文章信息
- 黄强, 白凯文, 徐稳, 何进田, 张莉莉, 周乐, 王恬
- HUANG Qiang, BAI Kaiwen, XU Wen, HE Jintian, ZHANG Lili, ZHOU Le, WANG Tian
- 日粮添加亮氨酸对宫内发育迟缓断奶仔猪小肠葡萄糖吸收和能量代谢的影响
- Effects of leucine supplementation on the small intestinal glucose absolution and energy metabolism in weanling piglets with intrauterine growth retardation
- 南京农业大学学报, 2017, 40(2): 339-345
- Journal of Nanjing Agricultural University, 2017, 40(2): 339-345.
- http://dx.doi.org/10.7685/jnau.201602030
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文章历史
- 收稿日期: 2016-02-25
碳水化合物是动物体内的重要营养物质, 具有提供能量、构成细胞骨架等生物学功能, 在体内转化为葡萄糖、果糖、半乳糖等单糖后被肠道上皮细胞吸收利用。仔猪小肠黏膜对葡萄糖的吸收主要依赖于两种类型的转运机制, 包括钠/葡萄糖共转运载体1(sodium/glucose cotransporter 1, SGLT1) 的主动转运和葡萄糖转运载体2(glucose transporter 2, GLUT2) 的被动转运[1-2]。研究发现SGLT1是一种糖基化蛋白, 在肠道中通过主动转运形式大量吸收D-葡萄糖以及激活蛋白激酶C (protein kinase C, PKC) 依赖性通路来调节GLUT2对葡萄糖的转运[2-3], 而且SGLT1作为一种Na+依赖性转运载体, 需要靠Na+/K+-ATP酶来维持细胞内外Na+浓度梯度[4]。
近年来, 商业化养猪模式的推广一定程度上提高了母猪的窝产仔数, 但也造成了动物营养的不平衡, 大约有15%~20%的新生仔猪受到宫内发育迟缓 (intrauterine growth retardation, IUGR) 的影响[5]。流行病学研究表明, IUGR幼年动物易出现低血糖、低血钙、酸中毒和胰岛素抵抗等综合征, 并对体内的葡萄糖吸收和能量代谢造成不利影响[6-7]。因此, 研究IUGR仔猪小肠的葡萄糖吸收和能量代谢等问题, 对于了解IUGR仔猪的营养吸收有重要理论意义。亮氨酸是哺乳动物体内必需的支链氨基酸, 维持小肠绒毛结构和功能完整性, 参与机体多种代谢过程, 是蛋白质合成代谢的底物[8]和合成谷氨酰胺的前体[9], 对葡萄糖吸收和能量代谢起着重要调控作用[10]。亮氨酸作为饲料添加剂, 已在畜牧生产中广泛应用。有研究报道, 日粮添加亮氨酸可以改善IUGR断奶仔猪生产性能, 提高肌肉合成代谢能力[11]; 适当添加亮氨酸可以促进哺乳仔猪小肠发育, 提高消化吸收能力[12]; 亮氨酸能通过胰岛素依赖机制促进骨骼肌中葡萄糖的转运, 增强葡萄糖的摄取能力[13]。但迄今, 有关亮氨酸应用的研究主要集中于动物的免疫和蛋白质合成与代谢方面, 对仔猪小肠葡萄糖吸收和能量代谢的研究, 特别是对IUGR仔猪影响的研究报道很少。本试验以自然发生的IUGR断奶仔猪为研究对象, 日粮添加0.35%亮氨酸, 探讨其对小肠葡萄糖吸收和能量代谢的影响。
1 材料与方法 1.1 试验材料本试验在上海新农饲料股份有限公司的朱行养殖场进行, 选用杜洛克×长白×大白三元杂交猪为试验对象。试验添加剂L-亮氨酸 (L-leucine), 购于美国Sigma-Aldrich公司, 纯度为98.0%。
1.2 试验设计选取品种相同 (长白×大白)、胎次接近、配种时间一致的母猪16头, 在母猪发情后由同一头杜洛克公猪的稀释精液进行人工授精。妊娠期间母猪饲养于限位栏内, 日粮配制参照NRC (2012) 妊娠母猪的营养需要。母猪分娩[(114±1) d]时记录每头仔猪初生体质量, 选择16窝新生仔猪, 每窝选择1头正常初生体质量[normal birth weight, NBW, 体质量 (1.52±0.06) kg]的新生仔猪和1头同性别的IUGR[体质量 (0.87±0.04) kg]新生仔猪。所有新生仔猪随母猪哺乳至14日龄断奶, 然后分别饲喂基础日粮或亮氨酸日粮 (基础日粮+0.35% L-亮氨酸) 并随机分为4组, 即NC (NBW+基础日粮)、NL (NBW+亮氨酸日粮)、IC (IUGR+基础日粮)、IL (IUGR+亮氨酸日粮), 每组8个重复, 每个重复1头猪。基础日粮配制参照NRC (2012) 断奶仔猪的营养需要, 其组成及营养水平见表 1。L-亮氨酸添加量参照前人研究结果[8, 11]。试验猪每重复饲养于一栏, 每猪平均占有圈舍0.6 m2, 自由采食和饮水, 每天清扫和消毒猪舍, 猪舍温度和相对湿度分别控制在25~28 ℃和50%~70%。试验期间断牙、断尾、去势、常规补铁与免疫等均按照猪场相关规程操作, 饲养管理严格执行卫生防疫制度。
| % | ||||||
| 原料组成 Ingredient |
基础日粮水平 Basal diet level |
亮氨酸日粮水平 Leucine diet level |
营养组成2) Nutrient composition |
基础日粮水平 Basal diet level |
亮氨酸日粮水平 Leucine diet level |
|
| 玉米Corn | 40.00 | 39.65 | 赖氨酸Lysine | 1.45 | 1.45 | |
| 米Rice, broken | 15.00 | 15.00 | 蛋氨酸+胱氨酸Methionine+cystine | 0.79 | 0.79 | |
| 发酵豆粕Soybean meal, fermented | 10.00 | 10.00 | 苏氨酸Threonine | 0.81 | 0.81 | |
| 去皮豆粕Soybean meal, dehulled | 6.00 | 6.00 | 色氨酸Tryptophan | 0.23 | 0.23 | |
| 血浆豆粕Spray-dried animal plasma | 5.00 | 5.00 | 异亮氨酸Isoleucine | 0.74 | 0.74 | |
| 乳清粉Whey powder | 7.00 | 7.00 | 缬氨酸Valine | 0.89 | 0.89 | |
| 鱼粉Fish meal | 4.00 | 4.00 | 亮氨酸Leucine | 1.45 | 1.80 | |
| 白糖Sugar | 4.50 | 4.50 | 粗蛋白Crude protein | 20.20 | 20.20 | |
| 葡萄糖Glucose | 3.00 | 3.00 | 钙Calcium | 0.85 | 0.85 | |
| 大豆油Soybean oil | 1.50 | 1.50 | 总磷Total phosphorus | 0.70 | 0.70 | |
| L-亮氨酸L-leucine | 0.00 | 0.35 | 消化能3)Digestible energy | 14.23 | 14.23 | |
| L-赖氨酸盐酸盐L-lysine-HCl (98%) | 0.30 | 0.30 | ||||
| L-蛋氨酸L-methionine | 0.15 | 0.15 | ||||
| L-苏氨酸L-threonine | 0.20 | 0.20 | ||||
| L-色氨酸L-tryptophan | 0.05 | 0.05 | ||||
| L-异亮氨酸L-isoleucine | 0.05 | 0.05 | ||||
| L-缬氨酸L-valine | 0.05 | 0.05 | ||||
| 氯化钠NaCl | 0.30 | 0.30 | ||||
| 石粉Limestone | 1.10 | 1.10 | ||||
| 磷酸氢钙CaHPO4 | 0.80 | 0.80 | ||||
| 预混料1)Premix | 1.00 | 1.00 | ||||
| 注:1) 预混料为每千克饲料提供:铁170 mg, 铜150 mg, 锌150 mg, 镁68 mg, 锰80 mg, 硒0.2 mg, 钴0.3 mg, 碘0.90 mg, 维生素A 15 000 IU, 维生素D3 3 000 IU, 维生素E 150 mg, 维生素B1 3 mg, 维生素B2 6 mg, 维生素B6 5 mg, 维生素B12 0.03 mg, 烟酸45 mg, 维生素C 250 mg, 泛酸钙9 mg, 叶酸1 mg, 生物素0.3 mg, 氯化胆碱500 mg; 2) 粗蛋白、钙和磷是实测值, 其他营养成分是计算值; 3) 消化能单位是MJ·kg-1。 Note:1) The premix provided the following per kg of diets:Fe 170 mg, Cu 150 mg, Zn 150 mg, Mg 68 mg, Mn 80 mg, Se 0.2 mg, Co 0.3 mg, I 0.90 mg, vitamin A 15 000 IU, vitamin D3 3 000 IU, vitamin E 150 mg, vitamin B1 3 mg, vitamin B2 6 mg, vitamin B6 5 mg, vitamin B12 0.03 mg, niacin 45 mg, vitamin C 250 mg, calcium pantothenate 9 mg, folic acid 1 mg, biotin 0.3 mg, choline chloride 500 mg. 2) The nutrient contents of crude protein, calcium, and phosphorus were the analyzed values, the contents of other nutrient were calculated values. 3) The unit of digestible energy is MJ·kg-1. |
||||||
试验结束时 (35 d), 对所有试验猪空腹称活体质量, 颈部肌肉注射戊巴比妥钠 (50 mg·kg-1) 麻醉后放血致死, 迅速剖开腹腔, 取出空肠, 剔除肠道表面肠系膜和淋巴结, 挤净食糜后, 用少量预冷的磷酸盐缓冲液冲洗肠腔, 用灭菌的载玻片刮取黏膜并装入1.5 mL无菌冻存管中, 立即放入液氮速冻, -80 ℃冰箱保存供后期试验分析。
1.4 测定指标 1.4.1 肠道黏膜葡萄糖吸收和糖酵解关键酶指标及ATP含量测定取空肠黏膜制备10%组织匀浆液。匀浆上清液中总蛋白含量采用BCA (bicinchoninic acid assay) 法[14]测定, 碱性磷酸酶 (AKP)、Na+/K+-ATP酶、己糖激酶 (HK)、丙酮酸激酶 (PK) 活性和三磷酸腺苷 (ATP) 含量采用南京建成生物技术研究所试剂盒测定。
1.4.2 空肠黏膜线粒体中能量代谢关键酶指标测定采用Zhang等[15]的方法提取空肠黏膜中线粒体, BCA法测定总蛋白含量, 苹果酸脱氢酶 (MDH) 和琥珀酸脱氢酶 (SDH) 活性采用南京建成生物技术研究所试剂盒测定。
1.4.3 总RNA提取及目的基因表达量的测定总RNA的提取和cDNA的制备:用Trizol试剂 (TaKaRa, 大连) 提取空肠黏膜中总RNA, 10 g·L-1琼脂糖凝胶电泳检查RNA的完整性。使用Thermo Nano Drop 2000超微量可见光分光光度计测定总RNA质量浓度和纯度, 并用0.1% DEPC水稀释到500 ng·μL-1。稀释后的RNA采用20 μL反转录反应体系, 用TaKaRa的反转录试剂盒说明书的方法和步骤进行测定。反转录的反应条件:37 ℃ 15 min; 85 ℃ 5 s。反转录产物 (cDNA) 保存于-20 ℃备用。基因引物序列见表 2。
| 基因 Gene |
引物对序列 (5′→3′) Primer pairs sequence |
产物长度/bp Product length |
| SGLT1 | GGAAGTCCACTCAGTCGGATG/TTATAGGAAGTGGCCGAACCAG | 167 |
| GLUT2 | AATTCCAGCTACCGACAGCC/TAGCGCCAACTCCAATGGTT | 154 |
| AMPK-α1 | GCATAGTTGGGTGAGCCACA/CCTGCTTGATGCACACATGA | 105 |
| PK | GAGGAGTCTTCCCTGTGCTCTAC/GCCACGGAGTTTTCCGCTTTCGA | 104 |
| mTOR | AGCCTTCGTCTATGACCCCT/CGGCAGAGTAGGAATCCGTC | 98 |
| β-actin | TCATGGACTCTGGGGATGGG/GCAGCTCGTAGCTCTTCTCC | 273 |
以β-actin作为内参基因, 采用20 μL RT-qPCR反应体系:SYBR 10 μL, Rox Reference Dye (50×)0.4 μL, 上、下游引物各0.4 μL, DEPC水6.8 μL, cDNA模板2 μL。qPCR反应程序为:95 ℃ 30 s, 95 ℃ 5 s, 60 ℃31 s, 40个循环。每个样品均先预试。使用ABI (Applied biosystems) 软件检测相关基因表达, 用2-ΔΔCT法计算各目的基因的相对表达量[16]。
1.5 数据统计分析试验数据用平均值±标准误 (x±SE) 表示。数据的统计分析使用SPSS 18.0软件, 用GLM模型和Two-way ANOVA中的Duncan′s法进行差异显著性检验, 比较主因素 (仔猪与日粮) 及其交互作用对仔猪小肠葡萄糖吸收和能量代谢指标的影响[17]。
2 结果与分析 2.1 亮氨酸对IUGR仔猪空肠AKP和Na+/K+-ATP酶活性的影响由表 3可知:与NBW仔猪相比, IUGR仔猪空肠AKP和Na+/K+-ATP酶活性显著下降 (P < 0.05)。在日粮中添加亮氨酸后, IUGR仔猪空肠AKP活性显著升高 (P < 0.05), 且Na+/K+-ATP酶活性有升高的趋势 (P=0.062)。另外, 仔猪与日粮对其空肠AKP和Na+/K+-ATP酶活性的影响均不存在交互作用 (P>0.10)。
| 项目 Item |
组别Groups | 标准误 SE |
P值P-value | |||||
| NC | NL | IC | IL | 仔猪Piglet | 日粮Diet | 互作Interaction | ||
| AKP活性/(U·g-1) AKP activity | 58.437 | 60.743 | 46.223 | 55.207 | 1.658 | 0.002 | 0.039 | 0.207 |
| Na+/K+-ATP酶活性/(μmol·mg-1·h-1) Na+/K+-ATPase activity |
1.780 | 1.801 | 1.145 | 1.590 | 0.075 | 0.002 | 0.062 | 0.101 |
| 注:NC:正常初生体质量 (NBW) 仔猪饲喂基础日粮Normal birth weight (NBW) piglets fed with basal diet; NL:NBW仔猪饲喂亮氨酸日粮NBW piglets fed with leucine diet; IC:IUGR仔猪饲喂基础日粮IUGR piglets fed with basal diet; IL:IUGR仔猪饲喂亮氨酸日粮IUGR piglets fed with leucine diet. The same as follows. | ||||||||
从表 4可以看出:与NBW仔猪相比, IUGR仔猪空肠ATP含量、PK活性和线粒体MDH活性显著下降 (P < 0.05), 但对空肠HK活性和线粒体SDH活性影响不显著 (P>0.10)。在日粮中添加亮氨酸后, IUGR仔猪空肠线粒体MDH和SDH活性显著升高 (P < 0.05), 且空肠ATP含量有升高的趋势 (P=0.097)。另外, 仔猪与日粮对其空肠代谢相关指标的影响均不存在交互作用 (P>0.10)。
| 项目 Item |
组别Groups | 标准误 SE |
P值P-value | |||||
| NC | NL | IC | IL | 仔猪Piglet | 日粮Diet | 互作Interaction | ||
| 空肠Jejunum | ||||||||
| 三磷酸腺苷含量/(μmol·g-1) ATP content | 77.154 | 83.372 | 63.349 | 73.299 | 2.642 | 0.018 | 0.097 | 0.692 |
| 丙酮酸激酶活性/(U·g-1) PK activity | 236.549 | 210.387 | 189.347 | 196.850 | 6.140 | 0.009 | 0.382 | 0.122 |
| 己糖激酶活性/(U·g-1) HK activity | 72.128 | 67.450 | 65.330 | 74.208 | 2.338 | 0.997 | 0.664 | 0.170 |
| 空肠线粒体Jejunal mitochondria | ||||||||
| 苹果酸脱氢酶活性/(U·mg-1) MDH activity | 1.621 | 1.756 | 1.229 | 1.686 | 0.065 | 0.044 | 0.012 | 0.152 |
| 琥珀酸脱氢酶活性/(U·mg-1) SDH activity | 10.709 | 11.803 | 9.204 | 11.571 | 0.369 | 0.209 | 0.016 | 0.354 |
| Note:ATP:Adenosine triphosphate; PK:Pyruvate kinase; HK:Hexokinase; MDH:Malate dehydrogenase; SDH:Succinate dehydrogenase | ||||||||
由表 5可以看出:与NBW仔猪相比, IUGR仔猪空肠SGLT1(P=0.083)、PK(P=0.071) mRNA表达量有降低的趋势, AMPK-α1、mTOR mRNA表达量显著降低 (P < 0.05), 但GLUT2 mRNA表达量变化不显著 (P>0.10)。在日粮中添加亮氨酸后, IUGR仔猪空肠SGLT1、GLUT2、AMPK-α1、mTOR mRNA表达量显著升高 (P < 0.05), 而PK mRNA表达量无显著变化 (P>0.10)。另外, 仔猪与日粮对其空肠SGLT1、mTOR基因表达量的影响存在交互作用 (P < 0.05)。
| 基因 Gene |
基因表达量Expression level of mRNA | 标准误 SE |
P值P-value | |||||
| NC | NL | IC | IL | 仔猪Piglet | 日粮Diet | 互作Interaction | ||
| SGLT1 | 0.789b | 0.806b | 0.583a | 0.849b | 0.028 | 0.083 | 0.004 | 0.010 |
| GLUT2 | 0.763 | 0.886 | 0.689 | 0.842 | 0.027 | 0.255 | 0.010 | 0.771 |
| AMPK-α1 | 1.046 | 1.103 | 0.760 | 1.015 | 0.042 | 0.013 | 0.035 | 0.165 |
| PK | 0.672 | 0.666 | 0.569 | 0.626 | 0.019 | 0.071 | 0.508 | 0.413 |
| mTOR | 1.155b | 1.323b | 0.880a | 1.182b | 0.065 | < 0.01 | < 0.01 | 0.017 |
| Note:SGLT1:Sodium/glucose cotransporter 1;GLUT2:Glucose transporter 2;AMPK-α1:AMP-activated protein kinase α1;PK:Pyruvate kinase; mTOR:Mammalian target of rapamycin. | ||||||||
碳水化合物是仔猪能量的主要来源。摄入的碳水化合物在肠道内消化酶的作用下水解成单糖 (葡萄糖占80%), 单糖经小肠黏膜上的SGLT1进入到小肠上皮细胞, 而SGLT1依赖钠离子穿过刷状缘需要依赖Na+/K+-ATP酶进行供能和维持, 然后位于小肠上皮细胞基底膜的GLUT2将细胞内的单糖转运出小肠基底膜, 进入血液循环, 维持血糖平衡。因此, SGLT1、GLUT2和Na+/K+-ATP酶在小肠碳水化合物吸收过程中起到重要作用。
有研究者发现, 肠道炎症会引起SGLT1 mRNA表达量下调, 使得葡萄糖吸收不良, 肠道上皮细胞稳态被破坏[18]。AMPK是生物能量代谢调节的关键分子, 也是保持机体葡萄糖平衡所必需的。本试验结果表明, IUGR仔猪空肠Na+/K+-ATP酶活性显著降低, SGLT1 mRNA表达量有降低的趋势, 且AMPK-α1 mRNA表达量显著降低。Dong等[19]研究发现, IUGR会引起仔猪肠道炎症, 使得肠道内细胞因子分泌紊乱, 炎症细胞被激活, 影响肠道消化吸收功能。William[20]认为IUGR能影响葡萄糖转运吸收, 降低血糖水平, 破坏葡萄糖稳态, 导致糖代谢和能量代谢异常。Cellini等[21]发现IUGR有下调小肠SGLT1 mRNA表达量的趋势, 影响小肠SGLT1的转运能力和葡萄糖的摄取。朱伟芬[22]也发现IUGR状态下, 大鼠肝脏AMPK-α1的表达量显著下调。小肠绒毛刷状缘AKP作为肠道消化吸收功能的关键酶, 可加速营养物质的摄取和转运, 并间接地为机体提供能量; 同时, AKP也是一种内源性解毒因子, 能清除肠道内致病菌分泌的脂多糖内毒素, 保护肠道健康[23]。本试验结果表明, IUGR导致空肠AKP活性显著降低, 这与王远孝[24]的试验结果一致。在日粮中添加亮氨酸后, IUGR仔猪空肠Na+/K+-ATP酶活性有升高的趋势, AKP活性显著升高, 同时SGLT1、GLUT2、AMPK-α1 mRNA表达量也得到显著提高。石亚庆等[25]研究发现, 饲料中添加适量亮氨酸可以提高罗非鱼小肠蛋白酶、脂肪酶、淀粉酶和Na+/K+-ATP酶活性, 从而促进营养物质的消化吸收。研究表明, 亮氨酸可以激活AMPK[26], 上调小鼠空肠GLUT2蛋白表达水平, 促进葡萄糖的吸收[27-28]。这些研究结果均表明IUGR抑制小肠葡萄糖的吸收, 而亮氨酸能促进小肠发育, 提高葡萄糖的吸收能力, 改善IUGR的不良影响。此外, Cao等[29]认为, 小肠SGLT1 mRNA表达量的上调与仔猪维持营养需要的能量增加密切相关。
小肠内能量代谢主要涉及糖酵解、三羧酸循环、氧化磷酸化等途径[30]。小肠糖酵解途径为机体提供少量ATP和大量丙酮酸, 而丙酮酸能进入线粒体, 参与三羧酸循环反应, 产生ATP、还原型辅酶Ⅱ(NADPH) 和还原型黄素二核苷酸 (FADH2), 而NADPH和FADH2经氧化磷酸化过程能产生大量ATP以维持肠道正常生理功能。其中, PK和HK是糖酵解过程的两种关键限速酶; SDH和MDH是决定三羧酸循环运转的调节酶, 可用来反映线粒体能量代谢的强弱。mTOR是一个高度保守的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶, 是细胞氨基酸、能量及营养状态的感受器, 主要调控细胞生长和能量代谢[31]。研究表明, IUGR能诱导肠细胞代谢紊乱, 线粒体生物合成和功能受损[32]。本试验结果表明, IUGR仔猪空肠ATP含量显著下降, 这与Ogata等[33]试验结果相似。这可能是由于肠细胞能量代谢相关的糖酵解、三羧酸循环、电子传递以及ATP生成过程被破坏所致。另外, 本试验发现IUGR仔猪空肠PK活性及其线粒体MDH活性显著下降, 空肠PK mRNA表达量有下降的趋势, mTOR mRNA表达量显著下降。前人研究表明, IUGR能抑制肝脏三羧酸循环关键酶活性, 降低ATP含量[34], 下调肝脏PK mRNA表达量[35]和肌肉mTOR蛋白表达量[11], 导致细胞代谢紊乱。而在日粮中添加亮氨酸后, IUGR仔猪空肠ATP含量有升高的趋势, 空肠线粒体MDH和SDH活性显著升高, mTOR mRNA表达量显著升高, 与Yang等[36]、Zhong等[37]研究结果一致。研究表明, 亮氨酸通过激活mTOR信号, 调控细胞能量代谢水平, 促进细胞生长[38]。Li等[26]发现亮氨酸能促进线粒体生物合成和脂肪酸氧化, 从而产生更多的乙酰辅酶A流向三羧酸循环。乙酰辅酶A水平与三羧酸循环的速率和ATP的生成密切相关, 而有研究报道亮氨酸能影响线粒体乙酰辅酶A的水平, 调控机体能量代谢状态[39]。本试验结果提示:IUGR可能会引起仔猪小肠糖酵解和三羧酸循环关键酶活性及基因表达量发生变化, 而亮氨酸有改善IUGR仔猪小肠糖酵解和三羧酸循环关键酶的作用。
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