脱氧血腐镰刀菌烯醇对小鼠骨髓源性树突状细胞表型和吞噬功能的影响

http://dx.doi.org/10.7685/jnau.201601003

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夏兵兵, 汪袁, 樊彦红, 李银环, 王晴晴, 孙卫东, 张海彬, 何成华

XIA Bingbing, WANG Yuan, FAN Yanhong, LI Yinhuan, WANG Qingqing, SUN Weidong, ZHANG Haibin, HE Chenghua

Effects of deoxynivalenol on the phenotype and phagocytotic activity of murine bone marrow-derived dendritic cells

南京农业大学学报, 2017, 40(2): 314-319

Journal of Nanjing Agricultural University, 2017, 40(2): 314-319.

http://dx.doi.org/10.7685/jnau.201601003

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收稿日期: 2016-01-04

引用本文

夏兵兵, 汪袁, 樊彦红, 等. 脱氧血腐镰刀菌烯醇对小鼠骨髓源性树突状细胞表型和吞噬功能的影响[J]. 南京农业大学学报, 2017, 40(2): 314-319. 复制到剪切板

XIA Bingbing, WANG Yuan, FAN Yanhong, et al. Effects of deoxynivalenol on the phenotype and phagocytotic activity of murine bone marrow-derived dendritic cells[J]. Journal of Nanjing Agricultural University, 2017, 40(2): 314-319. DOI: 10.7685/jnau.201601003 复制到剪切板

脱氧血腐镰刀菌烯醇对小鼠骨髓源性树突状细胞表型和吞噬功能的影响

夏兵兵¹, 汪袁¹, 樊彦红², 李银环¹, 王晴晴¹, 孙卫东¹, 张海彬¹, 何成华¹

1. 南京农业大学动物医学院, 江苏南京 210095;
2. 苏州市吴江区农业委员会, 江苏苏州 215200

收稿日期：2016-01-04

基金项目：江苏省自然科学基金项目（BK2012220）；国家自然科学基金项目（30901091）；江苏高校优势学科建设工程资助项目（PAPD）

作者简介：夏兵兵, 硕士研究生

通信作者：何成华, 副教授, 主要从事畜禽中毒病与民族药物的开发与应用研究, E-mail:hechenghua@njau.edu.cn

摘要：[目的]本试验旨在研究脱氧血腐镰刀菌烯醇（deoxynivalenol，DON）对脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）刺激的小鼠骨髓源性成熟树突状细胞（mature dendritic cell，mDC）的表型和吞噬功能的影响。[方法]体外培养小鼠骨髓细胞诱导分化成未成熟的树突状细胞，分别用不同质量浓度的DON（0、125、250、500 ng·mL^-1）处理DC 6 h后，再加入LPS刺激18 h。以仅用LPS处理的为阳性对照组。用流式细胞仪检测DC表型（CD80、CD86和MHC-Ⅱ）变化及吞噬右旋葡聚糖的能力；RT-PCR检测细胞中细胞因子（IL-6、IL-10、IL-12和TNF-α）mRNA的相对表达。[结果]LPS刺激引起mDC表面的CD80、CD86和MHC-Ⅱ升高（P < 0.05），吞噬右旋葡聚糖能力下降，IL-6、IL-10、IL-12和TNF-α的mRNA相对表达水平提高（P < 0.05）；低浓度和中浓度DON（125和250 ng·mL^-1）对DC的表型和免疫功能没有影响（P>0.05），高浓度DON（500 ng·mL^-1）引起mDC共刺激分子（CD80、CD86和MHC-Ⅱ）表达水平降低（P < 0.05），同时细胞因子的mRNA表达降低（P < 0.05），但吞噬能力提高12.2%。[结论]高浓度DON对LPS刺激的mDC表型和细胞因子表达具有一定的抑制作用。

关键词：脱氧血腐镰刀菌烯醇树突状细胞:脂多糖表型吞噬功能

Effects of deoxynivalenol on the phenotype and phagocytotic activity of murine bone marrow-derived dendritic cells

XIA Bingbing¹, WANG Yuan¹, FAN Yanhong², LI Yinhuan¹, WANG Qingqing¹, SUN Weidong¹, ZHANG Haibin¹, HE Chenghua¹

1. College of Veterinary Medicine, Nanjing Agricultural University, Nanjing 210095, China;
2. Wujiang District Agricultural Committee of Suzhou City, Suzhou 215200, China

Abstract: [Objectives] In this study, the effects of Deoxynivalenol (DON) on phenotype and phagocytosis of murine bone marrow-derived dendritic cells induced by lipopolysaccharide (LPS) were investigated. [Methods] The murine bone marrow cells from C57BL/6 mouse were cultured and induced to immature dendritic cells (iDC). iDCs were exposed to DON (0, 125, 250 and 500 ng·mL^-1) for 6 h before adding LPS (1 μg·mL^-1), and then further incubated for 18 h. Cells only incubated with LPS were used as positive controls. The phenotypic changes (CD80, CD86 and MHC-Ⅱ) and phagocytic ability of FITC-dextran in DC were analyzed by Flow cytometry. Relative expressions of cytokines (IL-6, IL-10, IL-12 and TNF-α) were assayed by real-time PCR (RT-PCR). [Results] The phenotypic expressions of CD80, CD86, and major histocompatibility complex (MHC-Ⅱ) were up-regulated on LPS-stimulated immature dendritic cells (P < 0.05). However, the phagocytic ability of FITC-dextran was reduced. The gene expressions of cytokines (IL-6, IL-10, IL-12 and TNF-α) were increased (P < 0.05). Meanwhile, we found that the phenotypic and immune function of LPS-induced DCs at the level of 125 and 250 ng·mL^-1 DON were not changed (P>0.05). The expressions of phenotypic markers (CD80, CD86, MHC-Ⅱ) were down-regulated at the level of 500 ng·mL^-1DON (P < 0.05). At the same time, gene expressions of IL-6, IL-10, IL-12, and TNF-α were reduced (P < 0.05). However, the phagocytic ability of FITC-dextran was elevated by 12.2%. [Conclusions] Our data indicated that DON would play a negative role in the maturation of DCs induced by LPS. This research provided the experimental basis for the immune suppression induced by DON.

Key words: deoxynivalenol denritic cells lipopolysaccharide phenotype phagocytesis

脱氧雪腐镰刀菌烯醇 (deoxynivalenol, DON), 又称为呕吐毒素, 主要是由禾谷镰刀菌产生的一种霉菌毒素^[1], 广泛污染各种食品和饲料, 对人和动物的健康都造成很大的危害。耐高温是DON最重要的物理特性之一, 一般的加工方式很难降低其毒性^[2]。DON不仅能导致动物呕吐和腹泻, 还具有致癌、免疫抑制和引起细胞凋亡等危害作用^[3]。DON的靶器官是免疫系统, 由于DON染毒剂量和时间不同, 可引起免疫抑制或免疫刺激等不同的效应。因此, DON对免疫系统的影响是其对机体的重要毒性之一^[4]。

树突状细胞 (dendritic cell, DC) 是动物体内最重要的抗原提呈细胞 (antigen presenting cell, APC), 是特异性免疫应答的启动者, 对细胞免疫和体液免疫都有着重要的调节作用。根据来源的不同, 主要可以分为骨髓源性DC (bone marrow-derived DC, APC) 和淋巴源性DC (lymphiod, LDC), 均起源于CD34⁺造血干细胞。根据成熟度的不同, 又可以分为未成熟的DC (immature dendritic cell, imDC) 和成熟的DC (mature dendritic cell, mDC)。imDC具有很强的抗原提取、处理和加工能力; mDC抗原的摄取和加工能力减弱, 但是抗原提呈能力增强。imDC在外周组织、器官中捕获抗原后迁移至次级淋巴器官, 并定位于淋巴器官, 发育成为mDC, 其吞噬能力下降, 但是抗原提呈能力、迁移能力、刺激T细胞能力增强。mDC分泌的细胞因子包括IL-4、IL-5、IL-6、IL-1β、IL-35、TNF-α、IL-12和IL-10等及趋化因子CCL17(TARC)、CCL18(DC-CK1) 和CCL19(MIP-3β) 等。mDC分泌的细胞因子在初始T细胞的分化过程中作为第三信号发挥主导作用。在先天性免疫系统和获得性免疫系统之间起着桥梁作用^[5-6]。mDC通过表达表面共刺激分子 (CD80、CD86、MHC等) 和炎症因子 (IL-10、TNF-α和IFN-α) 参与机体的细胞免疫和体液免疫。

本试验以粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子 (granulcocyte-macrophage colony stimulating factor, GM-CSF) 和白细胞介素4(interleukin-4, IL-4) 联合诱导培养的小鼠骨髓树突状细胞为材料, 研究DON对成熟树突状细胞表型和吞噬功能特性的影响, 为进一步阐述真菌毒素引起人和动物免疫抑制的机制提供试验依据。

1 材料与方法 1.1 试验动物和试剂

清洁级雄性C57BL/6小鼠, 4~6周龄, 购买于扬州大学动物医学中心; RPMI1640和胎牛血清 (FBS) 购自Gibco公司; 重组小鼠粒细胞/巨噬细胞集落刺激因子 (rmGM-CSF) 和重组小鼠IL-4(rmIL-4) 购于美国Peprotech公司; 脂多糖 (LPS)、DON和异硫氰酸荧光素 (FITC) 标记右旋葡聚糖 (FITC-dextran) 购自Sigma公司; 藻红蛋白 (PE) 标记荧光抗体CD11c、别藻蓝蛋白 (APC) 标记荧光抗体CD80、CD86和主要组织相容性抗原复合物MHC-Ⅱ购自eBioscience公司; 反转录聚合酶链式反应 (RT-PCR) 试剂盒购自Bio-Rad公司。引物合成由南京思普金生物科技有限公司完成。

1.2 小鼠骨髓源性树突状细胞 (BMDC) 的诱导培养 1.2.1 小鼠骨髓单核细胞分离

参照文献[7]的方法并稍加改进。将C57BL/6小鼠颈椎脱臼处死, 浸入75%乙醇5 min。无菌环境下, 取双侧股骨、腓骨, 剥离附着肌肉组织, 用预冷的PBS冲洗3次; 剪开骨两端, 用5 mL注射器吸取无血清的RPMI1640, 插入骨髓腔反复冲洗, 直至变白; 骨髓冲洗液1 200 r·min^-1离心10 min, 弃上清液; Tris-NH₄Cl裂解红细胞, 室温静置1 min, 再次离心, 弃上清液; 无血清RPMI1640洗涤2次, 离心后收集细胞。

1.2.2 DC的培养

骨髓细胞重悬于完全RPMI1640(10%FBS、10 ng·mL^-1 GM-SCF、10 ng·mL^-1 IL-4、100 IU·mL^-1青霉素、100 μg·mL^-1链霉素), 调整细胞密度1×10⁶ mL^-1, 接种于6孔细胞板, 每孔4 mL, 置于CO₂培养箱中37 ℃培养48 h之后全量换液, 除去未贴壁细胞和细胞碎片, 以后隔日半量换液。培养至第7天, 收集细胞。向收集的细胞中加入PE标记的CD11c抗体, 4 ℃避光孵育30 min, PBS洗涤3次, 然后用4%的多聚甲醛固定, 最后用流式细胞仪 (BD FACSVerse, 美国) 检测DC纯度。

1.3 试验分组

收集培养至第7天的DC, 离心, 弃上清液, 悬浮细胞, 调整细胞密度1×10⁶mL^-1, 重新接种至24孔细胞板。试验分为空白组、LPS组、DON组, 其中DON组有3个浓度梯度, 分别为125、250和500 ng·mL^-1, 每个组设置3个重复孔。空白组:不处理的细胞作为阴性对照组; LPS组:加1 μg·mL^-1 LPS培养24 h, 作为阳性对照组; DON组:先加DON培养6 h后, 再加LPS继续培养18 h。

1.4 流式细胞术检测DC表面分子的变化

分别收集各组细胞, 1 000 r·min^-1离心10 min, 弃上清液, 用预冷的0.01 mol·L^-1PBS洗3次, 然后用PBS重悬DC调整细胞浓度至5×10⁵ mL^-1^[8]。向细胞中加入APC标记的CD80、CD86和MHC-Ⅱ抗体, 4 ℃避光孵育30 min, PBS洗涤3次, 用4%多聚甲醛固定后应用流式细胞仪检测。

1.5 RT-PCR检测细胞因子的表达

用Trizol提取细胞总RNA, 反转录成cDNA后, 进行RT-PCR检测细胞因子 (IL-6、IL-10、1L-12和TNF-α) mRNA表达水平, 以β-actin作为内参。各细胞因子和内参的引物序列见表 1。反应条件为95 ℃ 15 s; 60 ℃ 1 min, 95 ℃ 30 s, 循环40次。每个样本设置3个重复孔, 根据各组C_T值计算2^-ΔΔC_T值。

表 1 引物对序列 Table 1 The primer pairs sequences

基因名称Gene names	引物对序列 (5′→3′) Primer pairs sequences
IL-6	TGCTGGTGACAACCACGGCC/GTACTCCAGAAGACCAGAGG
IL-10	AAGCCTTATCGGAAATGATCCA/GCTCCACTGCCTTGCTCTTATT
IL-12	AGAGGTGGACTGGACTCCCGA/TTTGGTGCTTCACACTTCAG
TNF-α	AGGTCTGTCCCTTTCACTCACTG/AGAGAACCTGGGAGTCAAGCTA
β-actin	TGGAATCCTGTGGCATCCATGAAC/TAAAACGCAGCTCAGTAACAGTCCG

表选项

1.6 DC吞噬右旋葡聚糖能力的检测

分别收集各组DC, 1 200 r·min^-1离心10 min, 弃上清液, 调整细胞密度至4×10⁵ mL^-1, 加入1 mg·mL^-1 FITC标记右旋葡聚糖后37 ℃孵育1 h, 用4 ℃预冷的PBS洗3次, 再向细胞中加入PE标记CD11c, 4 ℃孵育30 min, 再用预冷的PBS洗3次, 最后用4%多聚甲醛固定, 上流式细胞仪检测。另外, 在4 ℃设置非特异性结合阴性对照组。

1.7 数据统计学分析

数据均用SPSS 20.0统计软件进行单因素方差分析和差异显著性比较。比较试验组与阳性对照组差异显著性, 数据均用x±SE表示。

2 结果与分析 2.1 DON对小鼠骨髓源性树突细胞形态的影响

小鼠骨髓细胞培养至第7天, 有大量的毛刺状树突样细胞, 个别细胞呈细小的集落生长 (图 1-A), 经流式细胞仪检测细胞表面上CD11c表达率达75%以上。不同DON浓度作用DC后, 细胞形态发生变化, 其中, 空白组DC形态大部分是大小不一的圆形, 形成小集落且有较短毛刺 (图 1-B); LPS组中DC形成细胞集落并且周围有很长的毛刺状树突 (图 1-C); 125和250 ng·mL^-1 DON组中, 细胞形成集落并且周围有毛刺状树突 (图 1-D, 1-E), 但是500 ng·mL^-1 DON组中, 细胞有形成集落, 而周围没有毛刺状树突 (图 1-F)。

图 1 DON对小鼠骨髓源性树突细胞 (DC) 形态的影响 (×400) Figure 1 Effect of DON on morphology of murine bone marrow-derived denditic cells (DC) A:培养至第7天小鼠骨髓源性DC; B:空白组; C:1 μg·mL^-1 LPS处理小鼠骨髓源DC; D:125 ng·mL^-1 DON处组小鼠骨髓源性DC; E:250 ng·mL^-1 DON处理小鼠骨髓源性DC; F:500 ng·mL^-1 DON处理小鼠骨髓源性DC。 A:Morphology of murine bone marrow-derived denditic cells cultured for 7 days; B:Control; C:Murine bone marrow-derived denditic cells were treated with 1 μg·mL^-1 LPS; D:Murine bone marrow-derived denditic cells were treated with 125 ng·mL^-1 DON; E:Murine bone marrow-derived denditic cells were treated with 250 ng·mL^-1 DON; F:Murine bone marrow-derived denditic cells were treated with 500 ng·mL^-1 DON.

图选项

2.2 DON对DC表面分子的影响

LPS处理组中DC表面分子CD80、CD86和MHC-Ⅱ的表达率与空白组比较, 表达量显著升高 (P < 0.05), 与125和250 ng·mL^-1 DON处理组相比, 表达量没有显著性差异 (P>0.05), 但是与DON高浓度处理组 (500 ng·mL^-1) 比较, 表达量显著降低 (P < 0.05)(表 2)。

表 2 各处理组小鼠骨来源DC表面分子表达水平的变化 Table 2 The phenotype of murine bone marrow-derived DC in each treatment group

组别Group	CD80	CD86	MHC-Ⅱ
空白对照Control	63.87±2.51^b	54.93±0.70^b	56.73±1.70^b
LPS	86.90±1.45^a	83.93±1.07^a	68.77±0.35^a
125 ng·mL^-1DON	90.23±1.77^a	85.87±1.40^a	68.83±0.72^a
250 ng·mL^-1DON	86.57±0.71^a	85.73±1.47^a	67.43±2.27^a
500 ng·mL^-1 DON	72.20±2.87^b	75.67±2.40^b	58.63±3.32^b
注:同列右肩标字母不同者表示差异显著 (P < 0.05)。Means within a column with different superscript letters are significant difference at 0.05 level. The same as follows.

表选项

2.3 DON对骨髓细胞中细胞因子mRNA表达的影响

IL-6、IL-10、IL-12和TNF-α, 这些促炎性和抗炎性细胞因子在免疫应答调节中占有重要作用。不同质量浓度DON处理DC后, 空白组IL-6、IL-10、IL-12和TNF-α的mRNA几乎不表达; 与LPS组比较, 125和250 ng·mL^-1DON组IL-6、IL-10、IL-12和TNF-α的mRNA表达量没有显著性差异 (P>0.05), 然而500 ng·mL^-1 DON组, IL-6、IL-10、IL-12和TNF-α的mRNA表达量显著性降低 (P < 0.05)(图 2)。以上结果表明, 125和250 ng·mL^-1DON不影响DC细胞中这4种细胞因子mRNA表达, 但DON (500 ng·mL^-1) 高浓度组则降低这4种细胞因子mRNA表达, 引起机体免疫抑制。

	图 2 DON处理对中小鼠骨髓源性DC分泌IL-6、IL-10、IL-12和TNF-α的mRNA相对表达量的影响 Figure 2 The mRNA relative expression level of IL-6, IL-10, IL-12 and TNF-α cytokine secreted by murine bone marrow-derived DC in DON each treatment group
图选项

2.4 DON对DC吞噬功能的影响

抗原捕获和提呈是DC重要的一种免疫功能, 未成熟DC可以高效地捕获抗原, 但是成熟DC失去这种能力。LPS处理组与空白组比较, CD11c与右旋葡聚糖双阳性百分数下降了17.4%;125和250 ng·mL^-1 DON处理组较LPS处理组分别提高了1.5%和2.6%, 而500 ng·mL^-1DON处理组则比LPS处理组提高了12.2%。在4 ℃低温处理下, 所有DC几乎不摄取右旋葡聚糖 (图 3), 说明DC没有非特异性摄取右旋葡聚糖。

	图 3 不同质量浓度DON处理对小鼠骨髓源性树突状细胞吞噬作用的影响 Figure 3 The effect of different concentrations DON on endocytosis of murine bone marrow-derived DC
图选项

3 讨论

因作用的浓度、频率和时间不同, DON具有免疫刺激和免疫抑制双重作用^[9], 其机制一直是国内外的研究热点。谷静^[10]研究发现, C57BL/6小鼠更适合骨髓源性DC的诱导, 一只小鼠可产生 (5~10)×10⁶ DC。本试验以DC细胞为研究对象, 检测DON对DC细胞表面因子, 分泌因子和吞噬能力的影响, 结果证明低浓度和中浓度DON处理DC, 对细胞的表面分子和免疫功能没有影响, 但用高浓度DON处理DC, 细胞表面共刺激分子CD80、CD86和MHC-Ⅱ表达降低, 促炎症细胞因子 (TNF-α、IL-6和IL-12) 和抗炎症细胞因子 (IL-10) mRNA相对表达量降低, 而细胞吞噬右旋葡糖能力提高。试验结果潜在说明, 动物摄取饲料中的DON达到一定浓度, 降低机体对抗原的摄取、加工和提呈, 免疫应答不能启动, 从而使机体对疾病抵抗能力低下。Hymery等^[11]体外研究单端孢霉镰刀菌烯醇对人树突状细胞的作用, 发现DON抑制LPS刺激的DC表面分子表达 (如CD86、HLA-DR和CCR7), 也抑制细胞分泌IL-10和IL-12;Luongo等^[12]研究发现DON抑制LPS刺激的DC表面分子CD86和MHC-Ⅱ上调, 这与本试验结果是一致的。但是, Wang等^[13]研究DON对RAW264.7细胞促炎症细胞因子基因表达的作用, 结果显示TNF-α表达上调, 这是否是DON对不同细胞有不同的作用, 还有待进一步研究。imDC表面低表达CD40、CD54、CD80、CD86和MHC-Ⅱ等共刺激分子, 无法提供T细胞活化所需要的第二信号, 使得其刺激T细胞活化增殖的能力较弱^[14]。本试验结果表明, DON抑制DC表面分子CD80、CD86和MHC-Ⅱ表达, 从而抑制DC成熟, 无法活化初始T细胞, 无法启动T细胞介导的免疫应答。

DC作为专职抗原递呈细胞, 在免疫应答中扮演着重要的角色。LPS是革兰氏阴性细菌细胞壁一种成分, 也是病原体相关分子模式 (PAMP) 最活跃成分之一, 尤其是与DC表面上TLR4结合, 使DC成熟。DC成熟后, 抗原摄取功能降低, 提呈功能加强^[15], 但高浓度DON使DC吞噬能力提高, 从而抑制其成熟, 提呈抗原给T细胞的能力降低, 无法启动免疫应答。高浓度DON处理DC, 降低促炎症细胞因子和细胞因子表达。DC分泌的TNF-α可以使上皮组织表达黏附分子上调, 这就促进炎性细胞向炎症组织和肿瘤微环境聚集^[16-17]。IL-12是刺激Th1免疫应答抵抗肿瘤和感染的一种关键细胞因子^[18]。机体通过释放抗炎症细胞因子 (如IL-10) 消除炎症反应^[19]。我们用高浓度DON处理DC, 细胞分泌抗炎症细胞因子能力降低, 因此, DON具有抑制DC分泌促炎性细胞因子和抗炎性细胞因子双重作用。Huang等^[20]研究橘黄素对DC成熟的免疫抑制作用, 发现细胞分泌IL-10也减少。

总而言之, 较低浓度DON对DC表型和吞噬能力没有影响, 而高浓度DON降低表面分子表达但提高了吞噬能力, 从而抑制DC成熟。因此, DON引起机体免疫抑制可能是抑制DC细胞成熟, 使其无法提呈抗原给T细胞, 从而无法启动免疫应答。但是DON通过何种方式影响DC与T细胞之间信号传导, 还有待进一步研究。

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