文章信息
- 魏冰, 陈文娟, 朱琳, 李建军, 吕传忠, 任东兴, 陈庚, 付旭彬
- WEI Bing, CHEN Wenjuan, ZHU Lin, LI Jianjun, LÜ Chuanzhong, REN Dongxing, CHEN Geng, FU Xubin
- Th表位肽与聚肌胞苷酸对猪O型口蹄疫合成肽疫苗的免疫增强作用
- Immunity enhancement of swine FMDV type-O synthetic peptide vaccine by Th epitope peptides and Poly(I:C)
- 南京农业大学学报, 2017, 40(1): 163-168
- Journal of Nanjing Agricultural University(Social Science), 2017, 40(1): 163-168.
- http://dx.doi.org/10.7685/jnau.201601048
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文章历史
- 收稿日期: 2016-01-25
2. 天津瑞普生物技术股份有限公司, 天津 300308
2. Tianjin Ringpu Biological Technology Co., Ltd., Tianjin 300308, China
口蹄疫病毒(foot-and-mouth disease virus,FMDV)是一类小RNA病毒科,口蹄疫病毒属的病毒,它被世界动物卫生组织(OIE)列为A类动物疫病名单之首[1],给畜牧业造成巨大的经济损失。临床上现用疫苗以全病毒灭活疫苗和合成肽疫苗为主,合成肽疫苗无需全病毒操作,具有安全性高、稳定性好、生产工艺简单等优点[2-3],但这类重组亚单位疫苗存在免疫原性差和免疫效能低等问题,需在此类疫苗中添加一定的免疫增强剂以增强疫苗的免疫效果[4-5]。
通用型Th表位合成肽可作为免疫佐剂增强合成肽疫苗免疫效力,辅助性T细胞能够辅助B细胞产生大量抗体,在细胞免疫调节过程中扮演着重要角色。王世红等[6]的研究表明含口蹄疫3D蛋白的Th表位重组蛋白作为佐剂可以明显增加口蹄疫抗原的体液和细胞免疫应答水平。聚肌胞苷酸是一类双链RNA类似物,可特异性识别TLR3受体和MDA-5受体,激活机体固有免疫[7],现作为病毒性炎症的免疫增强类药物被广泛使用,也有研究者从细胞免疫方面指出Poly(I:C)与CpG混合使用可增强亚单位疫苗的免疫效力和抗结核能力,其对蛋白类疫苗的体液免疫和细胞免疫应答也有一定促进作用[8],但其作为FMDV合成肽商品疫苗的免疫增强剂仍处在探究阶段。本试验通过探究Th表位肽和聚肌胞苷酸Poly(I:C)2种免疫增强剂的作用,期望能为口蹄疫合成肽疫苗筛选出有价值的免疫增强剂。
1 材料与方法 1.1 试验动物及分组健康的6~8周龄雌性Balb/c小鼠80只,购自天津市津南区春乐实验动物养殖场。将该批小鼠随机分成A、B、C、D共4组,每组20只,并用苦味酸进行1~20编号。
1.2 主要试剂和仪器Th表位肽(口蹄疫O/MYA98/BY/2010 株3D蛋白342~371aa)和猪O型口蹄疫合成肽抗原(天津瑞普生物技术股份有限公司);Poly(I:C)(102M4020W,Sigma公司);LSM淋巴细胞分离液(m8850,MP公司);MTS(0000119601,Promega公司);MONTANIDE ISA 61VG佐剂(T30311,赛彼科(上海)特殊化学品有限公司);ConA(C8110,Gibco公司);HRP标记的羊抗鼠IgG(UT-2003,KPL Corporation);TMB单组份显色液(T21931,Solarbio公司);小鼠IL-4与IFN-γ细胞因子检测试剂盒(上海酶联生物科技有限公司);高剪切分散乳化机(FA25型,FLUKO公司);酶标检测仪(Bio-RAD15146型,日本生产)。
1.3 试验方法 1.3.1 动物免疫采用皮下多点注射,每只0.2 mL。根据前期优化疫苗配方如下:A组为Th表位肽疫苗组(100 μg口蹄疫合成抗原+20 μg Th表位肽+5 mL 61VG佐剂),B组为Poly(I:C)疫苗组(100 μg口蹄疫合成抗原+1.2 mg Poly(I:C)+5 mL 61VG佐剂),C组为普通疫苗组(100 μg口蹄疫合成抗原+5 mL 61VG佐剂),D组为生理盐水空白对照组,并按规程乳化疫苗。分别于免疫后7、14、21和28 d每组随机抽取5只小鼠,收集血清及脾脏。
1.3.2 间接ELISA检测小鼠血清VP1抗体将猪O型口蹄疫合成肽抗原常规包被和2% BSA封闭温育。阴、阳性血清5倍稀释,37 ℃温育,洗涤后加HRP-羊抗鼠二抗37 ℃温育,避光显色后,终止反应,于酶标仪测量各孔吸光度值(A450值)。设空白调零孔[9]。
1.3.3 小鼠血清细胞因子IL-4及IFN-γ检测操作步骤详见上海酶联生物科技有限公司酶联免疫试剂盒说明书。
1.3.4 脾脏淋巴细胞增殖试验每组随机挑取5只小鼠,断颈处死后取脾[10]于200目不锈钢网上配以4 mL 1640培养基研磨,混合悬液用LSM分离淋巴细胞。洗涤2次后调整细胞密度量为106~107 mL-1。在96孔细胞板中添加每孔100 μL猪O型口蹄疫合成肽抗原与100 μL细胞悬液,置37 ℃、5% CO2培养48 h,以ConA为阳性对照[11]。细胞培养44 h后每孔加入20 μL MTS,置37 ℃、5% CO2培养箱。培养4 h后轻吸出上清液,每孔加入150 μL DMSO。室温放置5 min后酶标仪上测A490。最终结果以刺激指数(SI)表示。SI计算公式如下:
SI=(刺激组A490值-空白组A490值)/(对照组A490值-空白组A490值)[12]。
1.3.5 小鼠脾脏病理切片常规脱水、透明、浸蜡与组织包埋,平推式病理切片机上切片,厚3~5 μm,苏木精-伊红染色后封固[13]。
1.4 统计学分析本试验所有试验数据均统一表示为 x±SE,采用SPSS 17.0进行方差分析和差异显著性检验。
2 结果与分析 2.1 免疫后小鼠安全评价通过观察,免疫期内所有免疫小鼠身体状态正常,未发现有感染FMDV的症状,且未发生疫苗中毒、死亡等情况。
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图 1 小鼠血清VP1抗体A450值 Figure 1 The serum level A450 of VP1 antibody in mice |
由图 1结果显示,A、B、C组小鼠免疫后7、14和21 d血清VP1抗体A450值呈上升趋势,而28 d血清VP1抗体A450值下降。免疫后14 d,A与B组血清VP1抗体A450值显著高于C、D组(P<0.05) ,其中,A、B组间无显著差异,C、D组间无显著差异;免疫后21 d,A、B、C组血清VP1抗体A450值显著高于D组(P<0.05) ,A、B、C组间无显著差异;免疫后28 d,A组血清VP1抗体A450值显著高于B、C、D组(P<0.05) ,B、C、D组间无显著差异。
2.3 Th表位肽与Poly(I:C)对小鼠血清细胞因子水平的影响 2.3.1 Th表位肽与Poly(I:C)对小鼠血清IL-4水平的影响由图 2可见:免疫后7 d,A、B、C组小鼠血清中IL-4水平显著高于D组(P<0.05) ,其中,A、B、C组间无显著差异(P>0.05) ;免疫后14、21 d,A组和B组小鼠血清中IL-4水平显著高于C组和D组(P<0.05) ;免疫后28 d,A组小鼠血清中IL-4水平显著高于B组和D组,而与C组无显著差异(P>0.05) 。
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图 2 小鼠免疫后不同时间血清IL-4水平 Figure 2 The serum level of IL-4 in mice at different time |
免疫后7、28 d,A、B、C组小鼠血清中IFN-γ水平均显著高于D组(P<0.05) ,其中,A、B、C组间无显著差异(P>0.05) ;免疫后14 d,A组小鼠血清中IFN-γ水平显著高于B组、C组和D组(P<0.05) ,B、C和D组间无显著差异(P>0.05) ;免疫后21 d,A和B组小鼠血清中IFN-γ水平显著高于C组和D组(P<0.05) ,且A组和B组间无显著差异(P>0.05) ,C组和D组间无显著差异(P>0.05) (图 3)。
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图 3 小鼠免疫后不同时间血清IFN-γ水平 Figure 3 The serum level of IFN-γ in mice at different time |
免疫后7 d,B组SI指数显著高于C组和D组(P<0.05) ,与A组无显著差异(P>0.05) ,其中C组和D组无显著差异;免疫后14 d,B组SI指数显著高于A、C、D组(P<0.05) ,而A、C、D组间无显著差异;免疫21、28 d,各组间T淋巴细胞SI指数均无显著差异(P>0.05) (表 1)。
2.5 脾脏组织学观察脾脏属周围淋巴器官,位于血液循环通路,其组织学形态能从微观角度反映脏器的健康程度及机体血液对侵入体内的抗原的免疫应答功能。从免疫后21 d的脾脏组织学切片观察到:A、B、C组白髓区部均比D组白髓区部面积增大,着色加深,动脉周围淋巴鞘有明显胀大,表明A组Th表位肽和B组Poly(I:C)使用能够显著增强脾脏T细胞的生发,从而提高机体的细胞免疫功能[14](图 4)。
| 免疫后时间/dTime after infection | Th表位肽组Th pepetides group | Poly(I:C)组Poly(I:C)group | 普通疫苗组Vaccine group | 生理盐水组Normal saline group |
| 7 | 1.868±0.3299ab | 1.965±0.4843a | 1.459±0.2449bc | 1.325±0.1628c |
| 14 | 1.355±0.1869b | 1.906±0.1314a | 1.167±0.1334b | 1.278±0.1785b |
| 21 | 1.174±0.2018a | 1.325±0.1758a | 1.341±0.1319a | 1.222±0.1111a |
| 28 | 1.398±0.3740a | 1.424±0.4043a | 1.454±0.1958a | 1.312±0.3087a |
| 注:同一行不同小写字母表示在 0.05 水平上差异显著。 | ||||
| Note: Values within a line followed by different letters are significantly different at the 0.05 level. | ||||
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图 4 免疫21 d后不同处理脾脏组织的HE染色 Figure 4 Histological evaluation of spleen strained with HE of different groups A.Th表位肽疫苗组Th peptides group;B.Poly(I:C)疫苗组Poly(I:C)group;C.普通疫苗组Vaccine group;D.生理盐水组Normal saline group 双箭头示脾脏白髓直径;单箭头示动脉周围胀大的淋巴鞘。 Double arrow shows the diameter of splenic white pulp;The single arrow shows the swelled lymphatic sheath around the artery. |
口蹄疫合成肽疫苗的问世为口蹄疫的防治提出了新思路,但合成肽疫苗的免疫原性差和免疫效能低等问题成为突破难点。FMDV水解后的非结构蛋白上存在着大量Th表位序列,其中有专家学者提出342~371氨基酸段Th表位肽能够加强机体识别抗原的能力并辅助主要组织相容性复合体(MHC-Ⅱ)与外来抗原的结合,促进分泌大量细胞因子,从而有效增强机体对FMDV的抵抗力[15]。Poly(I:C)能参与免疫调节并对Th1、Tc免疫细胞亚群的发育有一定调控作用,同时刺激网状内皮系统,增强吞噬细胞的吞噬功能,增强抗体的形成,有广谱抗病毒和抗肿瘤作用[16],可作为合成肽疫苗的一类潜在增强免疫效力的添加物。
VP1抗体是机体识别FMDV产生的一类物质,在体液免疫评价过程中扮演重要角色,通过其吸光值的检测可间接为血清内中和抗体表达量提供参考[17],这一指标与免疫细胞的中和抗体水平密切相关。本试验结果显示Th表位肽和Poly(I:C)均能显著提高小鼠血清VP1抗体水平,而且Th表位肽可延长小鼠血清中VP1抗体的维持时间,可见上述2种免疫添加剂对机体发生免疫反应有一定积极作用。周春雪等[18]通过比较得出添加ISA206和Poly(I:C)较添加氢氧化铝能更大幅度增加FMDV灭活疫苗的抗体效价,与本试验结果表位肽和Poly(I:C)具有对VP1抗体水平的增加作用基本一致,表明上述2种添加剂确实对促进合成肽疫苗诱发相应抗体产生作用。IL-4主要由活化的T细胞、单核细胞或其他非单核细胞分泌,能够活化、增殖、分化B细胞,诱导机体CD4+等前体细胞分化为Th2效应细胞,与机体体液免疫反应相关[19]。本试验结果表明Th表位肽和Poly(I:C)可使小鼠血清中IL-4水平明显升高,证明2种免疫增强剂都可增强合成肽抗原的体液免疫反应,这一结果也在赵清等[20]的研究中得到证明。在免疫后28 d,Th表位肽组IL-4水平显著高于Poly(I:C)组,且呈上升趋势,与小鼠血清VP1 抗体结果有所不同,原因可能是细胞因子IL-4由多种淋巴细胞、单核细胞或其他非单核细胞分泌,而Th表位的添加特异性的持续刺激了其中某些免疫细胞,使之表达更高水平的IL-4,VP1抗体仅通过FMDV合成肽中VP1肽段刺激机体而产生,故免疫后期表达并不充分。
在FMDV的感染过程中,细胞免疫对机体的保护作用同样必不可少[21]。小鼠脾脏病理切片显示Th表位肽和Poly(I:C)均能使脾脏白髓区增大,同时提高了小鼠血清IFN-γ水平。IFN-γ是Ⅰ型辅助T细胞(Th1细胞)的标志性细胞因子,而Th1细胞主要参与调节细胞免疫,辅助细胞毒性T细胞分化,与细胞免疫应答水平相关。本试验结果表明,Th表位肽和Poly(I:C)免疫增强剂都可促进IFN-γ分泌水平,且Th表位合成肽组在免疫后28 d IFN-γ细胞因子仍处于很高水平,其通过细胞表面受体作用使细胞产生抗病毒蛋白[22],从而保护机体并增强小鼠细胞免疫水平,与Cao等[8]研究结果中Poly(I:C)可使口蹄疫重组亚单位疫苗产生更高水平的特异性中和抗体和IFN-γ一致。有研究人员发现,将口蹄疫重组3D非结构蛋白与重组抗原混合制备的疫苗中淋巴细胞增殖水平明显高于含重组抗原的疫苗[23-24],与本试验中的T淋巴细胞转化率试验结果相似,表明佐剂的使用对T淋巴细胞的增殖有一定作用。孙静静[25]的研究认为口蹄疫3D蛋白Th表位与重组抗原的混合疫苗明显增强淋巴细胞增殖水平,且攻毒保护率由50%提高到75%。
总之,Poly(I:C)能很好地增强机体细胞免疫效力,但价格较昂贵,而试验中含30个氨基酸的Th表位肽采用固相方法合成,工艺简单,成本低,对猪O型口蹄疫合成肽抗原无论是体液免疫,还是细胞免疫增强效果都很明显,是一种潜力较大的免疫增强剂。
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