脱氧雪腐镰刀菌烯醇 (deoxynivalenol, DON) 是粮食和饲料中常见的真菌毒素之一, 由禾谷镰刀菌 (Fusarium graminearum)、粉红镰刀菌 (Fusarium reseum) 等在小麦生长期间产生的单端孢霉烯B族毒素。DON在全球饲料中具有较高的检出率^[1], Liu等^[2]发现我国河北省DON检出率达到91.5%, 每日摄入量 (probable daily intakes, PDI) 达到了0.56 μg·kg^-1。DON主要造成猪等免疫抑制、肠损伤和神经系统障碍。尤其是DON对消化系统毒性损伤的机制是目前国内、外研究热点^[3]。国际癌症研究机构 (International Agency for Research on Cancer, IARC) 将DON列为三类致癌物之一, FDA/WHO推荐人类食用小麦产品中的DON每日最大耐受摄入量 (provisional maximum tolerable daily intake, PMTDI) 为1 μg·kg^-1, 欧盟将人类直接食用的谷物、淀粉等中DON限量标准规定为0.75 mg·kg^-1。

DON的吸收部位集中在胃、十二指肠上端和回肠等^[4], 因此这些组织也是DON最主要的毒性靶组织。以往研究表明DON会降低猪肠绒毛高度、黏膜厚度等^[5]; 对caco-2和IPEC-1等细胞系的研究发现染毒细胞TEER值、claudin-4表达和紧密连接蛋白明显下降^[6]。有研究发现DON抑制大鼠的胃排空^[7]。胃液组成不但影响排空功能, 还直接影响胃消化和营养吸收, DON是否对胃液组成影响却鲜有报道。胃液组成受“胃泌素-ECL细胞-壁细胞轴”(gastrin-ECL cell-parietal cell axis) 调控^[8], 主要成分是壁细胞的氢-钾-腺苷三磷酸酶泵 (H⁺-K⁺-ATPase) 分泌的盐酸和主细胞分泌的胃蛋白酶等。本研究借助Kurasawa等^[9]建立的幽门结扎模型研究DON对Wistar大鼠胃液组成的影响, 从而揭示DON对胃液分泌功能的毒性机制。

1 材料与方法 1.1 试验材料

清洁级Wistar大鼠24只, 雌、雄各半 (购于扬州大学比较动物医学中心); DON标准品 (美国Sigma公司, 1 mg), 三氯乙酸、BSA (中国国药集团), 酪氨酸、福林-酚试剂 (购自南京奥多福尼生物科技有限公司), 1 mg·mL^-1的K⁺、Na⁺、Ca²⁺和Zn²⁺标准溶液 (国家标准样品网)。

1.2 胃液采集

将Wistar大鼠24只 (7周齡, 220 g, 雌、雄各半) 随机分为4组, 分笼饲养在恒温、恒湿的试验动物房内。移除垫料并禁食24 h, 以0、1、5和25 mg·kg^-1的DON浓度按体质量对大鼠进行灌胃染毒。自由活动0.5 h后按Kurasawa等^[9]推荐的方法进行幽门结扎术。4 h后处死大鼠, 沿腹白线打开腹腔收集胃液, 将其3 500 r·min^-1离心10 min后吸取上清液于4 ℃保存。

1.3 胃液分泌测定

胃液pH值用精密pH计进行测定。胃液体积(V_总) 由胃液上清体积 (V_上清) 和胃残渣内的液体体积 (V_残) 按式 (1) 进行计算; V_残利用烘干法根据水分丢失质量 (m) 及密度 (ρ) 进行计算 (见式 (2))。公式如下:

(1)

(2)

1.4 胃液蛋白酶活性测定

胃蛋白酶活性参考Kurasawa等^[9]的测定方法并进行改进, 取离心胃液0.1 mL, 加入1%牛血清白蛋白 (0.1 mol·L^-1 HCl配制)1 mL。37 ℃温孵20 min, 加入1%三氯乙酸2 mL, 并在沸水中加热5 min, 冷却后过滤, 取滤液0.2 mL。加入2 mL 0.1 mol·L^-1 HCl、3.5 mL NaOH溶液 (0.6 mol·L^-1), 同时加入稀释后的福林-酚试剂1.5 mL, 混匀, 静置10 min, 测定光密度值 (D₆₈₀)。根据酪氨酸标准曲线计算胃蛋白酶活性, 以μmol·h^-1酪氨酸表示胃蛋白酶排出量。

胃蛋白酶活性 (IU)=生成的总酪氨酸 (μmol)/消化反应时间 (min)

1.5 黏蛋白含量测定

黏蛋白含量利用阿利新蓝法进行测定。取胃液1 mL, 加1%阿利新蓝0.1 mL、pH5.8的柠檬酸磷酸缓冲液3.3 mL, 再加蒸馏水至5.0 mL, 混匀。设标准管1只, 内加阿利新蓝0.1 mL、pH5.8的柠檬酸磷酸缓冲液3.3 mL, 用蒸馏水稀释至5.0 mL。将样品及标准管于20 ℃室温静置24 h后, 以2 500 r·min^-1离心10 min, 取上清液, 利用分光光度计测定在615 nm处的吸光值A₆₁₅。所得A₆₁₅值与加入胃液中阿利新蓝A₆₁₅值的差值, 即胃液黏蛋白成分的结合量。

1.6 ICP法测定金属离子含量

吸取1 mL胃液加入消解管内, 加入1 mL HNO₃, 混匀后放入消解罐内在微波消解仪上进行微波消解。胃液的消解程序:分别在85、135、185和230 ℃消解2、4、5和15 min。将K⁺、Na⁺、Ca²⁺和Zn²⁺标准溶液 (1 mg·mL^-1), 用去离子水分别稀释成0、10、50和200 μg·mL^-1 4个浓度梯度, 通过ICP-AES法测定其吸光度, 分别绘制K⁺、Na⁺、Ca²⁺和Zn²⁺的浓度标准曲线。根据标准曲线分别测定0、1、5和25 mg·kg^-1DON染毒组的胃液中K⁺、Na⁺、Ca²⁺和Zn²⁺的浓度。

1.7 统计分析

所有数据利用SPSS 18.0软件进行单因素方差分析 (ANOVA), 数据以x±SE形式表示。

2 结果与分析 2.1 DON对胃液分泌的影响 2.1.1 DON对胃液分泌量的影响

由图 1可知:随DON染毒剂量增加, 大鼠胃液分泌量显著下降 (P < 0.05), 相对于对照组的6.1 mL, 1、5和25 mg·kg^-1 DON染毒组大鼠的胃液体积分别下降了24.88%、51.39%和60.88%(图 1-A), 胃液分泌与DON染毒剂量呈负相关。同时结果表明, 胃液pH值随着DON剂量增加而上升。对照组胃液pH值为1.93, 而1、5和25 mg·kg^-1 DON染毒后胃液pH值分别提高到3.20、3.81和6.70(图 1-B), 说明DON染毒明显破坏了大鼠胃液的酸性环境。

2.1.2 DON对胃液中黏蛋白含量的影响

利用阿利新兰法测定胃液中黏蛋白的分泌情况, 结果 (图 2-A) 表明:与对照组相比, 1、5和25 mg·kg^-1 DON染毒组胃液中黏蛋白含量分别下降了8.42%、10.02%和12.30%, 表明DON对胃液黏蛋白的分泌具有抑制作用。

2.1.3 DON对胃液胃蛋白酶分泌量的影响

由图 2-B可见:DON抑制了胃内胃蛋白酶的分泌。与对照组相比, 1、5 mg·kg^-1 DON组胃液胃蛋白酶含量分别下降了7.96%和18.33%, 而25 mg·kg^-1 DON组胃蛋白酶含量降低了50.83%。

2.2 DON对胃蛋白酶活性的影响

胃蛋白酶总活性是对蛋白质消化能力的直接反映。福林-酚法测定结果表明:随DON染毒剂量增加, 大鼠胃液总胃蛋白酶活性显著降低 (图 3-A, P < 0.05)。与对照组相比, 1、5和25 mg·kg^-1 DON染毒组大鼠的胃蛋白酶总活性分别下降了27.97%、55.36%和67.82%。与对照组相比, 1、5和25 mg·kg^-1 DON染毒组每mL胃液胃蛋白酶活性分别下降了8.52%、10.03%和12.33%(图 3-B)。

2.3 DON对胃残渣量的影响

胃液残渣质量测定结果 (图 4) 表明:DON染毒使大鼠胃液残渣干、湿质量显著升高 (P < 0.05), 且与染毒剂量呈正相关。与对照组相比, 1、5和25 mg·kg^-1 DON染毒组残渣湿质量分别增加了200.25%、258.03%和540.09%(图 4-A)。类似地, 1、5和25 mg·kg^-1 DON染毒组与对照组残渣干质量相比分别增加了42.97%、250.16%和2 460.32%(图 4-B)。可见25 mg·kg^-1 DON染毒明显抑制了大鼠的胃消化能力。

2.4 DON对胃液金属离子质量浓度的影响

利用ICP-AES法对胃液K⁺、Na⁺、Ca²⁺和Zn²⁺等常见金属离子质量浓度进行了测定 (表 1)。结果表明:5和25 mg·kg^-1DON组大鼠胃液中Na⁺质量浓度明显升高 (P < 0.05), 1 mg·kg^-1DON组大鼠胃液Na⁺质量浓度显著下降 (P < 0.05), 胃液中K⁺质量浓度变化与Na⁺基本一致。1 mg·kg^-1DON染毒大鼠胃液内Ca²⁺质量浓度显著下降 (P < 0.05), 这可能与胃液酸度下降导致的钙解离下降有关; 而25 mg·kg^-1DON染毒后, 大鼠胃液内的Ca²⁺质量浓度未发生明显变化 (P>0.05)。DON染毒增加了胃液Zn²⁺质量浓度, 5和25 mg·kg^-1DON组Zn²⁺质量浓度分别增加了18.67%和122.59%(P < 0.05)。

3 结论与讨论

大鼠是研究单胃动物功能的理想实验模型^[10], 本研究结果对阐明DON对其他动物胃毒性损伤机制具有借鉴意义。胃液pH值是评价胃液分泌和消化功能的重要指标之一, 本研究发现DON染毒组大鼠胃液pH值明显升高, 而胃液分泌总量却显著降低, 表明DON对胃液分泌具有抑制作用。本研究利用Folin-Phenol法测定了DON对大鼠胃液内胃蛋白酶总活性的影响, 发现DON显著降低了大鼠胃蛋白酶活性, 这是胃液蛋白消化能力下降的有力证据。Lindstr等^[11]认为胃蛋白酶在pH值为2时消化活性最强, 当pH值在5.0~6.0时酶活性和稳定性迅速下降。试验中DON引起的胃蛋白酶活性下降与pH值改变有关, 是否与DON抑制胃蛋白酶合成仍需进一步研究。本试验也发现DON抑制了大鼠的排空能力, 这与Fioramonti等^[7]的研究结果一致。胃内容物体积是影响胃排空的重要因素^[12], 而本试验中对不同组别大鼠进行了幽门结扎术, 排除了胃排空延迟导致胃内容物增多这一因素, 证明胃液组成改变是内容物增多的直接原因。

电感耦合等离子体发射光谱法 (ICP-AES法) 对于金属离子检测具有精确、快速的优点, 以往研究证实DON可导致胃黏膜损伤^[13], 胃液Zn²⁺水平经常被作为炎症的判定指标, 试验中DON浓度与胃液Zn²⁺含量明显正相关, 这与以往研究结果相吻合。DON可致小鼠骨骼畸形, 这与DON抑制软骨细胞生长有关^[14], 本试验中胃液Ca²⁺浓度变化是钙代谢紊乱的间接体现^[15], 但Ca²⁺紊乱如何涉及骨骼畸形的机制仍有待探究。DON也能引起脑毒性损伤与抗氧化功能下降^[16-17], 而胃液分泌受到ghrelin等脑肠肽的调控, 是否与此有关仍待探究。综上所述, 本研究结果表明DON改变了胃液组成, 影响了胃蛋白酶分泌和活性, 是否与DON抑制相关蛋白合成及细胞膜通透性有关仍需进一步研究。