抗草甘膦转基因油菜与野芥菜回交3代子1代和子2代的适合度研究

http://dx.doi.org/10.7685/jnau.201609030

文章信息

张庆玲, 王建, 强胜, 王晓蕾, 闫静, 伏建国, 宋小玲

ZHANG Qingling, WANG Jian, QIANG Sheng, WANG Xiaolei, YAN Jing, FU Jianguo, SONG Xiaoling

Fitness of BC₃F₂ and BC₃F₃ between glyphosate-resistant transgenic oilseed rape and wild Brassica juncea

南京农业大学学报, 2017, 40(3): 434-443

Journal of Nanjing Agricultural University, 2017, 40(3): 434-443.

http://dx.doi.org/10.7685/jnau.201609030

文章历史

收稿日期: 2016-09-20

引用本文

张庆玲, 王建, 强胜, 等. 抗草甘膦转基因油菜与野芥菜回交3代子1代和子2代的适合度研究[J]. 南京农业大学学报, 2017, 40(3): 434-443. 复制到剪切板

ZHANG Qingling, WANG Jian, QIANG Sheng, et al. Fitness of BC₃F₂ and BC₃F₃ between glyphosate-resistant transgenic oilseed rape and wild Brassica juncea[J]. Journal of Nanjing Agricultural University, 2017, 40(3): 434-443. DOI: 10.7685/jnau.201609030 复制到剪切板

抗草甘膦转基因油菜与野芥菜回交3代子1代和子2代的适合度研究

张庆玲, 王建, 强胜, 王晓蕾, 闫静, 伏建国, 宋小玲

南京农业大学杂草研究室, 江苏南京 210095

收稿日期：2016-09-20

基金项目：国家自然科学基金项目（31270579）；国家转基因生物新品种培育重大专项子课题（2016ZX08012005-006）

作者简介：张庆玲, 硕士研究生

通信作者：宋小玲, 教授, 主要从事转基因作物安全性评估的研究, E-mail:sxl@njau.edu.cn

摘要：[目的]携带抗性基因回交后代的适合度是抗除草剂转基因作物的抗性基因能否成功逃逸到野生近缘种的重要依据。本文研究抗草甘膦转基因油菜与野芥菜的回交3代子1代（BC₃F₂）和子2代（BC₃F₃）在田间条件下的适合度，为转基因油菜基因漂移的生态风险评估提供有价值的参考。[方法]以野芥菜、抗草甘膦转基因油菜与野芥菜的BC₃F₂和BC₃F₃为材料，研究在低密度（每区15株）和高密度（每区30株）单种及不同种植比例（野芥菜、回交后代的混种比例分别为4:1、3:2和1:1）混种条件下，野芥菜与BC₃F₂和BC₃F₃的总适合度。[结果]单种条件下，BC₃F₂的总适合度均与野芥菜无显著性差异。混种条件下，种植比例为4:1时，BC₃F₂在2种密度下的总适合度均显著低于野芥菜；在混种比例为3:2和1:1条件下，BC₃F₂在低密度条件下的总适合度与野芥菜相当，而在高密度下的总适合度显著低于野芥菜。BC₃F₃在各种种植条件下的总适合度均与野芥菜无显著差异。[结论]BC₃F₂的总适合度受种植密度和比例的影响，在低密度3:2和1:1混种比例下的总适合度与野芥菜相当；BC₃F₃的总适合度不受种植密度和比例的影响。抗草甘膦转基因油菜与野芥菜的BC₃F₂和BC₃F₃都具有在野外生存定植的可能性，且BC₃F₃定植的可能性较BC₃F₂更大。因此在防范转基因油菜基因逃逸的策略上，除防范初始杂交发生外，也应该防范回交后代的产生。

关键词：野芥菜抗草甘膦转基因油菜回交后代适合度

Fitness of BC₃F₂ and BC₃F₃ between glyphosate-resistant transgenic oilseed rape and wild Brassica juncea

ZHANG Qingling, WANG Jian, QIANG Sheng, WANG Xiaolei, YAN Jing, FU Jianguo, SONG Xiaoling

Weed Research Laboratary, Nanjing Agricultural University, Nanjing 210095, China

Abstract: [Objectives] The risk of gene flow from genetically modified (GM)crops to their wild relatives was determined by the fitness of the F₁ hybrids and subsequent generations. We analyzed composite fitness of BC₃F₂ and BC₃F₃ between glyphosate-resistant transgenic oilseed rape (Brassica napus)and wild B. juncea in field. The findings are valuable for assessing ecological impacts caused by transgene escape from glyphosate-resistant transgenic oilseed rape to wild relatives. [Methods] The composite fitness of BC₃F₂ and BC₃F₃ between glyphosate-resistant transgenic oilseed rape and wild B. juncea and wild B. juncea were analyzed in field at low (15 plants per plot)and high density (30 plants per plot)in pure plots and different mixed plots (the ratio of wild B. juncea:backcross generation were 4:1, 3:2 and 1:1). [Results] The composite fitness of BC₃F₂ was similar to that of wild B. juncea in pure plots. In mixed plots, compared with their respective wild B. juncea, BC₃F₂ had significant lower composite fitness under the 4:1 proportion at both low and high density. Under the 3:2 and 1:1 proportion, BC₃F₂ displayed similar composite fitness at low density and significant lower ones at high density, respectively. The composite fitness of BC₃F₃ was similar to that of wild B. juncea at different densities and planting proportions. [Conclusions] It implied that BC₃F₂ exhibited similar composite fitness to wild B. juncea under 3:2 and 1:1 plant proportions at low density although the composite fitness of BC₃F₂ was affected by planting densities and proportion. However, BC₃F₃ always had similar fitness compared with wild B. juncea. Thus BC₃F₂ and BC₃F₃ between glyphosate-resistant transgenic oilseed rape and wild B. juncea have the potential possibility to establish populations in field. Moreover, BC₃F₃ displayed larger possibility than BC₃F₂ did. Therefore, initial hybridization between transgenic oilseed rape and wild B. juncea, as well as backcross between wild B. juncea and F₁ or subsequent generations, should be prevented.

Key words: wild Brassica juncea glyphosate-resistant transgenic oilseed rape(Brassica napus) backcross progenies fitness

自1996年转基因作物商业化种植以来, 转基因作物的种植面积一直保持着持续增长的趋势。转基因作物的大面积种植在带来可观的经济和社会效益的同时, 由花粉介导的基因漂移也成为人们关注的焦点之一^[1-2]。转基因能够通过花粉介导的基因漂移转移至非转基因作物、野生近缘种及近缘杂草中, 并可能带来潜在的生态风险^{[1, 3]}。然而, 不是所有的有性杂交都能导致基因漂移, 成功的基因漂移还取决于杂种的生存和繁殖能力, 即后代的适合度^[4-6]。在特定环境下, 携带转基因的野生近缘种可能会表现出自然选择优势而提高其适合度, 增强其生存竞争和繁殖能力, 并导致生态风险。因此, 可以通过对携带转基因的个体或群体生长和繁殖相关性状的测量, 分析其适合度来评价其潜在的生态风险。携带抗性基因后代的适合度是抗性基因能否渗入野生近缘种的重要依据^[4-8], 且后代适合度受环境条件的影响, 例如竞争、种植密度和环境压力等^[9-13]。

甘蓝型油菜(Brassica napus, AACC, 2n=38) 是主要的商业化转基因作物之一, 也是转基因研究最活跃的作物之一。转基因油菜的抗性基因向其野生近缘种的漂移问题也备受关注^{[3, 14-15]}。油菜可通过花粉介导与芸薹属植物包括野生近缘种发生基因漂移。我国虽未有转基因油菜的商业化种植, 但每年进口大量的转基因油菜籽用于食用油的生产, 同时又有众多的芸薹属近缘种, 有的是危害严重的杂草, 因此在我国转基因油菜的基因漂移问题更应引起高度重视。油菜与芜菁(B.rapa, AA, 2n=20) 极易杂交而且杂交后代能够进一步与芜菁回交, 完成抗性基因的渗入^[16-17]。野芥菜(wild B.juncea, AABB, 2n=36) 是广泛分布于我国西北地区和长江中、下游地区荒地和农田的杂草^[15], 其与油菜杂交产生后代的能力仅次于芜菁^[18]。油菜包括转基因油菜能与野芥菜发生基因漂移^{[15, 18-19]}。虽然F₁的花粉育性和结实率都很低, 但F₁可与野芥菜回交, 得到回交1代^[20-21]。

本实验室前期研究结果表明, 野芥菜与抗草甘膦转基因油菜的杂交1代自交几乎不结实^[15], 回交1代的结实能力显著低于野芥菜, 回交2代和回交3代的结实率与野芥菜无显著差异^[22]。但对回交后代自交子代的适合度尚未见报道。因此本试验以携带抗性基因的正、反回交3代子1代(BC₃mF₂和BC₃pF₂), 正、反回交3代子2代(BC₃mF₃和BC₃pF₃)(其中以野芥菜为母本进行回交获得的后代为正向后代, 反之为反向后代)为试验材料, 在田间设置单种和混种、低密度和高密度条件下, 研究这些回交后代与其野生杂草亲本野芥菜在无竞争和不同竞争条件下的适合度, 为评估抗除草剂转基因油菜的抗性基因向野芥菜的基因漂移可能导致的生态风险提供试验依据。

1 材料与方法 1.1 材料

本试验以野芥菜, 携带抗性基因的正、反回交3代子1代(BC₃mF₂和BC₃pF₂), 正、反回交3代子2代(BC₃mF₃和BC₃pF₃)为试验材料。作为亲本的抗草甘膦转基因油菜(DS-Roughrider, Roundup Ready, event RT73) RT73是纯合的、含有1个完整的cp 4 epsps和gox基因, 以及它们各自的调控基因。野芥菜采集于江苏省南京市南京农业大学江浦试验基地。通过人工杂交方式, 以野芥菜为母本, 抗草甘膦油菜为父本获得了携带抗性基因的F₁, 随后通过正、反回交(正向回交以野芥菜为母本, F₁或回交后代为父本; 反向回交以F₁或回交后代为母本, 野芥菜为父本)分别获得正向回交3代(BC₃mF₁)和反向回交3代(BC₃pF₁)。将回交3代(BC₃F₁)植株套袋自交即得到BC₃F₂和BC₃F₃, 试验材料的获得方法见图 1。

图 1 野芥菜和抗草甘膦转基因油菜杂交和回交框架图 Figure 1 Crossing scheme of hybridization and backcrossing between wild Brassica juncea and transgenic glyphosate-resistant oilseed rape “×”前面的作母本, 后面的作父本; “m”表示野芥菜为母本的后代; “p”表示野芥菜为父本的后代。 Combinations involved in this study are indicated as maternal plants×paternal plants. Populations in front of "×"are always maternal plants, and populations in the back of "×"are always paternal plants. "m"denotes backcross progeny obtained with wild B.juncea as maternal plants. "p"denotes backcross progeny obtained with wild B.juncea as paternal plants.

图选项

1.2 方法 1.2.1 田间试验设计

试验于2012和2013年进行, 每年11月初将经过抗性筛选的长势良好携带抗性基因的植株幼苗移栽至试验田。田间试验按照随机区组设计, 小区面积为3 m²(2.5 m×1.2 m), 重复3次。种植密度按照低、高2种密度(即每区15株和30株)进行种植。其中低密度1:1混种时, 为了使野芥菜与回交后代株数相同且不改变株距, 小区面积相应扩大, 统计每小区内的全部植株, 计算平均值。各密度处理下分别设计单种和混种, 混种时野芥菜与各回交后代两两混合种植, 野芥菜和回交后代的混种比例分别为4:1、3:2和1:1。小区内回交后代和野芥菜随机排列。其中低密度下每小区种植3行×5列, 行距为0.4 m, 株距为0.5 m。高密度下每小区种植6行×5列, 行距为0.2 m, 株距为0.5 m, 小区具体设计见图 2。单种时每小区只种1种供试材料, 行距和株距与混种时相同。

	图 2 野芥菜与回交后代混种时小区植株分布图 Figure 2 Layout of field experiment in mixed plot △代表野芥菜; ▲代表回交后代 △ represents B.juncea; ▲ represents backcross offspring
图选项

1.2.2 适合度性状的测量

试验所测适合度性状包括营养生长指标和生殖生长指标。营养生长指标分别为株高、茎粗、一次分枝数和地上部干生物量; 生殖生长指标分别为单株有效角果数、角果长、每角果饱粒数和单株种子质量。株高的测量方法为在植株成熟后, 用直尺测量地上基部到主茎最高处的长度; 茎粗的测量与株高同步进行, 用直尺测量地上基部的直径; 一次分枝数为成熟后主茎上的分枝数目; 地上部单株干生物量即成熟后对单株干生物量进行测定; 单株有效角果数即每株含有1粒以上饱满或半饱满种子的角果数; 选择植株中下部的20个角果测量其长度并统计每个角果中的饱满种子数, 所得平均值即为该植株的角果长和每角果饱粒数。各适合度性状的相对适合度值的计算方法:以野芥菜为标准“1”, 相应回交后代的各项适合度性状与野芥菜的该适合度性状之比为相对适合度值, 总适合度(composite fitness)值是其各项适合度性状的相对适合度值的加权平均数^[23-24], 本试验中总适合度=∑(各指标相对适合度值)/8。

1.3 数据的统计与分析

使用SPSS 17.0统计软件进行数据的统计分析, 以小区为单位计算回交后代及亲本的各适合度性状的平均值, 每小区的平均值为1个独立变量。通过配对样本t测验, 检验混种条件下回交后代与亲本野芥菜的各适合度性状及总适合度的差异。单种条件下, 通过Duncan′s新复极差测验进行野芥菜和各回交后代间各性状及总适合度的多重比较。采用双因素方差分析来分析种植密度和比例对后代适合度性状的影响。

2 结果与分析 2.1 单种条件下BC₃F₂、BC₃F₃与野芥菜的适合度性状比较 2.1.1 低密度单种条件下BC₃F₂、BC₃F₃与野芥菜的适合度性状比较

低密度单种条件下, 野芥菜与供试的回交后代生长良好。BC₃mF₂和BC₃pF₂的株高分别为134.69和127.87 cm, 茎粗分别为1.24和1.15 cm, 显著低于野芥菜, 其他适合度性状与野芥菜无显著性差异(表 1)。BC₃mF₃和BC₃pF₃的各适合度性状均与野芥菜无显著性差异(表 1)。

表 1 低密度单种条件下BC₃F₂、BC₃F₃与野芥菜的适合度相关性状的比较 Table 1 Fitness traits of BC₃F₂, BC₃F₃ and wild B.juncea in 15 plants pure plot at low density

试验材料 Material	株高/cm Plant height	茎粗/cm Stem diameter	一次分枝数 The first branchnumber	单株有效角果数 Silique numberper plant	单株干生物量/g Above-ground drybiomass per plant	单株种子质量/g Total seed weightper plant	角果长/cm Silique length	每角果饱粒数 Seed numberper silique
Wild B.juncea	157.93±7.62^a	1.43±0.02^a	13.67±0.83^a	1 887.93±83.27^a	151.66±8.77^a	34.67±2.46^a	4.03±0.09^a	17.98±0.37^a
BC₃mF₂	134.69±6.22^b	1.24±0.08^b	12.78±1.18^a	1 762.88±83.86^a	140.81±3.48^a	35.17±0.62^a	3.85±0.16^a	16.91±0.53^a
BC₃pF₂	127.87±5.87^b	1.15±0.03^b	13.53±1.34^a	1 783.13±32.74^a	138.98±3.30^a	34.29±2.27^a	3.80±0.02^a	16.81±0.72^a
Wild B.juncea	134.91±3.34^a	1.37±0.01^a	13.73±0.78^a	1 395.13±10.30^a	102.82±0.83^a	27.89±2.01^a	3.58±0.12^a	15.29±0.51^a
BC₃mF₃	126.31±5.33^a	1.21±0.06^a	14.77±1.04^a	1 467.51±119.66^a	107.52±2.03^a	28.06±2.34^a	3.64±0.10^a	16.46±0.79^a
BC₃pF₃	131.14±0.71^a	1.25±0.00^a	13.96±0.19^a	1 397.72±30.21^a	106.92±2.74^a	26.39±0.56^a	3.55±0.05^a	15.70±0.39^a
注:不同小写字母表示差异显著(P < 0.05)。数值为平均值±标准误。 Note:Different lowercase letters indicate significant differences(P < 0.05). Values are mean±standard error. The same as follows.

表选项

2.1.2 高密度单种条件下BC₃F₂、BC₃F₃与野芥菜的适合度性状比较

高密度单种条件下, BC₃mF₂和BC₃pF₂的株高分别为132.40和140.63 cm, 茎粗分别为1.15和1.22 cm, 显著低于野芥菜, 其他适合度性状与野芥菜无显著性差异(表 2)。BC₃mF₃和BC₃pF₃的株高分别为130.83和131.53 cm, 茎粗分别为1.21和1.20 cm, 显著低于野芥菜, 其他适合度性状与野芥菜无显著性差异(表 2)。

表 2 高密度单种条件下BC₃F₂、BC₃F₃与野芥菜的适合度相关性状的比较 Table 2 Fitness traits of BC₃F₂, BC₃F₃ and wild B.juncea in 30 plants pure plot at high density

试验材料 Material	株高/cm Plant height	茎粗/cm Stemdiameter	一次分枝数 The first branchnumber	单株有效角果数 Silique numberper plant	单株干生物量/g Above-ground drybiomass per plant	单株种子质量/g Total seed weightper plant	角果长/cm Silique length	每角果饱粒数 Seed numberper silique
Wild B.juncea	167.17±5.47^a	1.53±0.10^a	12.53±0.50^a	1 531.84±23.62^a	129.32±4.10^a	32.61±1.03^a	3.94±0.16^a	16.89±0.57^a
BC₃mF₂	132.40±1.70^b	1.15±0.15^b	14.00±0.85^a	1 361.23±59.05^a	119.92±5.02^a	28.72±2.77^a	3.83±0.04^a	17.55±0.45^a
BC₃pF₂	140.63±7.69^b	1.22±0.12^b	12.33±0.61^a	1 334.13±93.00^a	106.89±11.50^a	28.32±3.73^a	3.90±0.06^a	17.84±0.18^a
Wild B.juncea	142.83±2.17^a	1.36±0.09^a	13.06±0.06^a	1 254.50±66.50^a	96.99±1.44^a	22.71±0.66^a	3.64±0.04^a	15.04±0.50^a
BC₃mF₃	130.83±2.10^b	1.21±0.03^b	13.89±0.86^a	1 224.64±41.64^a	91.01±2.23^a	23.84±0.74^a	3.64±0.05^a	16.53±0.48^a
BC₃pF₃	131.53±1.76^b	1.20±0.02^b	12.34±0.92^a	1 115.43±67.03^a	91.22±3.78^a	21.89±0.51^a	3.61±0.03^a	16.00±0.21^a

表选项

2.2 混种条件下BC₃F₂、BC₃F₃与野芥菜的适合度性状比较 2.2.1 低密度混种条件下BC₃F₂、BC₃F₃与野芥菜的适合度性状比较

在低密度混种条件下, 野芥菜与供试后代生长良好。当混种比例为4:1, 即野芥菜优势度最高时, BC₃mF₂的株高和茎粗均显著低于野芥菜约26和0.4 cm; BC₃pF₂表现为株高、茎粗和一次分枝数均显著低于野芥菜35 cm、0.3 cm和3;BC₃mF₂和BC₃pF₂其他性状均与野芥菜无显著性差异。当后代的混种比例为3:2和1:1时, BC₃mF₂和BC₃pF₂的适合度性状均与野芥菜无显著性差异。低密度混种条件下, BC₃mF₃和BC₃pF₃在3种混种比例下的各适合度性状均与野芥菜相当(表 3)。

表 3 低密度混种条件下BC₃F₂、BC₃F₃与野芥菜的适合度性状比较 Table 3 Fitness traits of BC₃F₂, BC₃F₃ and wild B.juncea in 15 plants mixed plot

种植比例 Proportion	试验材料 Material	株高/cm Plantheight	茎粗/cm Stemdiameter	一次分枝数 The first branchnumber	单株有效角果数 Silique numberper plant	单株干生物量/g Above-ground drybiomass per plant	单株种子质量/g Total seed weightper plant	角果长/cm Siliquelength	每角果饱粒数 Seed numberper silique
4:1	Wild B.juncea	154.42±1.55	1.31±0.02	13.26±0.12	1 588.05±44.88	137.29±2.72	27.85±1.14	3.91±0.05	16.78±0.35
	BC₃mF₂	128.56±4.45^*	0.94±0.07^*	14.11±0.59	1 364.00±56.25	116.44±9.13	24.76±0.84	3.95±0.07	16.57±0.09
	Wild B.juncea	153.91±5.05	1.27±0.09	12.91±0.42	1 579.18±22.09	132.65±9.73	24.38±2.42	3.98±0.06	16.52±0.06
	BC₃pF₂	118.67±4.87^*	0.92±0.06^*	10.34±0.39^*	1 661.29±62.73	113.55±4.86	22.85±2.22	3.81±0.09	17.39±0.44
	Wild B.juncea	130.20±5.80	1.23±0.10	12.49±1.02	1 057.53±146.66	93.73±10.65	19.95±1.97	3.61±0.03	15.41±0.45
	BC₃mF₃	116.06±10.50	1.16±0.10	13.22±1.06	1 190.83±126.14	99.05±9.43	22.52±2.82	3.43±0.13	15.53±1.00
	Wild B.juncea	127.70±3.68	1.27±0.05	13.00±0.55	1 232.80±89.97	89.23±7.87	22.23±1.49	3.56±0.13	15.43±0.68
	BC₃pF₃	130.22±8.59	1.23±0.05	14.11±0.59	1 425.44±271.80	97.09±18.21	29.36±5.45	3.60±0.09	15.01±0.06
3:2	Wild B.juncea	154.43±7.02	1.26±0.04	12.84±0.13	1 878.25±257.91	137.93±5.67	29.02±1.68	3.81±0.08	16.78±0.45
	BC₃mF₂	141.89±3.81	1.19±0.06	14.70±0.82	1 955.45±126.62	136.33±8.61	28.49±2.45	3.92±0.08	17.47±0.58
	Wild B.juncea	152.85±4.29	1.29±0.07	13.31±0.50	1 255.25±21.67	135.14±8.35	23.67±1.53	3.79±0.07	17.09±0.44
	BC₃pF₂	142.66±7.33	1.19±0.13	13.41±0.49	1 359.13±117.21	132.67±8.58	24.76±2.48	3.89±0.06	16.67±0.85
	Wild B.juncea	135.50±3.09	1.31±0.06	12.11±0.68	1 115.41±194.86	91.10±15.95	19.80±3.13	3.49±0.07	14.92±0.02
	BC₃mF₃	122.44±2.78	1.13±0.03	13.19±0.51	1 119.17±51.43	92.59±4.28	21.83±1.23	3.52±0.04	14.33±0.11
	Wild B.juncea	128.54±2.07	1.27±0.08	12.04±0.73	1 122.96±181.32	92.72±19.98	21.44±2.90	3.58±0.05	15.28±0.20
	BC₃pF₃	120.49±3.70	1.11±0.04	12.28±1.95	1 074.61±147.00	84.83±15.71	19.47±2.05	3.60±0.20	15.76±0.48
1:1	Wild B.juncea	147.63±7.31	1.29±0.03	12.16±0.47	1 305.69±175.15	144.27±15.94	26.35±4.24	3.86±0.08	16.11±0.40
	BC₃mF₂	129.12±10.32	1.15±0.02	12.38±0.29	1 284.40±92.31	137.14±10.11	26.56±2.98	3.70±0.10	16.09±0.87
	Wild B.juncea	151.37±0.92	1.34±0.02	13.67±0.34	1 248.94±44.43	133.42±3.29	26.35±0.31	3.74±0.01	16.53±0.05
	BC₃pF₂	143.64±2.99	1.35±0.03	13.19±0.29	1 206.11±39.16	133.32±2.63	25.57±1.18	3.75±0.02	16.77±0.26
	Wild B.juncea	127.53±1.73	1.32±0.03	11.03±0.87	900.83±17.93	80.50±4.03	17.40±0.49	3.50±0.08	15.00±0.27
	BC₃mF₃	120.91±3.79	1.24±0.04	13.36±0.82	910.44±53.16	76.64±2.13	17.78±1.17	3.57±0.27	14.38±1.02
	Wild B.juncea	134.72±3.53	1.31±0.03	12.61±0.42	1 173.69±192.57	97.39±16.04	21.61±3.16	3.44±0.07	14.72±0.72
	BC₃pF₃	124.53±7.37	1.18±0.06	11.77±1.65	1 051.93±205.40	87.78±17.56	20.43±4.89	3.69±0.25	16.11±1.04
Note:^*P < 0.05. The same as follows.

表选项

2.2.2 高密度混种条件下BC₃F₂、BC₃F₃与野芥菜的适合度性状比较

高密度混种条件下, 当混种比例为4:1时, BC₃mF₂和BC₃pF₂的株高分别显著低于野芥菜21和38 cm; 茎粗低于野芥菜0.4和0.6 cm; 单株干生物量低于野芥菜19和41 g。BC₃mF₂的一次分枝数、单株有效角果数和单株种子质量分别为10.83、922.74和20.29 g, 与野芥菜无显著性差异; 而BC₃pF₂的一次分枝数、单株有效角果数和单株种子质量均显著低于野芥菜1、395和10 g。BC₃mF₃和BC₃pF₃各适合度性状均与野芥菜无显著性差异(表 4)。

表 4 高密度混种条件下BC₃F₂、BC₃F₃与野芥菜的适合度性状比较 Table 4 Fitness traits of BC₃F₂, BC₃F₃ and wild B.juncea in 30 plants mixed plot

种植比例 Proportion	试验材料 Material	株高/cm Plant height	茎粗/cm Stem diameter	一次分枝数 The first branchnumber	单株有效角果数 Silique numberper plant	单株干生物量/g Above-ground drybiomass per plant	单株种子质量/g Total seed weightper plant	角果长/cm Siliquelength	每角果饱粒数 Seed numberper silique
4:1	Wild B.juncea	154.03±4.26	1.36±0.10	11.01±1.00	1 075.07±89.02	91.05±6.47	22.35±3.18	3.82±0.05	16.81±0.47
	BC₃mF₂	132.59±3.40^*	0.96±0.09^*	10.83±0.92	922.74±110.19	72.30±1.81^*	20.29±3.15	3.94±0.13	17.06±0.97
	Wild B.juncea	155.18±3.31	1.35±0.03	9.75±0.72	1 007.66±38.67	97.07±0.74	21.60±1.18	3.83±0.04	16.08±0.66
	BC₃pF₂	116.77±6.95^*	0.78±0.01^*	8.81±0.54^*	613.23±51.29^*	56.13±4.48^*	12.48±0.83^*	3.78±0.08	15.47±1.13
	Wild B.juncea	127.23±5.11	1.26±0.07	10.75±0.42	882.83±62.36	69.34±5.10	16.09±1.01	3.50±0.02	15.85±0.17
	BC₃mF₃	113.39±1.22	1.06±0.04	11.75±0.27	821.94±33.73	63.01±2.22	16.19±0.91	3.40±0.07	16.79±0.36
	Wild B.juncea	134.78±1.80	1.29±0.04	10.94±0.35	905.74±21.23	62.25±1.27	17.07±0.44	3.47±0.08	15.58±0.26
	BC₃pF₃	127.16±4.73	1.09±0.05	11.86±0.74	969.66±102.51	61.60±6.20	19.84±1.74	3.55±0.14	15.55±0.47
3:2	Wild B.juncea	151.66±7.53	1.31±0.09	10.91±1.20	1 133.14±94.61	95.04±9.31	21.29±1.97	3.83±0.11	16.10±0.28
	BC₃mF₂	127.76±2.29^*	0.95±0.04^*	10.18±0.40	965.27±91.58	68.03±10.98^*	19.00±1.38	3.93±0.14	16.43±0.39
	Wild B.juncea	160.01±2.47	1.43±0.05	11.51±0.50	1 148.20±69.66	101.43±5.56	21.94±0.65	3.78±0.04	16.97±0.19
	BC₃pF₂	132.50±5.77^*	1.00±0.04^*	9.68±0.12^*	729.89±14.40^*	61.17±11.63^*	15.74±1.89^*	3.81±0.12	17.65±0.95
	Wild B.juncea	129.09±4.35	1.25±0.07	10.68±0.52	846.03±102.14	71.30±2.84	17.52±0.66	3.41±0.05	15.42±0.25
	BC₃mF₃	110.64±8.25	1.02±0.10	10.47±0.11	830.01±100.80	66.49±8.30	17.23±1.13	3.53±0.09	15.28±0.16
	Wild B.juncea	132.21±4.68	1.27±0.05	11.68±0.09	904.99±47.80	68.43±3.89	16.70±1.11	3.48±0.06	14.96±0.08
	BC₃pF₃	126.78±3.16	1.13±0.03	10.33±0.51	844.07±47.34	61.35±5.22	16.58±1.29	3.48±0.12	16.02±0.42
1:1	Wild B.juncea	164.95±3.23	1.41±0.04	10.97±0.53	1 184.65±70.68	94.53±7.95	23.99±0.89	4.00±0.18	17.64±0.39
	BC₃mF₂	126.17±3.85^*	0.94±0.05^*	10.86±0.53	984.39±176.30	74.13±18.07^*	20.34±3.22	3.85±0.04	17.34±0.20
	Wild B.juncea	157.13±5.78	1.35±0.08	11.52±0.25	1 061.78±15.26	111.26±8.68	23.19±1.45	3.76±0.05	16.33±0.40
	BC₃pF₂	120.24±4.23^*	0.93±0.07^*	8.60±0.64^*	619.11±102.00^*	52.97±4.11^*	13.01±1.56^*	3.78±0.04	16.26±0.69
	Wild B.juncea	123.62±3.80	1.16±0.02	11.24±0.51	793.92±47.58	68.49±6.90	17.13±0.39	3.57±0.05	15.66±0.49
	BC₃mF₃	117.42±1.28	1.04±0.04	13.02±0.27	908.74±38.22	68.30±2.61	18.04±0.33	3.73±0.05	16.96±0.64
	Wild B.juncea	135.68±4.40	1.28±0.03	12.67±0.27	886.74±126.68	71.26±6.52	16.48±2.15	3.60±0.22	15.36±0.27
	BC₃pF₃	129.53±1.64	1.15±0.04	13.47±0.63	943.24±80.48	73.71±6.63	17.87±1.65	3.41±0.06	15.75±0.17

表选项

当混种比例为3:2时, BC₃mF₂的株高、茎粗和单株干生物量分别显著低于野芥菜23.9 cm、0.3 cm和27 g, 其他性状与野芥菜无显著性差异。BC₃pF₂的株高、茎粗、一次分枝数、单株有效角果数、单株干生物量和单株种子质量分别显著低于野芥菜27 cm、0.4 cm、2、418、40 g和6 g, 其他性状与野芥菜无显著性差异。而BC₃mF₃和BC₃pF₃各适合度性状均与野芥菜无显著性差异(表 4)。

当混种比例为1:1时, BC₃mF₂和BC₃pF₂的株高显著低于野芥菜39和37 cm, 茎粗均显著低于野芥菜0.5 cm, 单株干生物量分别显著低于野芥菜20和58 g。BC₃pF₂的一次分枝数、单株有效角果数和单株种子质量分别为8.6、619.11和13.01 g, 显著低于野芥菜3、443、10 g; BC₃mF₂的一次分枝数、单株有效角果数和单株种子质量与野芥菜无显著性差异。BC₃mF₂和BC₃pF₂的角果长和每角果饱粒数均与野芥菜相当。该种植方式下的BC₃mF₃和BC₃pF₃各适合度性状均与野芥菜无显著性差异(表 4)。

2.3 单种和混种条件下BC₃F₂、BC₃F₃与野芥菜的总适合度比较 2.3.1 单种条件下BC₃F₂、BC₃F₃与野芥菜的总适合度比较

在单种低密度条件下, BC₃mF₂和BC₃pF₂的总适合度均与野芥菜相当, 分别为0.93和0.92;其自交产生的BC₃mF₃和BC₃pF₃在该种植条件下的总适合度也分别达到1.01和0.99, 均与野芥菜没有显著性差异(图 3)。

	图 3 单种条件下BC₃F₂、BC₃F₃与野芥菜的总适合度比较 Figure 3 Composite fitness of wild B.juncea with BC₃F₂ and BC₃F₃ in pure plot
图选项

在单种高密度条件下, BC₃mF₂和BC₃pF₂的总适合度分别为0.92和0.90, 与野芥菜无显著性差异; 其自交产生的BC₃mF₃和BC₃pF₃在该种植条件下的总适合度也分别达到1.00和0.94, 均与野芥菜没有显著性差异(图 3)。由此可见, BC₃F₂和BC₃F₃在单种2种密度下的总适合度均与野芥菜相当。

2.3.2 混种条件下BC₃F₂、BC₃F₃与野芥菜的总适合度比较

低密度条件下, 在混种4:1时, BC₃mF₂和BC₃pF₂的总适合度均显著低于野芥菜, 但也分别高达0.91和0.90, 该种植条件下主要表现为对BC₃F₂的株高和茎粗的影响, 但当种植比例为3:2和1:1时, BC₃mF₂和BC₃pF₂的总适合度与野芥菜无显著性差异, 为0.96~1.01(图 4)。BC₃mF₃和BC₃pF₃在低密度各种种植比例下的总适合度均与野芥菜无显著差异, 为0.96~1.08(图 4)。

	图 4 混种条件下BC₃F₂、BC₃F₃与野芥菜的总适合度比较 Figure 4 Composite fitness of wild B.juncea with BC₃F₂ and BC₃F₃ in mixed planting
图选项

在高密度混种条件下, 各种植比例下的BC₃mF₂和BC₃pF₂的总适合度均显著低于野芥菜, 总适合度为0.73~0.89(图 4)。BC₃mF₃和BC₃pF₃在高密度各种植比例下的总适合度均与野芥菜无显著差异, 总适合度为0.95~1.04(图 4)。这说明:在本试验中BC₃F₃与野芥菜的混种条件下, BC₃F₃的总适合度能够达到与野芥菜相当的水平且不受二者间比例的影响。

2.4 种植密度和混合比例对野芥菜、BC₃F₂和BC₃F₃适合度性状的影响

从表 5可知:种植密度(D)对野芥菜的有效角果数、单株干生物量、单株种子质量等适合度性状有显著影响, 但混合比例(P)及密度与比例的互作(D×P)对其影响不显著; BC₃mF₂的单株干生物量和单株种子质量仅受种植密度的影响, 单株有效角果数受种植密度和比例以及两者间互作的影响; BC₃pF₂的株高和茎粗受密度和比例的影响, 一次分枝数受两者及两者间互作的影响, 单株有效角果数受密度和两者间互作的影响, 单株干生物量和单株种子质量受密度的影响; BC₃mF₃和BC₃pF₃的单株有效角果数、单株干生物量和单株种子质量受密度的影响。由此可见, 种植密度能够显著影响野芥菜、回交3代子1代和回交3代子2代的主要适合度性状, 但回交3代子1代也受种植比例的影响。

表 5 双因素方差分析种植密度(D)和种植比例(P)对野芥菜、BC₃F₂和BC₃F₃各适合度性状的影响 Table 5 Two-way ANOVA for the fitness traits of wild B.juncea, BC₃F₂ and BC₃F₃ in mixed planting

植物种类 Plant type	性状 Fitness traits	种植密度(D)Density			种植比例(P)Proportion			D×P
植物种类 Plant type	性状 Fitness traits	DF	F value	P value	DF	F value	P value	DF	F value	P value
Wild B.juncea	株高Plant height	1	14.71	0.009^*	2	0.49	0.636	2	4.71	0.059
	茎粗Stem diameter	1	26.42	0.002^*	2	1.01	0.419	2	2.63	0.151
	一次分枝数The first branch number	1	26.07	0.002^*	2	1.73	0.255	2	1.80	0.243
	单株有效角果数Silique number per plant	1	7.25	0.036^*	2	1.93	0.225	2	1.54	0.288
	单株干生物量Above-ground dry biomass per plant	1	123.09	0.000^*	2	1.75	0.253	2	0.49	0.634
	单株种子质量Total seed weight per plant	1	11.73	0.014^*	2	0.42	0.673	2	0.32	0.735
	角果长Silique length	1	0.06	0.813	2	1.03	0.414	2	4.53	0.290
	每角果饱粒数Seed number per silique	1	0.00	0.950	2	0.13	0.883	2	1.15	0.377
BC₃mF₂	株高Plant height	1	1.37	0.265	2	1.20	0.335	2	1.35	0.295
	茎粗Stem diameter	1	8.67	0.012^*	2	1.97	0.182	2	2.79	0.101
	一次分枝数The first branch number	1	36.52	0.000^*	2	1.17	0.342	2	2.86	0.096
	单株有效角果数Silique number per plant	1	50.64	0.000^*	2	6.33	0.013^*	2	4.52	0.034^*
	单株干生物量Above-ground dry biomass per plant	1	58.63	0.000^*	2	0.40	0.680	2	1.14	0.351
	单株种子质量Total seed weight per plant	1	14.87	0.002^*	2	0.02	0.984	2	1.21	0.334
	角果长Silique length	1	0.28	0.609	2	0.52	0.608	2	0.14	0.869
	每角果饱粒数Seed number per silique	1	0.57	0.466	2	0.52	0.605	2	1.75	0.216
BC₃pF₂	株高Plant height	1	7.41	0.020^*	2	5.30	0.024^*	2	1.67	0.233
	茎粗Stem diameter	1	20.27	0.001^*	2	9.82	0.004^*	2	2.23	0.154
	一次分枝数The first branch number	1	65.30	0.000^*	2	7.65	0.008^*	2	4.96	0.029^*
	单株有效角果数Silique number per plant	1	134.75	0.000^*	2	2.94	0.095	2	6.60	0.013^*
	单株干生物量Above-ground dry biomass per plant	1	148.69	0.000^*	2	0.97	0.408	2	1.47	0.271
	单株种子质量Total seed weight per plant	1	61.97	0.000^*	2	0.98	0.407	2	0.12	0.892
	角果长Silique length	1	0.28	0.609	2	0.52	0.608	2	0.14	0.869
	每角果饱粒数Seed number per silique	1	0.57	0.466	2	0.52	0.605	2	1.75	0.216
Wild B.juncea	株高Plant height	1	0.01	0.932	2	0.07	0.93	2	0.15	0.863
	茎粗Stem diameter	1	2.17	0.191	2	0.09	0.919	2	2.39	0.173
	一次分枝数The first branch number	1	4.87	0.070	2	0.15	0.867	2	2.13	0.200
	单株有效角果数Silique number per plant	1	16.23	0.007^*	2	0.71	0.528	2	0.09	0.917
	单株干生物量Above-ground dry biomass per plant	1	47.63	0.000^*	2	0.17	0.850	2	0.35	0.718
	单株种子质量Total seed weight per plant	1	16.61	0.007^*	2	0.28	0.764	2	0.36	0.713
	角果长Silique length	1	0.85	0.393	2	1.42	0.314	2	8.20	0.019^*
	每角果饱粒数Seed number per silique	1	7.44	0.034^*	2	4.49	0.064	2	1.67	0.265
BC₃mF₃	株高Plant height	1	0.15	0.705	2	1.17	0.344	2	1.65	0.232
	茎粗Stem diameter	1	2.17	0.167	2	0.98	0.405	2	0.29	0.751
	一次分枝数The first branch number	1	7.85	0.016^*	2	2.59	0.116	2	2.06	0.170
	单株有效角果数Silique number per plant	1	12.34	0.004^*	2	0.96	0.410	2	3.49	0.064
	单株干生物量Above-ground dry biomass per plant	1	24.91	0.000^*	2	1.11	0.362	2	3.38	0.069
	单株种子质量Total seed weight per plant	1	8.69	0.012^*	2	0.73	0.504	2	2.68	0.109
	角果长Silique length	1	0.17	0.690	2	1.60	0.242	2	0.31	0.741
	每角果饱粒数Seed number per silique	1	8.79	0.012^*	2	2.15	0.159	2	0.87	0.444
BC₃pF₃	株高Plant height	1	0.14	0.717	2	0.87	0.442	2	0.52	0.605
	茎粗Stem diameter	1	3.71	0.078	2	1.22	0.330	2	2.23	0.150
	一次分枝数The first branch number	1	0.65	0.435	2	0.85	0.453	2	1.58	0.247
	单株有效角果数Silique number per plant	1	10.20	0.008^*	2	2.50	0.123	2	0.94	0.417
	单株干生物量Above-ground dry biomass per plant	1	9.14	0.011^*	2	0.54	0.597	2	0.25	0.780
	单株种子质量Total seed weight per plant	1	5.97	0.031^*	2	3.06	0.085	2	0.84	0.457
	角果长Silique length	1	1.42	0.257	2	0.03	0.976	2	0.28	0.758
	每角果饱粒数Seed number per silique	1	0.12	0.739	2	0.93	0.423	2	0.37	0.699

表选项

相比每区30株的种植密度, 在每区15株的种植密度下, 野芥菜、BC₃F₂和BC₃F₃的单株有效角果数、单株干生物量、单株种子质量性状呈现增大的趋势, 虽然种植密度能够显著影响适合度的主要性状, 但BC₃F₃不论在高密度还是低密度条件下的总适合度均与野芥菜相当, 说明BC₃F₃已具有与野芥菜相当的生存竞争能力。

3 讨论

适合度是评价抗性基因能否成功渗入的重要因素^[7], 由于环境条件对适合度有显著影响, 因此对适合度的评价要充分考虑环境条件^{[9, 12, 25]}。本试验将BC₃F₂和BC₃F₃与野生亲本野芥菜以不同密度和比例进行种植, 研究了田间条件下BC₃F₂和BC₃F₃的适合度, 研究结果对正确评估抗草甘膦转基因油菜向野芥菜的基因漂移可能导致的生态风险提供了试验依据。

试验结果表明:在单种条件下, 供试的回交3代子1代和子2代的营养生长和生殖生长能力与野芥菜相当, 即使在竞争条件下, 回交3代子1代在低密度混种(3:2和1:1) 条件下以及回交3代子2代在各混种条件下也能和野芥菜具有相似的生存能力, 这说明在单种和竞争的环境条件下, 这些回交后代都能像野芥菜一样生存繁衍后代。如果在抗草甘膦转基因油菜的农田生态系统中, 使用草甘膦进行除草, 野芥菜及其他杂草由于没有抗性基因而无法生存, 但携带抗性基因的回交后代会生存下来, 这些后代给农田杂草防除及生态环境带来的潜在威胁不可忽视。因此抗草甘膦转基因油菜向野芥菜的基因漂移应该引起高度重视。

转基因作物和野生近缘种的杂种F₁代的染色体组通常来源于两亲本, 由于两亲本的染色体组不同, 杂种在减数分裂中染色体不能进行正常的配对和分离, 从而导致F₁代的育性降低甚至高度不育^{[15, 26]}。即使F₁代的适合度降低, 携带抗性基因的F₁代还可与父母本不断的回交, 完成抗性基因渗入^[22]。在转基因油菜与近缘种芜菁的研究中发现尽管F₁和F₂代的适合度较低^{[25, 27-28]}, 但回交后代适合度较F₁和F₂代有明显提高^[27]。

油菜或转基因油菜能与野芥菜发生基因漂移^{[15, 18-19]}。虽然F₁代的花粉育性和结实率都很低, 但F₁可与野芥菜回交; 回交得到回交1代的结实率虽然明显低于野芥菜^[20-21], 但回交2代和3代的结实率能够提高到与野芥菜相当的水平^[22]。这是因为F₁代的染色体组成为AABC, 2n=37。而非整倍体在减数分裂过程中, 因染色体无法正常配对, 导致回交后代的染色体数目不稳定。从理论上讲回交后代的染色体数应该是变化的, 且变化范围介于20(2A)+8(B)+0-8(B)+0-9(C)之间, 最多的染色体数是45条。C染色体由于在减数分裂过程中没有同源染色体配对而在后代中随着代数的增加逐渐丢失^[29]。随着回交次数或自交次数的增加, 回交后代的染色体组成趋向于稳定。本试验中, 在低密度4:1条件下和高密度3个供试比例下, BC₃F₂的总适合度均显著低于野芥菜, 但自交一次产生的后代即BC₃F₃, 单种和混种条件下, 其总适合度均与野芥菜无显著差异。这说明BC₃F₃的适合度本身已达到与野芥菜相当的水平, 不受种植密度和种植比例的影响。由于随着自交次数的增加, 后代的总适合度能够提高到与野芥菜相当的水平。因此在转基因油菜的基因漂移上, 除防范初始杂交的发生外, 还应该防范回交后代及其自交后代的产生。

竞争是作物产量的决定因素。范巧佳等^[30]和朱兆坤等^[31]的研究都表明油菜与产量相关的性状随种植密度的增加而降低。Hauser等^[25]发现甘蓝型油菜与芜菁的杂交及回交后代在低密度条件下的结实量高于高密度下的结实量。Campbell等^[9]的研究表明, 在无竞争的情况下, 野萝卜(Raphanus raphanistru)的结实能力明显大于栽培萝卜(R.sativus)和野萝卜的杂交后代, 但在竞争的条件下, 野萝卜的结实能力显著下降, 从而缩小了杂交后代与野萝卜在生殖适合度上的差异。Hovick等^[12]的研究表明, 在竞争条件下, 野萝卜和栽培萝卜的杂交后代产生种子的量是野萝卜的3倍。这些都说明种植密度对后代适合度有显著影响。本试验发现，种植密度对野芥菜、BC₃F₂和BC₃F₃的单株有效角果数、单株干生物量、单株种子质量都有显著影响, 其中3:2和1:1条件下, 与低密度相比, 高密度下BC₃F₂的适合度显著下降。因此在田间或野外环境存在竞争的情况下, 携带抗性基因的BC₃F₂的生存竞争能力较弱。

Hauser等^[25]发现甘蓝型油菜与芜菁的回交后代在单种时的结实量显著高于混种时, 在混种时的种植比例相对提高后, 其结实量也有所增加, 说明种植比例影响回交后代的适合度。本试验中, 混种比例影响BC₃F₂的总适合度。在单种无种间竞争的条件下, BC₃F₂的总适合度与野芥菜相当, 但在混种4:1的竞争条件下, BC₃F₂的总适合度显著低于野芥菜; 另外在低密度条件下, 当BC₃F₂的混种比例由4:1提高到3:2或1:1时, BC₃F₂的总适合度提高到与野芥菜相当的水平。经分析, 种植比例对BC₃mF₂的单株有效角果数和BC₃pF₂的株高、茎粗及一次分枝数有显著影响。可见种植比例对BC₃F₂的总适合度有明显影响。而BC₃F₃各适合度性状均不受种植比例的影响, 且各种种植条件下的总适合度均与野芥菜相当。因此本试验结果说明与亲本的混种比例对不同回交后代的影响不同。由于BC₃F₂通过一次自交产生的BC₃F₃的适合度不受混种比例的影响, 在各条件下已具备与野芥菜相当的生存竞争能力, 因此可能造成的生态风险明显增加。尽管BC₃F₂的适合度相对较低, 其适合度依然能够达到0.73以上, 平均单株能够产生的种子数量约1万粒, 因此BC₃F₂可能造成的生态风险也应引起重视。

转基因作物与野生近缘种间杂交及回交后代的适合度受多种因素的影响, 包括亲本的基因组组成和基因型、后代染色体的遗传稳定性以及试验环境条件等因素, 因此对适合度的研究要从多方面因素考虑^{[9-10, 25, 32-33]}。而不同转基因油菜和不同近缘种的后代在不同环境条件下的适合度都可能有差别^{[21, 25]}。因此在进行基于基因漂移的生态风险评估时应遵循转基因作物安全性评估的个案原则, 综合考虑转基因类型、转基因植物的种植环境等情况进行评估。

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