文章信息
- 吕立, 疏燕, 王源超, 郑小波
- LÜ Li, SHU Yan, WANG Yuanchao, ZHENG Xiaobo
- 福建、湖南自育型致病疫霉生物学特性研究
- Biological characteristics of self-fertile Phytophthora infestans from Fujian and Hunan provinces
- 南京农业大学学报, 2017, 40(3): 444-449
- Journal of Nanjing Agricultural University, 2017, 40(3): 444-449.
- http://dx.doi.org/10.7685/jnau.201611009
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文章历史
- 收稿日期: 2016-11-09
由致病疫霉[Phytophthora infestans(Mont.)de Bary]引起的马铃薯晚疫病是马铃薯生产中的毁灭性病害之一, 对全世界的马铃薯产业造成巨大经济损失, 曾在19世纪40年代引起“爱尔兰大饥馑”[1-2]。目前, 我国马铃薯种植面积和产量均为世界首位, 晚疫病在我国发生严重一直是制约我国马铃薯产业发展的主要因素。
致病疫霉是异宗配合的卵菌。1958年, 在墨西哥首次发现致病疫霉存在两种性征上有显著差异、但形态上完全相同的菌株, 将它们共同培养时能完成有性生殖, 这两种不同性征的菌株分别被称为A1交配型和A2交配型[3]。1984年之前, 普遍认为只有墨西哥存在A1和A2两种交配型, 其他地区仅存在A1交配型。直到1984年, 在瑞士发现A2交配型后, 世界各地才相继发现了A2交配型[4-6]。此外, 从20世纪80年代起, 世界各地也相继报道发现了致病疫霉自育型菌株[7], 即单株就可进行有性生殖产生卵孢子的A1A2型。这意味着致病疫霉从单纯的无性繁殖转变为无性繁殖和有性生殖并存。有性生殖能产生越冬能力强的卵孢子作为初侵染源, 更重要的是有性生殖过程中的遗传重组可能加快病原菌的变异, 使病原菌更快地突破栽培品种的抗病性, 进而引起马铃薯晚疫病的大发生[8-10]。目前, 有研究已发现存在自育型(A1A2) 菌株的地区群体基因型多样性显著高于未发现自育型菌株的地区[11]。
近年来, 一些研究报道我国甘肃、云南、贵州等地存在高比例的自育型菌株[12-14], 但迄今对我国自育型致病疫霉的生物学研究仍鲜有报道。笔者对2014至2016年采集自福建省和湖南省的致病疫霉自育型菌株进行了系统的研究, 研究结果有助于加深对我国致病疫霉自育型群体的了解, 同时为研究我国致病疫霉群体遗传结构提供有价值的参考。
1 材料与方法 1.1 供试致病疫霉菌株的采集与分离2014至2016年每年的4月上旬和5月上旬, 分别从福建省福安市、霞浦县和湖南省永顺县采集马铃薯晚疫病新鲜发病叶片, 进行病原菌分离。
致病疫霉分离采用新鲜叶片保湿分离法[15], 并作改进。将新鲜病叶用自来水冲洗干净, 供保湿病叶的培养皿(直径90 mm)底部放入一张滤纸片, 喷洒少许灭菌水, 将洗净的新鲜病叶背面向上置于潮湿滤纸片上, 每皿放1~2张病叶保湿24 h左右, 至病斑处长出大量白色霉层。挑取少许菌体接种于含有抗生素(氨苄青霉素50 μg·mL-1和利福平50 μg·mL-1)的选择性黑麦培养基平板上, 20 ℃黑暗条件下培养5 d后, 接种点周围长出白色菌落, 用接种针挑取少量菌丝于载玻片上并在显微镜下鉴定, 观察到典型的疫霉游动孢子囊后, 用解剖刀切取菌落边缘2 mm×2 mm的菌丝块接种于黑麦培养基平板上, 20 ℃黑暗条件下培养7 d后获得纯化的致病疫霉菌株。黑麦培养基配方及配制参照郑小波[3]的方法。
1.2 致病疫霉交配型的测定交配型的测定参照郑小波[3]的方法, 并作改进。将致病疫霉菌株接种于黑麦培养基平板上, 在20 ℃黑暗条件下培养10 d后, 将培养皿背面朝上在显微镜下观察单株培养条件下是否产生卵孢子。观察到有卵孢子产生的菌株记为自育型(A1A2)。未观察到卵孢子产生的菌株分别与标准交配型菌株80029(A1交配型)和88133(A2交配型)在黑麦培养基平板上对峙培养, 接种菌丝块之间距离4 cm左右。在黑暗条件下培养10 d后, 在显微镜下观察两菌落交界处是否产生卵孢子。可与标准A1交配型菌株配对产生卵孢子的菌株为A2交配型; 反之能与A2交配型菌株配对产生卵孢子的为A1交配型。
1.3 游动孢子悬浮液的制备游动孢子悬浮液的制备参照郑小波[3]的方法, 并作改进。将致病疫霉菌株接种于黑麦培养基平板上, 在20 ℃黑暗条件下培养10 d后, 向培养皿内加入灭菌水, 使灭菌水淹没菌丝。盖上培养皿盖, 将培养皿置于4 ℃冰箱内约2 h后即有大量游动孢子释放。用微量移液器吸取游动孢子悬浮液10 μL于干净的载玻片上, 在10×10倍显微镜下计量游动孢子数, 调节游动孢子悬浮液浓度为1×103 mL-1。
1.4 单孢分离在含有抗生素(氨苄青霉素50 μg·mL-1和利福平50 μg·mL-1)的选择性WA培养基平板上(直径90 mm)滴加准备好的游动孢子悬浮液200 μL, 约含游动孢子200个, 均匀地涂布于培养基平板表面。在20 ℃黑暗条件下培养24 h后, 显微镜下标记出由单个游动孢子萌发形成的小菌落。在超净工作台内将标记出的小菌落连同周围的培养基一起切下, 用解剖刀尖挑入黑麦培养基平板上, 在20 ℃黑暗条件下培养7 d后, 所形成的菌落即为单游动孢子株。
1.5 自育性状在单游动孢子无性系后代中遗传稳定性的测定以2015、2016年采集自福建、湖南的自育型致病疫霉野生型菌株FJ-15-6、FJ-15-10、FJ-16-1、FJ-16-28、HN-15-5、HN-15-13、HN-16-3和HN-16-13为亲本, 按照1.4节方法进行单游动孢子分离, 每亲本至少获得20个单游动孢子株。将单游动孢子株接种于黑麦培养基平板上, 在20 ℃黑暗条件下培养10 d后, 按照1.2节方法测定交配型, 观察各单孢株是否可自育产生卵孢子。
1.6 诱导自育型致病疫霉菌株在马铃薯叶片组织内产生卵孢子将自育型单孢株FJ-16-1-4、FJ-16-1-5、HN-16-13-1和HN-16-13-7接种于黑麦培养基平板上, 在20 ℃黑暗条件下培养10 d后, 分别制备浓度约为1×104 mL-1的游动孢子悬浮液。在培养皿(直径90 mm)底部放入1张滤纸片, 用灭菌水浸湿。将1月叶龄的马铃薯(致病疫霉生理小种鉴别寄主中不带抗病基因的品种)叶片背面朝上置于潮湿滤纸片上, 每皿放入3片叶片供接种用。用微量移液器吸取游动孢子悬浮液10 μL, 接种于叶片背面, 每个菌株接种9片马铃薯叶片, 置20 ℃黑暗条件下培养5 d, 待接种叶片发病后将叶片移入装有5 mL灭菌水的培养皿(直径60 mm)中, 在20 ℃黑暗条件下浸泡20 d。挑取浸泡后的少许病叶组织置于干净的载玻片上, 用棉兰乳酚油为浮载剂, 在显微镜下观察是否有卵孢子产生并统计健康和败育的卵孢子数。
1.7 自育型菌株产生的卵孢子败育率测定分别在显微镜下测定自育型致病疫霉在马铃薯叶片组织内产生的卵孢子和在黑麦培养基平板上产生的卵孢子的败育率。卵孢子健康与败育的判定标准为:藏卵器内卵孢子壁完整, 内含物饱满, 记为健康; 藏卵器内无卵孢子, 或有卵孢子, 但内含物部分或全部消解, 记为败育。
马铃薯叶片组织产生的卵孢子败育率的测定:统计诱导自育型致病疫霉单孢株FJ-16-1-4、FJ-16-1-5、HN-16-13-1和HN-16-13-7在马铃薯叶片组织内产生卵孢子的健康和败育卵孢子数, 每菌株至少随机计数100个卵孢子。
黑麦培养基平板上产生的卵孢子败育率的测定:将2015—2016年从福建、湖南分离到的自育型菌株以及以8个自育型野生型菌株(FJ-15-6、FJ-15-10、FJ-16-1、FJ-16-28、HN-15-5、HN-15-13、HN-16-3和HN-16-13) 为亲本建立的单游动孢子无性系接种于黑麦培养基平板上, 在20 ℃黑暗条件下培养25 d后, 将培养皿背面朝上置于显微镜下统计健康和败育的卵孢子数, 每菌株至少随机计数200个卵孢子。
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分别测定自育型致病疫霉单孢株FJ-16-1-4、FJ-16-1-5、HN-16-13-1和HN-16-13-7在马铃薯叶片组织内产生的卵孢子和在黑麦培养基平板上产生的卵孢子的活性。卵孢子活性的判别标准参照Han等[12]和杨笍等[13]的方法。经噻唑蓝(Methylthiazolyldiphenyl-tetrazolium bromide, MTT)染色后卵孢子呈蓝色和玫瑰红色表明其均具有活性, 前者为处在萌动状态, 而后者为处在休眠状态; 卵孢子未被染色的则表示已丧失活性。
马铃薯叶片组织内产生的卵孢子的活性测定:按照1.6节方法诱导自育型致病疫霉菌株在马铃薯叶片组织内产生卵孢子后将含有卵孢子的病叶移入50 mL离心管中, 加入0.1%MTT至没过病叶组织, 置于摇床上35 ℃、50 r·min-1处理3 h。挑取染色后的少许病叶组织置于干净的载玻片上, 加盖玻片, 用拇指轻轻挤压盖玻片, 使叶片组织成很薄的一层, 在显微镜下观察并记录叶片组织内卵孢子染色结果。
黑麦培养基平板上产生的卵孢子的活性测定:将自育型菌株接种于黑麦培养基平板上, 在20 ℃黑暗条件下培养25 d后, 用打孔器(直径8 mm)打出菌丝块圆片20片, 移至50 mL离心管中, 加入0.1%MTT至没过菌丝块圆片, 置于摇床上35 ℃、50 r·min-1处理3 h。将染色后的菌丝块圆片置于干净的载玻片上, 加盖玻片, 用拇指轻轻挤压盖玻片至菌丝块圆片成很薄的一层, 在显微镜下观察记录卵孢子染色结果。
2 结果与分析 2.1 致病疫霉的分离及交配型2014至2016年, 从福建福安、霞浦和湖南永顺的马铃薯晚疫病发病叶片上共分离到165株致病疫霉。菌株的采集时间、地点, 采集的菌株数及交配型测定结果见表 1。3年间, 致病疫霉自育型菌株在福建的出现呈明显的上升趋势, 至2016年, 福建福安、霞浦分离到的菌株均为自育型(A1A2);而在湖南永顺, 3年间分离到的86株菌株全部为自育型(A1A2)。结果表明, A1A2型已成为上述地区的优势群体。
| 采集地点Locations | 采集年份Years | 菌株数No.of isolates | 交配型Mating type |
| 福建霞浦县Xiapu County, Fujian | 2014 | 1 | A1 |
| 2015 | 27 | A1A2 | |
| 2016 | 16 | A1A2 | |
| 福建福安市Fu′an City, Fujian | 2014 | 9 | A1 |
| 2015 | 10 | A1 | |
| 2016 | 16 | A1A2 | |
| 湖南永顺县Yongshun County, Hunan | 2014 | 38 | A1A2 |
| 2015 | 20 | A1A2 | |
| 2016 | 28 | A1A2 |
建立以自育型菌株FJ-15-6、FJ-15-10、FJ-16-1、FJ-16-28、HN-15-5、HN-15-13、HN-16-3和HN-16-13为亲本的单游动孢子无性系, 每亲本至少获得20个单孢株。结果上述8个野生型亲本的单游动孢子无性系后代均可自育产生卵孢子, 表明自育性状可以稳定遗传。上述结果证明供试自育型菌株单独培养可产生卵孢子的自育现象不是因A1、A2菌株的混杂所引起。
2.3 自育型菌株在黑麦培养基上产生卵孢子的败育率2015—2016年从福建、湖南分离到的自育型菌株在黑麦培养基上产生卵孢子的败育率测定结果(表 2和图 1-A~C)显示:所观测的107株自育型菌株在黑麦培养基上产生健康卵孢子的比例低, 仅为0~26%, 而败育率高达74%~100%。虽然不同的自育型菌株间卵孢子败育率有差异, 但在人工培养基上产生的卵孢子败育率高是一个普遍现象。从上述菌株中选择8个自育型野生型亲本(FJ-15-6、FJ-15-10、FJ-16-1、FJ-16-28、HN-15-5、HN-15-13、HN-16-3和HN-16-13) 建立单游动孢子无性系, 进一步观测自育型菌株在人工培养基上产生的卵孢子败育现象在单孢后代的变化, 结果所有无性系后代的卵孢子败育率高达72%~100%, 与野生型亲本无明显差异。
| 采集地点Locations | 采集年份Years | 菌株数No.of isolates | 败育率/% Abortive rate |
| 福建霞浦县Xiapu County, Fujian | 2015 | 27 | 77~100 |
| 2016 | 16 | 78~93 | |
| 福建福安市Fu′an City, Fujian | 2016 | 16 | 82~100 |
| 湖南永顺县Yongshun County, Hunan | 2015 | 20 | 74~100 |
| 2016 | 28 | 78~100 |
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图 1 自育型菌株在黑麦培养基和马铃薯叶片组织内产生的卵孢子(×400) Figure 1 Oospores of self-fertile isolates formed on rye agar medium and in potato leaf tissues A.黑麦培养基上健康的卵孢子Healthy oospore formed on rye agar medium; B, C.黑麦培养基上败育的卵孢子Abortive oospores formed on rye agar medium; D.马铃薯叶片内健康的卵孢子Healthy oospore formed in potato leaf tissues; E.马铃薯叶片内败育的卵孢子Abortive oospore formed in potato leaf tissues |
编号为FJ-16-1-4、FJ-16-1-5、HN-16-13-1和HN-16-13-7的单孢株在马铃薯叶片组织内产生健康卵孢子(图 1-D)的比例分别为78%、73%、79%和62%;而在黑麦培养基上产生的败育卵孢子(图 1-B、C)的比例分别为87%、82%、74%和89%, 显著高于形成于马铃薯叶片组织内的卵孢子(图 1-E)的败育率。
2.5 自育型菌株在马铃薯叶片组织内产生卵孢子的活性4个供试自育型单孢株FJ-16-1-4、FJ-16-1-5、HN-16-13-1和HN-16-13-7在马铃薯叶片组织内均产生大量具活性的卵孢子, 所产生的具活性的卵孢子比例分别为63%、68%、58%和54%, 其中有2%~7%的卵孢子处在萌动状态(MTT染色呈蓝色), 明显高于在黑麦培养基上产生的卵孢子(表 3和图 2)。上述结果提示:自育型菌株在马铃薯叶片组织内产生的卵孢子可能萌发产生自交重组后代从而对该病菌的变异速度和群体遗传结构产生影响。
| 菌株 Isolate |
具活性卵孢子的比例/% Proportion of viable oospores | |
| 马铃薯叶片组织内Potato leaf tissues | 黑麦培养基上Rye agar medium | |
| FJ-16-1-4 | 63 | 11 |
| FJ-16-1-5 | 68 | 28 |
| HN-16-13-1 | 58 | 19 |
| HN-16-13-7 | 54 | 16 |
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图 2 被MTT染色的卵孢子(×400) Figure 2 Oospores stained by MTT MTT染色测定卵孢子活性, 玫瑰红色的卵孢子(A)和蓝色的卵孢子(B)具有活性, 未被染色的卵孢子(C)丧失活性。 MTT staining to test the viability of oospores, oospore with rose color(A)and oospore with blue color(B)are viable, and unstained oospore(C)is unviable. |
本文对2014至2016年从福建霞浦县、福安市和湖南永顺县分离到的致病疫霉开展研究, 发现自育型致病疫霉在上述地区的比例逐年上升, 并已成为优势群体; 自育性状可在单游动孢子无性系后代中稳定遗传; 自育型菌株在黑麦培养基上产生的卵孢子败育率很高, 但在马铃薯叶片组织内可产生大量健康且具活性的卵孢子。研究结果提示大量自育型菌株的出现可能加速该病菌的遗传重组, 从而加快其变异速度并对其群体遗传结构产生影响。
在我国, 已报道有越来越多的地区发现致病疫霉的自育型分布。早在1964年, 在我国甘肃省就有发现致病疫霉自育型菌株的记载[16]。近些年来, 致病疫霉自育型在甘肃、宁夏、贵州、重庆、云南、福建等地相继被报道[12-14], 且在某些地区已上升为优势群体。但在湖南自育型则未见报道。我们自2014至2016年在湖南永顺分离的86株致病疫霉菌株均为自育型。从总体结果上看, 自育型在空间分布上呈逐年扩展的态势, 但导致我国致病疫霉自育型菌株出现和扩展的原因仍不清楚。值得一提的是, 我们从2014至2016年连续3年从安徽省界首市采集的85株致病疫霉均为A1交配型, 未发现自育型菌株(未发表数据)。此外, 有报道指出, 相较于A1交配型菌株, 自育型菌株的生长速率更快, 对马铃薯寄主具有更强的侵染力, 生理小种结构组成更加复杂, 并且对嘧菌酯和异丙菌胺等杀菌剂具有更强的抗药性[17]。
分离自福建省和湖南省的自育型菌株在黑麦培养基上可以产生大量的卵孢子, 但卵孢子败育率高。我们对来自云南省的10株自育型菌株的观测也显示相同的结果(未发表数据)。表明自育型菌株在黑麦培养基上所形成的卵孢子败育率高可能是一个普遍现象, 但产生这种现象的原因仍不清楚, 可能与自育型菌株自身的生物学特性有关。通过改变培养基成分能否改变这一现象有待进一步研究。
自育型致病疫霉在马铃薯叶片组织内可以产生大量健康、具活性的卵孢子, 卵孢子主要形成于叶脉周围。本文还发现自育型菌株在马铃薯叶柄和嫩茎组织中亦可形成一定数量的卵孢子, 但数量较叶片内的少, 采用相同方法接种马铃薯高感品种‘荷兰15号’的块茎未能诱导自育型菌株在块茎组织内产生卵孢子。本文观测到供试的自育型菌株在马铃薯叶片组织内产生的卵孢子有部分处在萌动状态, 提示叶片组织内的卵孢子具有萌发形成自交后代的可能。
大量致病疫霉自育型菌株的出现提示该病菌可能通过有性重组加速病原菌的变异, 并对其群体遗传结构产生影响。诱导马铃薯叶片组织内产生的卵孢子萌发, 建立自交后代群体并进一步研究自交后代的适生性和遗传变异规律, 有助于为自育所导致的有性生殖对致病疫霉变异和群体遗传结构影响提供更为直接的证据。
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