文章信息
- 朱敏, 王泊婷, 黄莹, 李佳, 陶小荣
- ZHU Min, WANG Boting, HUANG Ying, LI Jia, TAO Xiaorong
- 云南天竺葵上发现番茄斑萎病毒
- Tomato spotted wilt virus was found as a pathogen of geranium (Pelargonium hortorum)in Yunnan Province
- 南京农业大学学报, 2017, 40(3): 450-456
- Journal of Nanjing Agricultural University, 2017, 40(3): 450-456.
- http://dx.doi.org/10.7685/jnau.201612021
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文章历史
- 收稿日期: 2016-12-13
番茄斑萎病毒(Tomato spotted wilt virus, TSWV)是布尼亚病毒科(Bunyaviridae)番茄斑萎病毒属(Tospovirus)的典型成员, 属于植物多分体负义链RNA病毒。TSWV寄主范围广, 可侵染84个科1 000多种植物[1], 由蓟马以持久性的方式传播[2-3], 在世界范围内造成巨大的经济损失, 在2011年列出的世界危害最大的10种病毒中名列第2[4]。感染TSWV的植物多为系统性侵染, 植株矮化, 叶片皱缩形成不对称生长, 有时叶片上可见褪绿、环斑、坏死环斑或不规则的坏死区, 严重时整个叶片甚至整个植株坏死呈萎蔫状[5-6]。TSWV病毒粒体呈近球形, 有包膜, 基因组为三分体单链RNA, 根据其分子量大小分别命名为L RNA、M RNA和S RNA[7]。L RNA长约9 kb, 通过负义链编码1个开放阅读框(open reading frame, ORF)即RdRp, 参与病毒的复制[8]。M RNA为双义RNA, 其正义链编码移动蛋白NSm, 负义链编码糖蛋白Gn和Gc[9-10]。S RNA也是双义RNA, 其正义链编码RNA沉默抑制子NSs, 负义链编码核衣壳蛋白N[8, 11]。
TSWV在非洲、欧洲、北美、加勒比海地区和澳大利亚大面积发生, 而其在亚洲各国和地区的分布并不广泛, 主要集中在中东地区和伊朗, 在日本、韩国和台湾的部分区域零星发生[12]。1997年我国首次报道了TSWV在云南烤烟和番茄上的发生, 调查后发现其在云南各烟区广泛分布。随后张仲凯等[13]又在云南的马铃薯、魔芋及康乃馨等多种作物上观察到了TSWV的侵染。2011年Hu等[14]首次报道了云南番茄上的TSWV分离物全序列并比较了其N基因与其他地区分离物的系统发育关系, 发现其与已报道的多个TSWV亚洲分离物系统进化关系最近, 为我国的TSWV研究工作奠定了基础。
天竺葵(Pelargonium hortorum)为牻牛儿苗科(Geraniaceae)多年生草本花卉, 其花色艳丽、花期长、产花量大且适应性强, 具有较高的观赏价值, 世界各地均有栽培, 特别在欧洲和北美的一些国家和地区大面积种植。由于天竺葵大多采用营养繁殖, 极易引起病毒病的流行, 所以天竺葵上的病毒病也比较严重。据报道, 天竺葵上已分离到23种病毒, 其中主要的病毒有12种[15-16]。法国、意大利、英国、哥伦比亚、希腊、美国和加拿大等国均有TSWV侵染天竺葵的报道, 感病植株多在叶片上产生褪绿斑和坏死枯斑等症状且生长缓慢、品质下降, 严重影响其观赏性[1, 16-19]。
2015年6月, 笔者在昆明市植物园中发现一些表现叶片褪绿和环斑症状的天竺葵, 怀疑其可能被番茄斑萎病毒属病毒侵染。于是采用血清学、生物学和分子生物学方法进行检测, 确定感染天竺葵的病原为TSWV, 这是我国天竺葵上TSWV的首次报道。
1 材料与方法 1.1 样品来源2016年6月在昆明市植物园中表现叶片褪绿和环斑症状的天竺葵叶片。
1.2 Dot-blot ELISA参照于翠等[20]报道的方法, 用本课题组制备的番茄斑萎病毒(TSWV)(兔抗, 30 000倍稀释)、凤仙花坏死斑病毒(Impatiens necrotic spot virus, INSV)(兔抗, 5 000倍稀释)和番茄环纹斑点病毒(Tomato zonate spot virus, TZSV)(兔抗, 5 000倍稀释)核衣壳蛋白N的抗体对待检样品进行Dot-blot ELISA检测。对照的设置:分别取感染3种病毒的本氏烟叶片匀浆为阳性对照; 取健康本氏烟叶片的匀浆为阴性对照。
1.3 汁液摩擦接种将采集的天竺葵叶片用磷酸缓冲液研磨至匀浆后接种至8周龄的本氏烟, 以用缓冲液接种植株为对照。接种后的本氏烟置于25 ℃的温室中培养, 并观察系统叶的症状。
1.4 叶片总RNA的提取、反转录PCR、序列克隆与测定参照天根公司Trizol法提取植物总RNA说明书提取接种7 d后的本氏烟系统叶总RNA。以总RNA为模板, 用Oligo(dT)(0.5 μg·μL-1)和随机六聚体引物(10 μmol·L-1)参照Promega公司反转录酶(M-MLV)使用说明书进行反转录得到cDNA。以cDNA为模板, 分别用扩增TSWV、INSV和TZSV N基因的特异性引物进行PCR。各检测引物的序列、退火温度、目的片段长度见表 1。PCR产物经10 g ·L-1琼脂糖凝胶电泳分析后, 切取目标条带, 经琼脂糖凝胶回收试剂盒回收纯化后克隆到pMD18-T载体。连接产物转化大肠杆菌DH5α菌株, 送阳性克隆测序获得序列。
| 目标病毒 Target virus |
引物名称 Primer name |
序列(5′→3′) Sequence |
目标片段长度/bp Target length |
| 番茄斑萎病毒Tomato spotted wilt virus(TSWV) | TSWV-F | ATGTCTAAGGTTAAGCTCAC | 777 |
| TSWV-R | TTAAGCAAGTTCTGCAAGTT | ||
| 番茄环纹斑点病毒Tomato zonate spot virus(TZSV) | TZSV-F | ATGTCTAACGTCCGGAGTTT | 837 |
| TZSV-R | TTAAAAAGACAGATCATTGC | ||
| 凤仙花坏死斑病毒Impatiens necrotic spot virus(INSV) | INSV-F | ATGAACAAAGCAAAGATTAC | 789 |
| INSV-R | TTAAATAGAGTCATTTTTCC |
利用NCBI网站(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)上的BLAST程序对TSWV N基因的序列进行比对分析, 根据核苷酸及相应氨基酸序列的相似性确定病毒的种类。利用Clustal W(http://www.genome.jp/tools/clustalw)进行序列的初步比对, 再用MEGA 7.0软件构建系统进化树。
2 结果与分析 2.1 Dot-blot ELISA初步检测天竺葵样品主要表现环斑症状, 怀疑可能为番茄斑萎病毒属病毒侵染所致。分别用针对TSWV、INSV和TZSV的核衣壳蛋白N的抗体采用Dot-blot ELISA进行检测。结果显示, 该样品与TSWV抗体反应呈阳性, 而与TZSV和INSV抗体反应均呈阴性(图 1)。以上结果说明该样品可能为TSWV侵染。
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图 1 天竺葵叶片的Dot-blot ELISA检测 Figure 1 Detection of sampled geranium leaves using Dot-blot ELISA 1.天竺葵样品; 2.TSWV阳性对照; 3.TZSV阳性对照; 4.INSV阳性对照; 5.阴性对照 1.Sampled geranium leaves; 2.Nicotiana benthamiana leaves infected by TSWV; 3.N.benthamiana leaves infected by TZSV; 4.N.benthamiana leaves infected by INSV; 5:Healthy N.benthamiana leaves |
为进一步鉴定侵染天竺葵的病毒原, 将采集的叶片汁液摩擦接种到本氏烟并观察症状。结果显示:接种7 d后, 本氏烟系统叶出现花叶, 且叶片开始卷曲; 接种10 d后系统叶明显卷曲并出现小枯斑, 均为番茄斑萎病毒属病毒侵染本氏烟的典型症状, 而接种缓冲液的对照植株无任何异常症状(图 2)。
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图 2 天竺葵叶片汁液接种10 d后的本氏烟症状 Figure 2 Symptom of N.benthamiana inoculated by sampled geranium leaf extracts at 10 days post inoculation a.天竺葵叶片汁液接种10 d后的本氏烟植株及其系统叶; b.磷酸缓冲液模拟接种的本氏烟植株及其系统叶 a.The plant and systemic leaves of N.benthamiana inoculated by sampled geranium leaf extracts at 10 days post inoculation; b.The plant and systemic leaves of N.benthamiana inoculated by phosphate buffer |
取接种7 d后的本氏烟系统叶片再次进行Dot-blot ELISA检测, 得到的结果与直接用天竺葵叶片进行Dot-blot ELISA检测的结果类似, 即3个生物学重复均与TSWV抗体反应呈阳性, 与TZSV和INSV抗体反应呈阴性(图 3), 说明接种天竺葵汁液的本氏烟可能被TSWV侵染。
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图 3 接种天竺葵汁液的本氏烟系统叶的Dot-blot ELISA检测 Figure 3 Detection of systemic leaves of N.benthamiana inoculated by sampled geranium leaf extracts using Dot-blot ELISA 1~3.接种天竺葵汁液的本氏烟系统叶片; 4.TSWV阳性对照; 5.阴性对照 1-3.Systemic leaves of N.benthamiana inoculated by sampled geranium leaf extracts; 4.N.benthamiana leaves infected by TSWV; 5.Healthy N.benthamiana leaves |
提取接种7 d后的本氏烟系统叶的总RNA, 反转录得到cDNA。以cDNA为模板, 分别用扩增TSWV、INSV和TZSV N基因的特异性引物进行PCR检测。结果(图 4)显示:仅用TSWV的特异性引物从接种天竺葵叶片的本氏烟系统叶中扩增得到了约770 bp的目标条带, INSV和TZSV的特异性引物均未扩增得到相应的目标条带, 而从接种缓冲液的对照植物中没有得到任何条带。以上结果表明:接种天竺葵汁液的本氏烟被TSWV侵染, 因此导致天竺葵环斑症状的病原可能为TSWV。
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图 4 接种天竺葵汁液的本氏烟系统叶的RT-PCR检测 Figure 4 Detection of systemic leaves of N.benthamiana inoculated by sampled geranium leaf extracts using RT-PCR M.DNA marker; 1.接种天竺葵汁液的本氏烟系统叶片; 2.阴性对照; 3.阳性对照 M.DNA marker; 1.Systemic leaves of N.benthamiana inoculated by sampled geranium leaf extracts; 2.Negative control; 3.Positive control |
将PCR获得的TSWV N基因片段纯化后克隆到pMD18-T载体并测序。将测定的序列进行BLAST分析, 发现其与本课题组报道的TSWV-LE(GenBank登录号:KU976396) 分离物N基因的核酸序列一致率最高, 为99.7%, 氨基酸序列的相似性也高达99.2%, 说明感染天竺葵的病毒为TSWV, 我们将其命名为TSWV天竺葵分离物(TSWV-Ge, GenBank登录号:KY321922)。选取世界各地区TSWV分离物的N基因与TSWV-Ge N基因进行系统分析, 结果显示:TSWV-Ge与我国报道的TSWV分离物具有较高的同源性, 系统进化关系较近(图 5)。
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图 5 TSWV不同分离物N基因的系统进化树 Figure 5 Phylogenetic tree based on nucleotide sequences of the N gene of different isolates of TSWV |
对病毒进行有效的检测与鉴定是防控病毒病暴发的重要手段之一。国内外常用的TSWV检测方法主要有生物学检测、电镜检测、血清学检测和分子生物学检测等。生物学检测是植物病毒鉴定和检测的传统方法。TSWV的指示植物主要有矮牵牛、心叶烟、本氏烟和三生烟等, 其在心叶烟、本氏烟和三生烟上多产生系统性坏死症状。多数番茄斑萎病毒属病毒侵染均会导致植物生长迟缓、矮化, 叶片或果实产生同心环纹、褪绿、坏死斑、叶片下垂或萎蔫等症状, 有些其他的病毒也会产生类似的症状, 因此还需在生物学检测的基础上对显症植物做进一步的检测方可确定病原。电子显微镜技术是最为直观的病毒鉴定手段, 张仲凯等[13]、方琦等[21]均通过电镜负染的方法观察了TSWV的病毒粒体和内含体结构, 成功鉴定了侵染烟草、水鬼蕉和花朱顶红的TSWV。血清学检测方法具有操作简单、快速、高通量等特点, 已被广泛用于植物病毒检测。但TSWV在植物提取液中稳定性较差, 即使提纯的病毒粒体的免疫原性也较弱, 所以使用多克隆抗体检测时的滴度较低。于翠等[20]制备了TSWV核衣壳蛋白N的单克隆抗体并在此基础上建立了TSWV的Dot-blot ELISA检测体系, 提高了检测的特异性和灵敏度。分子生物学检测方法的检测灵敏度高、特异性好, 是目前最常用的病毒鉴定和检测手段。对TSWV的分子生物学检测方法主要有常规RT-PCR、多重RT-PCR、免疫捕捉RT-PCR和实时荧光定量RT-PCR(qRT-PCR)。赵巍巍等[22]比较了4种检测TSWV的方法后认为qRT-PCR的检测灵敏度远高于快速检测试纸条、双抗夹心酶联免疫吸附法(DAS-ELISA)和常规RT-PCR。不同方法在检测灵敏度、特异性和操作难易等方面各有优劣, 目前还没有一种既高效、灵敏, 又简单快捷的检测方法。因此, 在检测TSWV时应将上述方法结合起来, 才能得到更准确的检测结果[23]。我们在昆明市植物园发现症状表现为叶片褪绿和环斑症状的天竺葵, 采集病样后分别用血清学、生物学和分子生物学3种检测方法对其进行检测, 结合3种检测方法的结果确定其病原为TSWV。此外, 我们发现其N基因与TSWV-LE分离物核苷酸相似性达99.74%, 这个结果再次证明感染发病天竺葵的病毒即为TSWV。
天竺葵不仅具有较高的观赏价值, 而且有些天竺葵还可用于制药和提取精油。因此其作为园林观赏植物种植的同时, 也存在一些保护地种植模式。天竺葵为多年生草本植物, 多为营养繁殖, 因此病毒病的发生极为普遍。关于TSWV侵染天竺葵的报道主要来自法国、意大利、英国、哥伦比亚、加拿大和美国, 我国鲜有报道[1, 16-17]。病毒病素有“植物癌症”之称, 植物一旦被感染很难根除, 因此其防治多“以防为主”。TSWV侵染导致天竺葵植株生长缓慢、品质下降, 严重影响其观赏性和经济价值, 若在保护地栽培中发生将会造成较严重的危害。我们在云南省天竺葵上首次检测到TSWV, 可为天竺葵种植特别是保护地种植中病毒病的防控提供参考。
TSWV于1915年在澳大利亚首次发现, 并于1930年首次正式报道。自20世纪八、九十年代以来, 由于昆虫介体蓟马的迅速传播和扩散, TSWV在美洲、欧洲、亚洲、非洲等地爆发与流行。目前该病毒已在世界范围内广泛分布, 是世界上最具破坏性的植物病毒之一, 在许多重要农业经济作物上造成了极为严重的经济损失[4]。近年来, 随着西花蓟马在我国10余个省市的迅速传播与扩散, TSWV在我国多个省市和地区的发生呈加重趋势, 其危害性也在持续扩大。云南省包括热带、亚热带至寒带等多种气候类型, 十分适合蓟马的繁衍和TSWV的传播与扩散。2015年, 黄亚宁等[24]对昆明市园艺植物上的番茄斑萎病毒属病毒进行调查时发现蜘蛛兰、旱金莲、番茄、蝴蝶兰等多种植物上均有TSWV的发生。我们的系统进化树结果显示云南天竺葵上的TSWV与我国云南地区报道的TSWV分离物的亲缘关系最近, 说明该病毒很有可能是从其他寄主传播到天竺葵上的。云南是各种花卉和园艺植物的种植地, 因此TSWV在天竺葵乃至其他花卉上传播与扩散的可能性极大。我们首次报道了TSWV在云南天竺葵上的发生, 可为该病毒的监测和防控工作提供线索。
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