西式火腿是原料肉经过腌制、滚揉、杀菌以及冷却等工艺生产的一类西式肉制品。因其瘦肉含量较高, 口感脆嫩, 而深受消费者喜爱^[1]。西式肉制品属于低温肉制品的一种, 通常采用热水或热蒸汽的加热方式进行巴氏杀菌。在这些传统的加热方法中, 热量从加热介质流向肉制品表面, 然后传递到肉制品的内部。由于这种热传递自身特性等原因, 在肉制品内部达到要求的温度时, 肉制品外部区域有时处于过度蒸煮状态^[2]。因此, 传统的热水和蒸煮加热往往会导致肉制品的品质变差, 营养价值降低。相反地, 射频加热和微波加热可以对物体整体加热, 相对传统的加热方法加热也更加均匀, 并能有效地缩短加热时间, 减少过度蒸煮现象的发生, 从而提高产品的质量和营养价值^[3]。因此, 射频加热是一种非常有潜力的可以替代传统加热的加工方法。射频加热是利用低频率 (27.12 MHz) 的入射电磁波对食品整体加热的方法。由于射频波的波长较微波更长, 对加热物体的穿透力较强, 更容易穿透到加热物体的内部, 所以具有升温快, 低能耗等优点。重要的是射频波较微波具有更均匀的电磁场分布, 对物体整体加热也更加均匀, 因此可以避免蒸煮加热等传统加热方式因加热不均匀导致的产品品质的劣变^[4]。此外, 与微波加热方法相比, 射频加热具有节约投资成本的优势, 因此射频加热在农产品热加工领域具有巨大的发展潜力。研究发现, 采用射频加热加工整块牛肉、碎牛肉、牛肉糜, 加工时间可以缩短约90%^[5]。

到目前为止, 射频加热对肉制品品质特性的影响已经有相关报道^[6]。然而, 前期的研究主要集中在射频加热对肉制品品质特性的影响方面。研究发现射频加热可以缩短加热时间, 降低蒸煮损失, 赋予肉制品良好的保水性和质构特性^{[5, 7-8]}。肌原纤维蛋白的化学和结构特性对肉制品品质具有决定性的影响^[9]。然而射频加热对肌原纤维蛋白的化学和结构特性的影响还鲜有探究。射频加热处理中, 肌原纤维蛋白的特性与肉制品品质特性之间的关系没有得到阐明, 射频加热对肉制品品质的影响机制尚不清楚。

因此, 本研究以西式火腿为研究对象, 经过射频加热和蒸煮加热处理后, 分析西式火腿的品质特性及其肌原纤维蛋白的化学特性和结构特性, 并探究肌原纤维蛋白特性与西式火腿品质特性之间的关系, 从而揭示射频加热影响西式火腿品质特性的机制。

新鲜猪肉购于陕西省杨凌本香集团。盐酸、2, 4-二硝基苯肼和5, 5′-二硫代双-2-硝基苯甲酸购于Sigma公司。三氯乙酸、β-巯基乙醇、氢氧化钠、甲醇、乙酸、磷酸二氢钠、磷酸氢二钠、氯化镁、氯化钾、氯化钠和EDTA购于国药集团化学试剂公司。所有试剂均为分析纯。

GF-6A-27-JY型射频加热系统 (额定功率为6 kW, 频率为27.12 MHz) 购于河北华氏纪元高频设备有限公司; DDZXL-150电自动蒸薰炉购自沈阳市宏达食品机械厂; IKA-Utlea-turrax T-18匀浆器购于德国BRAUN公司; 湘仪2050R冷冻离心机购于湖南湘仪公司; UV-1800紫外分光光度计购于日本岛津公司; BZBJ-5斩拌机中购于杭州艾博科技工程有限公司; TA.XT Plus物性测试仪购于英国SMSTA公司。

参照Feng等^[10]和孙卫青等^[11]的方法并稍作修改。西式火腿主要原料为80%的猪肉和20%的水。将猪肉和冰屑 (一半水的量) 放入斩拌机中进行斩拌, 然后, 添加20 g·L^-1的食盐、0.3 g·L^-1的抗坏血酸、0.1 g·L^-1的亚硝酸钠和另一半的水, 斩拌5 min。肉糜低温腌制24 h后, 灌装到塑料肠衣中 (直径85 mm, 长约为20 cm)。将灌装好的西式火腿随机分成2组, 分别采用射频加热和蒸煮加热的方式加热。当西式火腿中心温度达到74 ℃时, 采用流水冷却6 h, 然后低温冷藏。

加热前, 称量样品的初始质量m₁(包括肠衣)。流水冷却后, 打开塑料肠衣, 用滤纸轻轻擦拭清除西式火腿和肠衣表面的汁液, 称量最终质量m₂(包括肠衣)。蒸煮得率=m₂/m₁×100%。

将西式火腿中间部位修成1.5 cm高的圆柱体。室温下, 使用质构仪的TPA模式测定西式火腿的硬度和弹性。参数设置为:测前速度为2 mm·s^-1, 测中速度为1 mm·s^-1, 测后速度为2 mm·s^-1; 压缩比为30%;2次下压间隔时间为5 s; 触发力为2 g; 探头型号为P/50;样品数据收集率为200点·s^-1。

肌原纤维蛋白的提取采用前述的方法^{[10, 12-13]}, 并稍作修改。准确称取6 g样品, 加入30 mL提取液A[20 mmol·L^-1 PBS (pH7.0), 150 mmol·L^-1 NaCl, 25 mmol·L^-1 KCl, 3 mmol·L^-1 MgCl₂, 4 mmol·L^-1 EDTA]后匀浆30 s, 2 000 g离心15 min, 去上清液。重复上述操作一次。沉淀中加入20 mL提取液B[20 mmol·L^-1 PBS (pH7.0), 100 mmol·L^-1 NaCl]后匀浆30 s, 2 000 g离心15 min, 去上清液。沉淀中加入30 mL提取液C (20 mmol·L^-1 PBS, pH6.0) 后匀浆30 s, 500 g离心15 min, 去上清液。重复此步骤一次。得到的沉淀用含0.6 mol·L^-1NaCl的20 mmol·mL^-1 PBS (pH6.5) 溶解, 双缩脲法测定蛋白浓度后, 于4 ℃保存备用。

蛋白羰基含量按照Oliver等^[14]的方法进行测定, 并稍作修改。将得到的肌原纤维蛋白溶液调整为5 mg·mL^-1。每个样品准备2个试管 (2 mL), 每管含有0.5 mL的肌原纤维蛋白溶液, 然后加入1 mL 20%三氯乙酸。离心后, 弃掉上清液, 保留沉淀。其中一管作为对照管, 向其中加入1 mL 2 mol·L^-1 HCl; 另外一管作为测定管, 而向其中加入1 mL 0.2% 2, 4-二硝基苯肼。常温避光振荡1 h。向各管中加入0.5 mL 20%三氯乙酸, 离心保留沉淀。然后用乙醇-乙酸乙酯 (体积比为1:1) 洗涤沉淀2次。加入1 mL盐酸胍溶液溶解沉淀, 利用紫外分光光度计测定365 nm下溶液的吸光值。溶液的蛋白质浓度采用考马斯亮蓝法进行测定。羰基的摩尔吸光系数22 000 mol^-1·cm^-1。羰基含量单位为μmol·g^-1。

肌原纤维蛋白的巯基含量参照Chen等^[15]的方法测定, 并稍作修改。吸取0.5 mL肌原纤维蛋白溶液 (5 mg·mL^-1) 作为测定组, 吸取0.5 mL 20 mmol·L^-1 PBS作为空白对照。向样品中加入1 mL mol·L^-1尿素溶液, 然后加入5, 5-二硫代双-2-硝基苯甲酸 (DTNB), 室温避光振荡15 min, 测定412 nm下溶液的吸光值。巯基的摩尔吸光系数13 600 mol^-1·cm^-1。巯基含量单位为μmol·g^-1。

二硫键含量的测定参照Chen等^[15]的方法。

取50 μL 5 mg·mL^-1的肌原纤维蛋白溶液, 加入1 mL的邻苯二甲醛试剂 (0.8 mg·mL^-1邻苯二甲醛, 50 mmol·L^-1四硼酸钠), 充分混匀, 放置5 min后, 测定340 nm下的吸光值。以L-亮氨酸为标准品, 绘制标准曲线。游离胺基的含量单位为μmol·g^-1。

肌原纤维蛋白的表面疏水性采用Chen等^[15]的方法, 用溴酚蓝作为指示剂进行分析。蛋白上清液中游离的溴酚蓝含量采用分光光度法在595 nm波长处测定。空白对照为PBS缓冲液。疏水性采用被蛋白结合溴酚蓝的量来表示, 计算公式如下:结合溴酚蓝的量 (μg)=40×(D_对照-D_样品)/D_对照。

采用SPSS 20.0软件进行。采用One-way ANOVA进行方差分析, 然后用皮尔逊相关系数、降维和LSD法分别进行了相关分析、主成分分析和多重比较。试验重复3次, 数据表示形式为均值±标准差 (x±SD)。

由图 1-A可见:射频加热组西式火腿的蒸煮得率为97.0%, 极显著高于蒸煮加热组 (P < 0.01)。说明射频加热有利于西式火腿良好品质的形成, 与蒸煮加热相比显著提高了西式火腿的持水性。射频加热处理组西式火腿的硬度为25.86 N, 极显著低于蒸煮加热处理组 (图 1-B), 而2种加热方式对西式火腿弹性的影响无显著差异 (图 1-C)。

	图 1 射频加热和蒸汽加热对西式火腿蒸煮得率 (A)、硬度 (B) 和弹性 (C) 的影响 Figure 1 Effects of radio frequency heating and steam heating on cooking yield (A), hardness (B) and springiness (C) of myofibrillar proteins from hams **P < 0.01. The same as follows.
图选项

射频加热处理组西式火腿中肌原纤维蛋白羰基含量为7.83 μmol·g^-1, 极显著低于蒸煮加热组 (图 2-A)。这表明射频加热与蒸煮加热相比可以显著阻止蛋白质羰基的形成。射频加热组西式火腿中肌原纤维蛋白游离胺基含量极显著高于蒸煮加热组 (图 2-B)。说明射频加热可以显著抑制游离胺基向羰基的转变。游离胺基的变化结果也可以被羰基的变化结果所证明。相关性分析表明羰基含量与游离胺基含量呈极显著负相关, 相关性系数 (r) 为-0.832(表 1)。

	图 2 射频加热和蒸煮加热对西式火腿中肌原纤维蛋白羰基 (A) 和游离胺基 (B) 含量的影响 Figure 2 Effects of radio frequency heating and steam heating on carbonyl (A) and free amine (B) content of myofibrillar proteins from hams
图选项

由图 3可见:射频加热处理组西式火腿中肌原纤维蛋白巯基含量极显著高于蒸煮加热处理组, 而肌原纤维蛋白二硫键含量则极显著低于蒸煮加热处理组。这说明射频加热显著抑制了巯基向二硫键的转变。相关性分析表明巯基含量与二硫键含量呈显著负相关 (表 1)。比较巯基和二硫键的变化趋势可以发现, 减少的巯基并未完全转变为二硫键。这可能是由于一部分巯基转变成了含硫衍生物, 而无法被还原^[16]。

	图 3 射频加热和蒸煮加热对西式火腿中肌原纤维蛋白巯基 (A) 和二硫键 (B) 含量的影响 Figure 3 Effects of radio frequency heating and steam heating on sulfhydryl (A) and disulfide bond (B) content of myofibrillar proteins from hams
图选项

由图 4可见:射频加热处理组西式火腿中肌原纤维蛋白的表面疏水性为19.94 μg·mg^-1, 而蒸煮加热处理组为27.89 μg·mg^-1。这说明射频加热处理对西式火腿中肌原纤维蛋白的变性程度显著低于蒸煮加热处理。蒸煮加热处理显著破坏了肌原纤维蛋白的结构, 使蛋白过度解折叠, 疏水基团大量暴露, 疏水性升高。

	图 4 射频加热和蒸煮加热对西式火腿中肌原纤维蛋白表面疏水性的影响 Figure 4 Effects of radio frequency heating and steam heating on surface hydrophobicity of myofibrillar proteins from hams
图选项

相关性分析发现蒸煮得率与肌原纤维蛋白羰基含量、二硫键含量和表面疏水性均呈极显著负相关。而蒸煮得率与游离胺基含量、巯基含量呈极显著正相关, 相关系数分别为0.949和0.957(表 1)。西式火腿的硬度与羰基含量和二硫键含量呈极显著正相关, 与表面疏水性呈显著正相关 (P < 0.05)。将测定的各指标的数值进行主成分分析, 发现第一主成分和第二主成分的贡献率达到了96.93%。利用第一主成分作为横坐标, 第二主成分作为纵坐标作图, 所有的品质特性、化学特性以及结构特性均与第一主成分具有显著关联 (图 5)。

	图 5 主成分分析图 Figure 5 Principal component analysis plot
图选项

加工过程中, 肉制品中的蛋白质非常容易受氧自由基的攻击, 从而改变蛋白质的化学性质和结构特性^[17]。肌原纤维蛋白的化学和结构特性对肉制品质构特性具有决定性作用^[10]。目前, 几乎所有的肉制品都需要经过加热熟制之后才会被食用。然而, 加热处理过程会产生自由基, 降低肉制品自身的抗氧化保护作用^[10]。在自由基攻击和加热处理的双重作用下, 肉制品中蛋白质的化学和结构特性会发生改变^[18], 进而影响肉制品的品质特性^[19]。肌原纤维蛋白被过度氧化修饰会使肉制品的品质变差。

本试验中, 射频加热处理组西式火腿中肌原纤维蛋白的羰基含量显著低于蒸煮加热处理组, 而其巯基和游离胺基却显著高于蒸煮加热处理组, 说明射频加热处理组西式火腿中肌原纤维蛋白的氧化程度较蒸煮加热处理组低。相关分析发现蒸煮得率与肌原纤维蛋白游离胺基含量、巯基含量呈极显著正相关, 与羰基含量、二硫键含量和表面疏水性呈显著负相关, 即低水平的氧化修饰有利于形成质量相对较好的蛋白凝胶结构。这可能是射频加热处理组西式火腿的蒸煮得率极显著增加的原因。射频加热处理组西式火腿与蒸煮加热处理组西式火腿相比硬度较低, 而弹性无显著差异^[3]。蒸煮加热处理组西式火腿中肌原纤维蛋白二硫键交联极显著增加, 表面疏水性极显著增高。二硫键和疏水力是维持蛋白凝胶的主要作用力^[20], 大量的二硫键形成以及显著较高的疏水力会引起凝胶内部的作用力增强, 导致蒸煮加热处理组西式火腿的硬度显著较高。此外, 蒸煮加热处理组西式火腿中肌原纤维蛋白的羰基含量极显著增高, 表明肌原纤维蛋白可能发生了过度氧化, 从而导致蛋白的聚集进而提高了西式火腿的硬度^[20]。而射频加热组肌原纤维蛋白的羰基含量、二硫键和疏水力与蒸煮加热组相比极显著降低, 所以射频加热组西式火腿硬度显著降低。相关分析发现西式火腿的硬度与羰基含量、二硫键和表面疏水性呈显著正相关。主成分分析发现西式火腿所有的品质特性、化学特性以及结构特性均与第一主成分呈显著相关, 说明2种加热方式得到的西式火腿在质构特性以及肌原纤维蛋白特性方面有显著差异。

总之, 新型的射频加热方式对加热物体的穿透力强, 具有加热均匀, 升温快, 低能耗等优点, 从而避免了蒸煮加热等传统加热不均匀导致的产品品质劣变。射频加热方式与传统的蒸煮加热方式相比, 有利于降低肌原纤维蛋白的氧化程度, 进而有助于提高西式火腿的保水性, 并改善西式火腿的质构特性, 因此在肉制品加工领域具有巨大的发展潜力和光明的应用前景。