南京农业大学学报, 2018, 41(1): 190-194.
GUO Yangxin, WEI Zhiming, SHE Yuehui, et al. Research on plantlet regeneration from petiole explants in soybean[J]. Journal of Nanjing Agricultural University, 2018, 41(1): 190-194.  DOI: 10.7685/jnau.201703035
大豆叶柄离体再生体系研究
郭阳鑫1,2,3 , 卫志明2 , 佘跃辉1 , 朱木兰2,3     
1. 四川农业大学农学院, 四川 成都 611130;
2. 中国科学院上海生命科学研究院植物生理生态研究所, 上海 200032;
3. 中国科学院上海辰山植物科学研究中心, 上海 201602
收稿日期：2017-03-24
基金项目：四川省农业科技成果转化资金项目（16NZ0068）；国家转基因生物新品种培育重大专项（2016ZX08004003）
作者简介：郭阳鑫, 硕士研究生
通信作者：佘跃辉, 教授, 主要从事豆类作物的育种工作, E-mail:228288216@qq.com; 朱木兰, 研究员, 主要从事植物分子遗传研究, E-mail:mlzhu@sippe.ac.cn.
摘要：[目的]建立大豆叶柄外植体的离体再生体系，为大豆遗传转化体系的改进和提高提供技术基础。[方法]以大豆品种‘K06-82’无菌苗叶柄为外植体，比较不同种类的植物生长调节剂及其组合对叶柄愈伤组织诱导、不定芽分化、不定芽伸长及生根等过程的影响，建立大豆叶柄离体再生体系。[结果]大豆品种‘K06-82’的叶柄愈伤组织形成的适宜培养基为改良MS+2.0 mg·L-1α-萘乙酸（NAA），愈伤组织形成率为74.21%，愈伤组织密度为0.72 g·cm-3；不定芽分化的适宜培养基为改良MS+2.0 mg·L-16-苄氨基嘌呤（6-BA）+0.2 mg·L-1 NAA，分化率为49.82%，平均不定芽数2.98个；不定芽伸长的适宜培养基为改良MS+1.0 mg·L-1赤霉素（GA3），伸长比率为35.62%，平均芽长为2.01 cm；不定根诱导的最适培养基为1/2改良MS+0.8 mg·L-1吲哚丁酸（IBA），生根率和生根苗的移栽存活率分别达到88.32%和97.80%。[结论]初步建立了大豆叶柄外植体的离体再生体系。
关键词：大豆   叶柄   再生体系   
Research on plantlet regeneration from petiole explants in soybean
GUO Yangxin1,2,3, WEI Zhiming2, SHE Yuehui1 , ZHU Mulan2,3    
1. College of Agronomy, Sichuan Agricultural University, Chengdu 611130, China;
2. Institute of Plant Physiology and Ecology, Shanghai Institutes for Biological Sciences, Chinese Academy of Sciences, Shanghai 200032, China;
3. Chenshan Botanical Science Research Center, Chinese Academy of Sciences, Shanghai 201602, China
Abstract: [Objectives] The purpose of this research is to establish the plantlet regeneration system in soybean. [Methods] By using the aseptic seedling petioles of soybean variety 'K06-82' as explants, the effects of different plant growth regulators and their combinations on callus induction and adventitious bud differentiation, adventitious bud elongation and rooting process were compared to establish the regeneration system for soybean stalk in vitro. [Results] The results showed that the suitable medium for callus formation from soybean 'K06-82' petiole explants was modified MS+2.0 mg·L-1α-naphthylacetic acid (NAA), on which the callus formation rate was 74.21%, and the density of callus was 0.72 g·cm-3. The optimal medium for the adventitious buds differentiation was modified MS+2.0 mg·L-1 6-benzylamino purine (6-BA) +0.2 mg·L-1 NAA, giving a differentiation frequency of 49.82% and an average number of adventitious buds 2.98. The suitable medium for adventitious bud elongation was modified MS+1.0 mg·L-1gibberellin (GA3). The elongation efficiency was about 35.62%, and the average shoot length was 1.01 cm. Half strength modified MS medium supplemented with 0.8 mg·L-1indole butyric acid (IBA) was the suitable medium for inducing adventitious roots, producing a rooting percentage of 88.32% and a seedling transplanting survival rate of 97.80%. [Conclusions] In this study, the in vitro culture and plantlet regeneration system for soybean petiole explants are established, which will provide the theoretical and technical basis for the establishment of a more perfect soybean genetic transformation system.
Key words: soybean    petiole    regeneration system   

随着大豆全基因组测序工作的完成和基因编辑技术的蓬勃发展, 遗传转化技术为大豆新种质资源的创制提供了快捷而有效的途径, 因此, 大豆遗传转化体系的构建十分必要。目前, 大豆成熟胚胚尖再生体系和子叶节再生体系已日益完善。张艳等[1]以‘黑农41’的子叶节和成熟胚胚尖为外植体进行再生体系研究发现, 在含1.0 mg·L-1 6-BA的培养基上, 子叶节不定芽分化率达到94.5%, 平均芽8.67个; 在含0.2 mg·L-1 6-BA培养基上, 胚尖的不定芽分化率为85.7%, 平均芽数4.22个。林树柱等[2]的研究结果表明, 1.1 mg·L-1 6-BA可以使‘合丰35’子叶节再生率达到98%, 平均芽数为3.56个; 3.5 mg·L-1 6-BA可以使芽再生率达到92.5%, 平均芽数为2.78个。尽管这2个再生体系均有较高的再生效率, 但是在利用根癌农杆菌介导法进行遗传转化时, 以大豆成熟胚胚尖[3-8]和子叶节[9]为受体的转化体系仍存在3个不足之处, 即假阳性率高、存在嵌合体现象和转化效率较低。可见, 探讨全新的大豆遗传转化体系势在必行。而可靠的遗传转化体系依赖于高效的离体再生系统。目前采用大豆叶柄作为外植体进行离体再生尚未见报道, 因此, 本课题组开展了大豆叶柄的离体培养和植株再生条件研究, 以期为建立全新的大豆遗传转化体系提供技术基础。

1 材料与方法 1.1 试验材料

供试材料为中国科学院遗传研究所朱保葛研究员提供的大豆品种‘K06-82’。

1.2 试验方法 1.2.1 培养基及培养条件

本试验所需基本培养基为改良MS培养基(MS培养基的无机营养和B5培养基的有机营养)、30 g·L-1蔗糖、7.0 g·L-1琼脂、0.1 g·L-1肌醇, pH5.8。培养温度为(25±2) ℃, 光照度2 500~3 000 lx, 光/暗周期为8 h/16 h。

1.2.2 外植体的取材

大豆无菌胚接种于改良MS培养基+3.0 mg·L-1 6-BA, 15 d后待真叶长出时, 切除部分真叶、下胚轴及顶芽部分, 获得1.0 cm左右的叶柄作为起始外植体, 进行后续研究。

1.2.3 愈伤组织的诱导

将叶柄分别接种于添加0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0 mg·L-1 NAA的基本培养基上, 同时加入0.5 mg·L-1脯氨酸进行愈伤组织诱导。每2周继代1次。愈伤组织诱导光照度为1 250~1 500 lx。2周内统计愈伤组织启动时间(d); 6周后统计愈伤组织形成率和愈伤组织质地(愈伤组织密度)。

愈伤组织形成率=形成愈伤组织的叶柄数/接种的叶柄外植体总数×100%;

愈伤组织密度=50块愈伤组织的鲜质量(g)/50块愈伤组织的体积(cm3)。

愈伤组织体积的测量方法为:每一批取50块愈伤组织浸入到200 mL的无菌水中, 溢出水的体积即为50块愈伤组织的体积。

1.2.4 不定芽的分化

将愈伤组织转接到改良MS+0.5 mg·L-1 6-BA+0.05 mg·L-1 NAA(A), 改良MS+1.0 mg·L-1 6-BA+0.10 mg·L-1 NAA(B), 改良MS+1.5 mg·L-1 6-BA+0.15 mg·L-1 NAA(C), 改良MS+2.0 mg·L-1 6-BA+0.20 mg·L-1 NAA(D), 改良MS+2.5 mg·L-1 6-BA+0.25 mg·L-1 NAA(E), 改良MS+3.0 mg·L-1 6-BA+0.30 mg·L-1 NAA(F)的培养基上进行不定芽分化, 探索生长调节剂组合对不定芽分化率和平均不定芽数的影响。4周后统计不定芽分化率和平均不定芽数。

不定芽的分化率=分化出不定芽的愈伤组织数/接种愈伤组织总数×100%。

1.2.5 不定芽的伸长

将不定芽连同部分愈伤组织分别转接到含0.5、1.0、1.5、2.0、2.5和3.0 mg·L-1 GA3的改良MS培养基上, 比较不同浓度GA3对不定芽伸长的影响。3周后记录不定芽的伸长率和平均芽长。

不定芽伸长率=伸长的芽苗数/芽苗总数×100%。

1.2.6 不定根的诱导

待芽苗伸长至1~2 cm左右后, 分别转接到附含1.0 mg·L-1IBA的1/8改良MS、1/4改良MS、1/2改良MS和改良MS培养基上, 比较基本培养基中MS无机盐浓度对不定根诱导的影响; 2周后分别统计不定根形成率和平均根数; 为探索IBA对不定根形成的影响, 再将伸长芽苗分别转接至含0、0.5、0.8、1.0、1.2和1.5 mg·L-1IBA的最适基本培养基上, 2周后统计芽苗的生根率。

生根率=形成不定根的苗数/总接种的苗数×100%。

1.2.7 炼苗与移栽

待大豆苗长出发达的根系后, 去掉瓶盖, 在培养瓶中加入少量的蒸馏水, 放置于培养室, 3 d后取出大豆苗并洗去根部的培养基, 移栽至装有混合土(营养土和基质的体积比为3:1)的花盆中, 置于温室中, 定时浇水, 保持土壤湿润, 1周后统计生根苗的移栽存活率。

移栽存活率=存活的植株数/移栽的生根苗总数×100%。

2 结果与分析 2.1 不同质量浓度NAA对大豆叶柄愈伤组织形成的影响

将放大的叶柄切除部分叶片(图 1-A)接种在含不同质量浓度的NAA的培养基上, 一定时间后开始统计叶柄愈伤组织的形成情况。由表 1可见:随NAA质量浓度的增加, 大豆品种‘K06-82’叶柄愈伤组织的启动时间和形成率均逐渐提高; 当NAA为2.0 mg·L-1时, 愈伤组织的密度达到最大值, 为0.72 g·cm-3, 愈伤组织较为致密(图 1-B), 后续培养可以分化出不定芽。因此, 2.0 mg·L-1的NAA为大豆叶柄愈伤组织诱导的适宜浓度。

表 1 不同质量浓度NAA对大豆品种‘K06-82’叶柄愈伤组织形成的影响 Table 1 Effects of different concentration of NAA on petiole callus formation in soybean'K06-82'
ρ(NAA)/(mg·L-1)启动时间/d Start time愈伤组织形成率/% Rate of callus formation愈伤组织密度/(g·cm-3)Callus density
015.5±1.1a1.68±0.58h0.28±0.05g
0.515.2±0.5b25.41±3.22g0.42±0.04f
1.013.5±0.6c42.38±1.94f0.60±0.04cd
1.59.6±1.0d68.79±2.15e0.64±0.04bc
2.07.2±0.7e74.21±0.81d0.72±0.03a
2.56.9±0.8f82.72±2.24c0.65±0.04b
3.06.1±0.7fg88.32±1.71bc0.61±0.03c
3.55.8±0.6g92.39±2.73b0.59±0.03d
4.04.8±0.8h94.16±1.25a0.52±0.03e
注:同列不同字母表示在0.05水平差异显著。下同。The different letters in the same column mean significant difference at 0.05 level. The same as follows.
表选项
图 1 大豆品种‘K06-82’叶柄离体再生过程 Figure 1 The in vitro plantlet regeneration from petiole explants in soybean'K06-82' A.培养7 d左右的大豆幼胚; B.带叶柄的愈伤组织; C.叶柄来源愈伤组织的不定芽; D.伸长的芽苗; E.生根的小植株; F.移栽存活的大豆植株。 A.Cultivate immature embryos of soybean around 7 d; B.Callus with petiole; C.Adventitious bud of callus derived from petiole; D.Elongated shoots; E:Rooting plant; F.Transplant survived soybean plants.
图选项
2.2 不同植物生长调节剂组合对大豆叶柄愈伤组织不定芽分化的影响

将生长60 d的叶柄愈伤组织转接到不定芽分化培养基上, 10 d后可以看到愈伤组织上出现芽原基, 20 d后芽原基逐渐分化成小苗, 30 d后转接到不定芽伸长培养基。由表 2可知:‘K06-82’愈伤组织在改良MS+2.0 mg·L-1 6-BA+0.2 mg·L-1 NAA培养基上的不定芽分化率较高, 为49.82%, 平均不定芽数为2.98个, 与其他组合处理差异均显著(P < 0.05), 且芽苗生长状态健康(图 1-C)。

表 2 不同生长调节剂组合对‘K06-82’大豆愈伤组织不定芽分化的影响 Table 2 Effects of different combination of plant growth regulator on adventitious bud induction in soybean'K06-82'
不同生长调节剂组合Combination of hormones不定芽分化率/% Differentiation rate of adventitious bud不定芽数No. of adventitious buds per explant
改良MS+0.5 mg·L-1 6-BA+0.05 mg·L-1 NAA39.62±2.04f1.89±0.43e
改良MS+1.0 mg·L-1 6-BA+0.10 mg·L-1 NAA41.24±2.12e2.14±0.23d
改良MS+1.5 mg·L-1 6-BA+0.15 mg·L-1 NAA44.13±1.41d2.81±0.12c
改良MS+2.0 mg·L-1 6-BA+0.20 mg·L-1 NAA49.82±1.33a2.98±0.11a
改良MS+2.5 mg·L-1 6-BA+0.25 mg·L-1 NAA47.32±1.37b2.95±0.07ab
改良MS+3.0 mg·L-1 6-BA+0.30 mg·L-1 NAA45.29±1.90c2.89±0.10b
表选项
2.3 GA3对芽苗伸长的影响

由表 3可见:当GA3的质量浓度为1.0 mg·L-1时, ‘K06-82’的不定芽伸长率显著高于其他处理(P < 0.05), 为35.62%。平均芽长随着GA3浓度增加而增加, 但是低浓度GA3(0~1.0 mg·L-1)培养的芽苗茎杆较为粗壮, 叶片紧凑; 高浓度GA3(1.5~2.5 mg·L-1)培养的芽苗逐渐产生徒长、畸形现象, 即芽苗较为纤细、节间长、叶片稀疏, 后期芽苗生根较困难。因此, 1.0 mg·L-1的GA3为芽苗伸长的适宜浓度(图 1-D)。

表 3 不同质量浓度GA3对‘K06-82’芽苗伸长生长的影响 Table 3 Effects of different concentration of GA3on bud length in soybean'K06-82'
ρ(GA3)/
(mg·L-1)		不定芽伸长率/%
Rate of elongated adventitious bud		平均芽长/cm
Mean length of adventitious bud
033.14±1.49de0.88±0.11e
0.534.21±0.12d1.98±0.44d
1.035.62±1.05a2.01±0.13cd
1.535.18±0.80bc2.31±0.22c
2.034.39±0.55c2.97±0.29ab
2.532.75±2.26e3.05±0.23a
表选项
2.4 基本培养基中无机盐浓度和IBA浓度对无菌苗不定根诱导的影响

由表 4可知:随着培养基中无机盐浓度的降低, 无菌苗生根率和平均根数逐步提高, 但移栽存活率却降低。而在1/2改良MS时, 尽管芽苗的生根率和平均根数分别为82.70%和3.15个, 但移栽成活率可达92.45%。因此, 1/2改良MS培养基所诱导生根苗存活率较高(图 1-E)。

表 4 基本培养基对大豆品种‘K06-82’无菌苗生根的影响 Table 4 Effects of basal medium on rooting of plantlets in soybean'K06-82'
基本培养基
Basal medium		平均根数
Average number of roots		生根率/%
Rooting rate		移栽存活率/%
Survival rate
改良MS Improved MS2.42±0.11d78.01±3.15d95.50±1.50a
1/2改良MS 1/2 improved MS3.15±0.18c82.70±2.40c92.44±2.70b
1/4改良MS 1/4 improved MS3.34±0.18b88.30±1.90b83.66±2.78c
1/8改良MS 1/8 improved MS3.66±0.22a90.21±1.72a75.42±1.84d
表选项

由表 5可见:在1/2改良MS培养基中IBA质量浓度为0.8 mg·L-1时, 生根率和移栽成活率均达到最大值, 分别为88.32%和97.80%, 诱导出的根较为健壮, 且侧根较多, 植株生长健壮(图 1-F)。因此, 大豆叶柄所分化的不定芽生根适宜培养基条件为1/2改良MS培养基添加0.8 mg·L-1IBA。

表 5 不同质量浓度IBA对大豆‘K06-82’无菌苗生根的影响 Table 5 Effects of different concentration of IBA on rooting of plantlet in soybean'K06-82'
ρ(IBA)/(mg·L-1)生根率/%
Rooting rate		移栽存活率/%
Survival rate
041.02±2.50f71.02±2.41f
0.573.67±1.92e83.65±0.92c
0.888.32±1.14a97.80±1.21a
1.082.41±2.12b92.38±1.67b
1.280.67±1.35c80.65±1.36d
1.576.70±2.07d78.42±2.61e
表选项
3 讨论

起始外植体材料是影响植物离体再生的重要因素。外植体再生能力与外植体的取材部位、切割方法、外植体的年龄以及材料的极性等因素相关[10]。外植体材料需具有大量再生能力强的细胞群存在, 才能在生长调节剂的诱导下脱分化。杜丽等[11]以大白菜的叶柄为外植体, 采用直接器官发生途径进行植株再生, 在2.5 mg·L-1 BA和0.3 mg·L-1IBA的作用下, 其叶柄不定芽分化率达到42.7%。杨玉萍等[12]以紫锥菊叶柄为外植体采用不定芽直接发生进行植株再生, 在0.5 mg·L-1 6-BA作用下, 其不定芽发生率达到94.8%。本研究以生长15 d的大豆真叶叶柄为外植体, 通过离体培养获得了再生植株, 其再生效率达到49.82%, 此时期的叶柄具有较强的分生能力, 较易诱导丛生芽。

植物生长调节剂是植物离体再生的重要因素。在大豆的组织培养中, 已有报道认为单独使用一定浓度的细胞分裂素6-BA可以获得较高的不定芽分化率, 增加不定芽数[1-2]。而钟灿等[13]研究结果表明, 1.0 mg·L-1 6-BA和0.1 mg·L-1 NAA条件下, 菜豆品种‘交大05-33’胚尖再生率最高。李文霞等[14]以‘黑农35’的子叶节为材料进行丛生芽诱导, 认为1.7 mg·L-1 6-BA为该品种子叶节丛生芽诱导的适宜浓度。赖冰冰等[15]认为增加6-BA的浓度可以提高不定芽的数量, 在添加4.0 mg·L-1 6-BA和0.05 mg·L-1 IBA后, 其不定芽分化率达到最大值, 同时保留半片子叶可以使不定芽的诱导率达到最大。本试验发现, 2.0 mg·L-1 6-BA和0.2 mg·L-1 NAA可以使大豆品种‘K06-82’叶柄愈伤组织不定芽分化率达到最高。以上结果表明植物生长调节剂的种类、浓度及作物的种类和基因型均是影响外植体再生的重要因素。

目前比较成熟的大豆遗传转化体系主要有胚尖转化体系[4]和子叶节转化体系[16]。胚尖转化体系中胚尖作为转化受体材料时, 因存在定芽而具有较高的假阳性率, 降低了转化效率[3-5]; 子叶节转化体系中, 采用子叶节为受体材料, 嵌合体的存在影响了转化率的提高[17]。大豆叶柄作为一种全新的受体材料进行转基因时, 既无胚尖系统的定芽缺陷, 又无子叶节系统的嵌合体, 可广泛用于大豆的基因工程研究。因此, 以大豆叶柄作为遗传转化的受体材料有望成为大豆全新的遗传转化受体系统。

中国科学院遗传研究所所朱保葛老师研究组提供大豆试验材料‘K06-82’, 谨致谢意。

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