文章信息
- 黄月月, 赵霞, 王磊, 代兴杨, 阮祥春, 李琳, 曾明华
- HUANG Yueyue, ZHAO Xia, WANG Lei, DAI Xingyang, RUAN Xiangchun, LI Lin, ZENG Minghua
- 6株鸡柔嫩艾美耳球虫Cytb基因突变及其抗癸氧喹酯药物的差异分析
- Analysis of Cytb gene mutations of 6 strains of Eimeria tenella and the difference of anti-decoquinate drug
- 南京农业大学学报, 2017, 40(3): 509-513
- Journal of Nanjing Agricultural University, 2017, 40(3): 509-513.
- http://dx.doi.org/10.7685/jnau.201605042
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文章历史
- 收稿日期: 2016-05-28
鸡球虫病是由艾美耳球虫寄生于肠道引起的一种危害极其严重的全球性寄生虫病, 给养鸡业造成了巨大的经济损失[1]。目前控制球虫病很大程度上还是依赖于化学合成药物, 但是随着药物的广泛使用, 球虫几乎对所有使用过的抗球虫药都产生了一定程度的耐药。耐药性的出现使得现有药物疗效下降甚至完全失效, 尤其是多重耐药性的出现更是给鸡球虫病的药物防治出了难题[2]。据报道, 全世界用于抗球虫的药费高达5亿多美元[3], 我国每年用于防治鸡球虫病的药费达2千多万美元[4]。
各国科学家对球虫耐药性进行了大量的调查研究, 但是确切的机制还不清楚。Jeffers[5]提出, 耐药性的产生是因为虫体内的基因发生了突变。生物体之所以能表现出各种各样的特性, 其原因之一是由于其内部基因差异表达所致, 一种或几种基因的同时突变是耐药的分子基础。
癸氧喹酯(decoquinate)属于喹啉类抗球虫药, 近年来被迅速推广应用, 临床用药显示效果良好[6], 但其耐药性问题国外已有报道[7]。喹啉类抗球虫药作用机制是破坏球虫线粒体内细胞色素体系的电子运输而抑制线粒体的呼吸作用。已经表明其作为位点为细胞色素b[8]。细胞色素b是细胞色素bc1复合体的一部分, 位于线粒体内膜, 是线粒体电子呼吸链的中心元素[9]。
在顶复门原虫中, 发现了细胞色素b基因(Cytb)的碱基突变与Cytbc1呼吸抑制剂抗药性的产生有密切关系, 有研究证实了Cytb基因第268位点的突变导致了阿托伐醌抗药性的产生[10]。
为了探讨柔嫩艾美耳球虫抗药株的产生是否与Cytb基因的突变有关, 本试验根据NCBI已发表的柔嫩艾美耳球虫(Eimeria tenella)Cytb基因序列设计引物, 对柔嫩艾美耳球虫野外分离株的孢子化卵囊Cytb基因进行克隆及测序, 以分析6个野外分离株与敏感株Cytb基因之间的差异及其耐药性的关系。
1 材料与方法 1.1 试验材料 1.1.1 试验虫株和县株(EtHX)、舒城株(EtSC)、肥东株(EtFD)、庐江株(EtLJ)、凤台株(EtFT)和全椒株(EtQJ)分别从安徽6个县收集来, 用单卵囊分离技术[11]获得柔嫩艾美耳球虫纯种, 进行纯种的鉴定并提取DNA[12-13];柔嫩艾美耳球虫敏感株(EtMG)由南京农业大学药理实验室赠送。
1.1.2 试验动物和药物1日龄罗曼蛋鸡购自长丰安禽公司。接雏前对饲养用的动物房、笼具、饮水等均严格消毒, 保证无球虫环境下饲养; 癸氧喹酯购自安徽华澳生物技术有限公司(批号20150501)。
1.1.3 主要试剂和菌株总DNA提取试剂盒购自Omega公司; 普通琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒、2×Taq PCR MasterMix均购自TIANGEN公司; pMD18-T载体购自大连宝生物(TaKaRa)工程有限公司; 大肠杆菌DH5α由安徽农业大学药理实验室保存。
1.2 试验方法 1.2.1 鸡体内试验法检测耐药性选择150只12日龄雏鸡, 随机分成15组, 每组10只, 检测柔嫩艾美耳球虫各株对癸氧喹酯(30 mg · kg-1)的抗药性。每株球虫均设1个感染用药组、1个感染不用药组, 另外设1个不感染不用药组。参照文献[14]的判定指标和方法:最适抗球虫活性百分率(POAA)、病变记分减少率(RLS)、相对卵囊产量(ROP)、抗球虫指数(ACI), 按POAA、RLS、ROP、ACI 4个指标中出现阳性指数的数量确定以下4个耐药等级:敏感、轻度耐药、中度耐药、重度耐药, 并以此综合判定7株球虫对癸氧喹酯的抗药性。
1.2.2 引物设计与合成参照GenBank中报道的Cytb基因组序列(登录号:HQ702484.1) 设计引物, 目的片段长度为1 100 bp。上/下游引物为:5′-AGTGAGATCTCACCTACAATC-3′/5′-GATTACGGTAAAGAATCTACC-3′。引物由通用生物系统(安徽)有限公司合成。
1.2.3 柔嫩艾美耳球虫孢子化卵囊总DNA的提取取纯化后的柔嫩艾美耳球虫1×107孢子化卵囊加玻璃珠涡旋振荡, 直至90%的卵囊壁破裂释放孢子囊, 用DNA提取试剂盒提取总DNA。紫外分光光度计测定D值, 确定DNA纯度及含量后样品置-20 ℃保存备用。
1.2.4 PCR扩增及产物回收反应体系为50 μL, 即2×Taq PCR MasterMix 25 μL, 上、下游引物各1 μL, DNA模板2 μL, 加ddH2O至50 μL。PCR反应条件:94 ℃5 min; 94 ℃30 s, 54.5 ℃退火30 s, 72 ℃延伸1 min, 共35个循环; 最后72 ℃再延伸5 min。PCR产物经电泳检测后, 参照DNA凝胶回收试剂盒说明书进行胶回收及纯化。
1.2.5 Cytb基因的克隆及序列测定取纯化的PCR产物与pMD18-T载体4 ℃连接过夜, 转化DH5α感受态细胞, 涂布在含有氨苄青霉素的固体培养基上, 于37 ℃培养过夜。从平板上随机挑取白色单菌落, 接种于5 mL含氨苄青霉素的LB液体培养基中, 37 ℃振荡培养12 h。用培养后的菌液作模板, 扩增体系和反应程序同1.2.4节。PCR产物经电泳检测, 阳性菌液送通用生物系统(安徽)有限公司进行测序。获得序列后登录美国国立生物信息网(http:/www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/bl2seq/wblast2.cgi), 将其与已有的Cytb基因序列进行比较。将每株的Cytb基因突变记录下来, 用DNAstar软件将核苷酸序列翻译成氨基酸序列, 比较分离株与敏感株的差别。
2 结果与分析 2.1 7株柔嫩艾美耳球虫对癸氧喹酯的抗药性鸡体内试验法结果显示(表 1):鸡感染孢子化卵囊后第4天, 各药物组和感染不用药组鸡均出现不同程度的精神沉郁, 食欲减退及血便现象, 第5、6天更为严重, 直至第7天时血便减少。死亡鸡剖检均见盲肠明显肿大, 内有出血或血凝块, 其他脏器未观察到病变。空白对照组鸡无血粪, 采食、饮水正常, 且未发现球虫卵囊。由表 1看出, 从安徽6个县收集来的柔嫩艾美耳球虫对癸氧喹酯有不同程度的耐药性, 根据POAA、RLS、ROP和ACI 4项指标综合判断, 和县株和凤台株耐药最严重, 全椒株和舒城株轻微耐药, 而敏感株对癸氧喹酯敏感, 说明敏感株没有产生耐药性。
| 株系 Strains |
最适抗球虫活性率/% POAA |
病变记分减少率/% RLS |
相对卵囊产量/% ROP |
抗球虫指数 ACI |
抗药性结果 Resistant result |
| EtHX | 41.18(+) | 41.18(+) | 70.37(+) | 107.54(+) | 完全耐药Complete resistance |
| EtFT | 48.37(+) | 49.33(+) | 50.94(+) | 126.61(+) | 完全耐药Complete resistance |
| EtQJ | 95.12(-) | 31.37(+) | 7.17(-) | 161.41(-) | 轻微耐药Slight resistance |
| EtSC | 89.69(-) | 41.18(+) | 3.83(-) | 164.01(-) | 轻微耐药Slight resistance |
| EtLJ | 61.42(-) | 64.29(-) | 38.81(+) | 132.80(+) | 中度耐药Moderately resistant |
| EtFD | 50.98(-) | 50.98(-) | 14.22(-) | 116.09(+) | 轻微耐药Slight resistance |
| EtMG | 96.33(-) | 74.29(-) | 1.81(-) | 180.01(-) | 敏感Sensitive |
| 注: 1) POAA:Percent of optimum anticoccidial activity; RLS:Reduction of lesion scores; ROP:Relative oocyst production; ACI:Anticoccidial index。2) EtHX:和县株Hexian strain; EtFT:凤台株Fengtai strain; EtQJ:全椒株Quanjiao strain; EtSC:舒城株Shucheng strain; EtLJ:庐江株Lujiang strain; EtFD:肥东株Feidong strain; EtMG:敏感株Sensitive strain。3)+:阳性Postive; -:阴性Negative. | |||||
孢子化卵囊的总DNA经检测, D260/D280=1.9, 满足试验需要。PCR扩增产物于10 g · L-1的琼脂糖凝胶中进行电泳, 在紫外照射下可见1 100 bp左右的亮带(图 1), 与预期目的片段长度相符。扩增产物经回收、纯化后于10 g · L-1的琼脂糖凝胶电泳, 可见单一条带。
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图 1 PCR扩增产物电泳图 Figure 1 Gel electrophoresis of PCR product M:DNA marker(DL2000);1~7:分别为EtHX、EtFT、EtQJ、EtSC、EtLJ、EtFD和EtMG株孢子化卵囊Cytb的PCR扩增产物。PCR product of Cytb of sporulated oocysts of EtHX, EtFT, EtQJ, EtSC, EtLJ, EtFD and EtMG, respectively. |
将纯化的PCR产物与pMD18-T载体连接, 并转化DH5α宿主菌。在有氨苄抗性的平板上进行阳性克隆的初筛选, 摇菌扩增后进行PCR鉴定, 结果显示出现大小约1 100 bp的特异条带(图 2), 表明Cytb基因已成功连接至T载体。
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图 2 重组质粒的PCR鉴定 Figure 2 PCR identification of recombinant plasmid M:DNA marker(DL2000);1~7:分别为EtHX、EtFT、EtQJ、EtSC、EtLJ、EtFD和EtMG株孢子化卵囊Cytb的PCR扩增产物。PCR product of Cytb of sporulated oocysts of EtHX, EtFT, EtQJ, EtSC, EtLJ, EtFD and EtMG, respectively. |
各株测序结果与敏感株相似性均达到99%以上。敏感株与NCBI(登录号:HQ702484.1) 的标准株相似性达到了100%, 说明Cytb基因高度保守。将每株球虫的Cytb突变进行统计, 比较野外分离株与敏感株差别, 结果显示(表 2):6个分离株中Cytb基因突变类型多样, 主要表现为T→C、T→A、A→G的突变, 其中以T→A的突变最为明显。其中有些碱基突变引起了氨基酸的改变。敏感株的碱基序列与NCBI标准株比对无任何碱基的改变, 说明Cytb基因相对保守。和县株和凤台株对癸氧喹酯耐药最严重, Cytb基因突变位点相对较多, 说明耐药程度越大, 突变位点越多。
| 株系 Strains |
变异率/% Mutation rate |
突变位点 Mutation site |
氨基酸变化 Amino acid changes |
| EtHX | 0.29 | 377:G→T; 990:A→G; 1045:T→A | 126:W→L色氨酸→亮氨酸 |
| EtFT | 0.38 | 33:T→C; 900:A→G; 939:T→C; 1045:T→A | 300:I→M异亮氨酸→甲硫氨酸; 314:S→P丝氨酸→脯氨酸 |
| EtQJ | 0.29 | 74:T→G; 792:T→C; 1045:T→A | 25:F→C苯丙氨酸→半胱氨酸 |
| EtSC | 0.19 | 391:T→C; 1045:T→A | 131:F→L苯丙氨酸→亮氨酸 |
| EtLJ | 0.29 | 277:G→A; 673:C→A; 1045:T→A | 93:V→I缬氨酸→异亮氨酸; 225:L→I亮氨酸→异亮氨酸 |
| EtFD | 0.29 | 720:T→C; 904:T→C; 1045:T→A | 无 |
| EtMG | 0 |
喹啉类抗球虫药对鸡的所有球虫均有良效, 但极易产生耐药性。癸氧喹酯作为现有的一种高效低毒广谱的抗球虫药, 具广阔的市场前景[15]。然而, 已不断有癸氧喹酯疗效出现下降的报道, 癸氧喹酯的耐药问题不容忽视[16]。目前, 鸡球虫对癸氧喹酯抗球虫药的耐药机制尚不明确, 有研究报道鸡球虫对喹啉类药敏感性下降主要是由于原虫对药物产生了抗药性, 并且Cytb基因变异在耐药株中高于非耐药株[17-18]。
Korsinczky等[19]报道恶性疟原虫Cytb基因点突变与对阿托伐醌产生耐药相关; Schwobel等[10]发现恶性疟原虫阿托伐醌抗药株第268位点碱基发生突变(TAT→TCT), 导致酪氨酸变为丝氨酸(Y→S)。Cytb基因第268位点的突变导致了阿托伐醌抗药性的产生, 并以Cytb基因第268位点的多态性为抗药性标记, 建立了快速诊断恶性疟原虫阿托伐醌抗药性的新方法[10]。McFadden等[20]收集实验室诱导和临床分离的野生型的抗阿托伐醌虫株, 并将这些虫株的Cytb基因进行克隆测序, 发现它们的抗药性突变为M129L和I254L, 这些突变都位于细胞色素bc1复合物与辅酶Q的结合位点, 突变导致氨基酸脂肪酸侧链的改变和分子间作用力, 影响了阿托伐醌与辅酶Q的竞争性抑制。本试验结果表明:这些分离株对癸氧喹酯都有不同程度的耐药, 耐药株Cytb基因的突变明显高于敏感株, 推测突变的增加可能与球虫耐药有关。本结果中突变类型主要表现为T→C、T→A、A→G, 其中以T→A最为明显。这些突变位点引起了Cytb蛋白二级结构的改变。耐药性最严重的和县株377位点由G突变成了T, 二级结构发生了改变, 还有舒城株T391C的改变也引起了二级结构的改变。这些突变可能会影响基因的功能, 导致蛋白质中相应位置氨基酸的改变, 所以可以推测这些位点与球虫抗药性相关, 并有待进一步证实。同时经过预测, 庐江株、全椒株和舒城株形成的Cytb蛋白结构不稳定, 而敏感株以及耐药性严重的和县株和凤台株形成稳定的蛋白结构。在其他顶复门原虫中, 发现了细胞色素b基因的碱基突变与Cytbc1呼吸抑制剂抗药性的产生有密切关系。据了解, 本次收集卵囊的地区都曾使用过喹啉类抗球虫药物, 所以都出现了不同程度的耐药性。
Dasgupta等[21]报道了Cytb基因突变可能会对线粒体的氧化过程产生显著影响。突变的后果在于突变位置对蛋白质功能影响的程度, 具体基因突变与氨基酸改变之间的关系, 突变引起耐药的可能机制还有待深入研究。本试验结果说明Cytb基因的突变可能与球虫对癸氧喹酯抗球虫药的耐药有关。此结果为癸氧喹酯耐药株的鉴定提供依据, 并为其耐药性产生机制的研究提供了试验数据和方向。
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