文章信息
- 王换换, 申正杰, 肖航, 刘小倩, 艾阳, 张源淑
- WANG Huanhuan, SHEN Zhengjie, XIAO Hang, LIU Xiaoqian, AI Yang, ZHANG Yuanshu
- 热应激对肝脏中Keap1-Nrf2信号通路及下游基因表达的影响
- Effects of heat stress on Keap1-Nrf2-ARE signal pathway of liver in dairy cows
- 南京农业大学学报, 2017, 40(1): 151-156
- Journal of Nanjing Agricultural University(Social Science), 2017, 40(1): 151-156.
- http://dx.doi.org/10.7685/jnau.201602023
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文章历史
- 收稿日期: 2016-02-23
热应激是指机体应对温湿环境所产生的非特异性应答反应。当气温高于32 ℃或温湿指数(temperature-humidity index,THI)高于72时动物就会发生热应激[1]。畜禽遭遇热应激容易导致其生产性能、机体免疫力和产品质量下降。奶牛则呈现食欲减退、采食量减少,导致营养物质摄入不足,最终造成产奶量减少、生鲜乳品质下降和免疫力降低,这是夏季奶业生产中面临的主要问题[2]。近年来,受温室气体影响,全球平均温度不断上升,奶牛遭受热应激的程度不断加重。特别在夏季炎热高湿的南方,热应激更是严重制约了奶牛产业的发展。
热应激会引起动物体温上升,体温升高会影响机体内代谢酶的活性,使机体代谢率升高,高代谢率会增加自由基的产生。过多的自由基会打破机体氧化和抗氧化的平衡系统,造成脂质的过氧化,引起蛋白质和DNA的损伤,导致氧化应激的产生[3]。付戴波等[4]研究发现,热应激导致肉牛机体产生了明显的氧化损伤。另外,Keap1-Nrf2-ARE信号通路介导的Ⅱ相解毒酶和抗氧化基因的转录,被认为是细胞抗氧化机制中最重要的通路[5-6]。王菲等[7]研究发现,热诱导氧化应激小鼠肝脏MDA含量升高,SOD和GSH-Px活性有所升高,Keap 1基因表达下调,Nrf2 基因表达上调,并且Nrf2蛋白与基因表达一致。推测Keap1-Nrf2-ARE信号通路可能增加肝脏抵抗应激的能力。Keap1-Nrf2-ARE通路在机体的抗氧化应激方面发挥着多种多样的作用,被发现在多种动物的机体内都存在,但目前有关其在反刍动物方面报道较少。
我国南方为亚热带气候,夏季以高温、高湿为特点,这样的环境下饲养的奶牛面临一系列健康问题,特别热应激问题已经成为我国南方夏季奶业发展的掣肘。本试验以泌乳奶牛为对象,通过分析南京地区夏季6至8月高温、高湿气候条件下,奶牛血液中免疫应激及相关生化指标的变化,并采用反转录PCR技术,对奶牛肝脏中Keap1-Nrf2通路及其下游基因的表达水平进行了检测,以期从Keap1-Nrf2-ARE信号通路介导的Ⅱ相解毒酶 ,谷氨酸-半胱氨酸连接酶修饰亚基(glutamate-cysteine ligase modifier subunit,GCLM)]和抗氧化应激基因的转录两个方面阐明热应激时免疫应激反应增强的相关机制。
1 材料与方法 1.1 试剂与仪器RT-6000型酶标分析仪(深圳雷杜生命科学股份有限公司);核酸浓度测定仪、MIKRO-22R型高速冷冻离心机(德国Eppendorf Biophotometer);组织匀浆器(瑞士Kinematica AG);MyiQ2 Real-time PCR 仪(美国,Bio Rad)等。SYBR Green 荧光酶、P101型RNA反转录试剂盒(南京诺唯赞生物科技有限公司);皮质醇检测试剂盒购自中国朗顿生物科技有限公司;其余试剂均为分析纯。
1.2 试验动物与处理6头健康、体质量(490±7) kg、分娩日期相近的泌乳早期荷斯坦奶牛,饲养于南京农业大学江浦畜牧兽医实验站(北纬32°93′,东经119°82′)。正常饲喂和饮水。采用Cornell-Penn-Miner System(NRC 2001) 设计基础日粮,饲料配方主要为玉米青贮料60%、苜蓿干草17%和精料23%(精料包括豆粕86%、CaHPO45.4%、食盐2.2%和预混料6.4%)。饲料中净能为6.36 MJ·kg-1,粗蛋白16.99%、粗脂肪3.93%、中性洗涤纤维36.54%、酸性洗涤纤维22.51%、非纤维碳水化合物33.67%、钙0.88%以及磷0.43%,以上均为质量分数。
试验期从2013年6月29日至8月5日,共计35 d。每天10:00和18:00记录牛舍温度,统计产奶量,分别于适温(前后1周温度21~26 ℃)与发生热应激1周时(采样前后1周温度为30~38 ℃)采集样品。
1.3 血液样品的采集与处理血液样品分别于试验第1周(前后1周温度21~26 ℃)和最后1周(采样前后1周温度为30~38 ℃)采集。采用真空抗凝管于奶牛进食后2 h收集每头奶牛颈静脉血液。采集后的血液以3 000 r·min-1离心15 min后,血浆样品于-20 ℃保存待测。
1.4 血液中相关指标的测定血浆中相关酶活性测定:包括碱性磷酸酶(AKP)、丙氨酸氨基转移酶(ALT)、天门冬氨酸氨基转移酶(AST)、谷酰转肽酶(GGT)、乳酸脱氢酶(LDH)、脂肪酶(Lipase)。将收集的颈静脉血样送至南京军区总医院用Sysmex-2100全自动血液分析仪检测。
血浆中皮质醇含量测定:采用ELISA法按试剂盒说明书操作,用RT-6000型酶标分析仪测定皮质醇含量(A450)。
1.5 肝脏组织样品的采集在采集血液样品时对奶牛肝脏进行活体穿刺采样。2次采集的肝脏组织样品均先用预冷的生理盐水清洗3 次,然后迅速置于液氮中冷冻,-80 ℃保存。
1.6 肝脏组织匀浆中氧化应激指标的测定取肝组织匀浆液,测定丙二醛(MDA)含量和过氧化氢酶(CAT)、超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)活性,采用南京建成生物工程研究所的试剂盒测定。
1.7 总RNA的提取及其纯度和浓度测定80 mg左右肝脏组织电动匀浆机匀浆后,Trizol抽提法提取总RNA。核酸测定仪测定总RNA浓度和纯度,确定A260/A280值在1.8~2.0范围内,以进行下一步试验。
1.8 肝脏中相关蛋白基因表达水平的RT-PCR分析Real-time PCR方法对肝脏组织中相关蛋白基因的mRNA表达进行检测,包括:热休克蛋白70(heat shock protein 70,HSP70) 和Keap1-Nrf2-ARE信号通路各因子 。
1.8.1 引物设计从GenBank中查阅相关基因序列,根据引物设计原则,利用Primer Primier 5.0软件设计引物序列(表 1),引物由北京鼎国昌盛生物技术有限公司合成。
| 基因Gene | 基因序列号GenBank accession No. | 引物对序列(5′→3′)Primer pairs sequence | 预期产物大小/bpProduct length | 退火温度/℃Annealing temperature |
| GAPDH | NM_001034034.2 | ATCAAGTGGGGTGATGCTGG/TGAAGTCGCAGGAGACAACC | 607 | 60 |
| HSP70 | NM_174550.1 | GCAGTCGGACATGAAGGAGT/CTGTTGTCGAAGTCCTCCCC | 459 | 60 |
| Keap1 | NM_001101142.1 | GGAGGCGGAGCCCGA/GATGCCCTCAATGGACACCA | 462 | 60 |
| Nrf2 | AB162435.1 | CAACTCAGCACCTTGTATC/TTCTTAGTATCTGGCTTCTT | 146 | 60 |
| HO1 | NM_001014912.1 | CAAGCGCTATGTTCAGCGAC/GCTTGAACTTGGTGGCACTG | 206 | 60 |
| GCLC | NM_001083674.1 | GATTAGGCTGCCCTGGGTTCA/GGCTTGGAACGTTACCTGGG | 227 | 60 |
| NQO1 | NM_001034535.1 | GATCGTACTGGCCCACTCAG/TCCAGGCGTTTCTTCCATCC | 618 | 60 |
| GCLM | NM_001038143.1 | TAAATCCCGATGAAAGAG/AACAGGAGGTGAAGCAAT | 155 | 60 |
本试验采用荧光定量PCR SYBR Green染料法对相关基因的mRNA表达进行相对定量分析。反应在MyiQ2 RT-PCR仪上进行,采用20 μL定量反应体系。
以最小的CT值和最高的荧光值及熔解曲线不出现非特异性峰为标准,分别优化退火温度、引物浓度。反应条件:95 ℃ 10 min;95 ℃ 15 s,60 ℃ 30 s,72 ℃ 30 s,40个循环。循环结束后完成熔解曲线,以验证PCR产物的纯度。每个样品至少3个重复,以GAPDH作为内参基因。
实时荧光定量分析采用相对定量法,即2-ΔΔCT法。以GAPDH mRNA的量为参照,计算目的基因的相对量(ΔΔCT)。公式如下:
| $\Delta \Delta {C_T} = {({C_{T,Target}} - {C_{T,GAPDH}})_X} - {({C_{T,Target}} - {C_{T,GAPDH}})_{Control}},$ |
式中:X表示任意一个样本。
1.9 数据统计及分析试验数据经Microsoft Excel 2010初步处理后采用SPSS 16.0单因素方差分析法分析,以x±SE表示,用t测验检验组间差异。
2 结果与分析 2.1 气温变化试验预饲期,气温保持在26 ℃左右。从第1周开始,日间平均气温剧烈上升,总体保持在32 ℃以上,在总共35 d的试验期中,日间平均气温32 ℃以上持续时间达25 d,占试验总时间的68.5%。整个试验期间最高气温为38 ℃。
2.2 热应激对血液中相关酶活性和皮质醇含量的影响如表 2所示:在热应激时血液中AKP活性极显著升高(P<0.01) ;AST、GGT活性升高,ALT活性降低,但差异均不显著(P>0.05) ;脂肪酶活性没有变化。皮质醇含量极显著升高(P<0.01) 。
| 指标Items | 对照组Normal temperature | 热应激组Heat stress |
| 丙氨酸氨基转移酶活性/(U·L-1)ALT activity | 23.67±0.42 | 18.67±1.17 |
| 天门冬氨酸氨基转移酶活性/(U·L-1)AST activity | 55.17±1.30 | 64.33±0.95 |
| 碱性磷酸酶活性/(U·L-1)AKP activity | 4.17±0.31 | 35.50±4.15** |
| 谷酰转肽酶活性/(U·L-1)GGT activity | 29.67±1.09 | 34.17±1.64 |
| 乳酸脱氢酶活性/(U·L-1)LDH activity | 880.50±17.97 | 873.00±11.01 |
| 脂肪酶活性/(U·L-1)Lipase activity | 23.67±0.76 | 23.33±0.99 |
| 皮质醇含量/(ng·mL-1)Cortisol content | 288.21±49.73 | 573.76±11.71** |
| 注: 1) ALT:Alanine aminotransferase;AST:Aspartate aminotransferase;AKP:Alkaline phosphatase;GGT:Glutamyl transpeptidase;LDH:Lactic dehydrogenase. 2) 与常温对照组相比,*表示差异显著(P<0.05) ,* *表示差异极显著(P<0.01) 。Compared to the normal temperature group,*means P<0.05,* * means P<0.01. The same as follows. | ||
由表 3可见:热应激时奶牛肝脏MDA含量较常温时显著升高(P<0.05) ,CAT、SOD和GSH-Px活性有所升高。
| 指标Items | 常温Normal temperature | 热应激Heat stress |
| 丙二醛含量/(nmol·mL-1)MDA content | 3.15±0.42 | 3.70±0.89* |
| 过氧化氢酶活性/(U·mL-1)CAT activity | 2.23±1.10 | 2.60±0.95 |
| 超氧化物歧化酶活性/(U·mL-1)SOD activity | 85.54±11.31 | 105.81±17.97 |
| 谷胱甘肽过氧化物酶活性/(U·mL-1)GSH-Px activity | 115.28±12.09 | 115.46±11.64 |
| Note:MDA:Malondialdehyde;CAT:Catalase;SOD:Superoxide dismutase;GSH-Px:Glutathione peroxidase | ||
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图 1 肝脏中HSP 70 mRNA的表达变化(n=6) Figure 1 HSP 70 mRNA expression changes in liver |
如图 1所示:热应激时奶牛肝脏组织内HSP 70 mRNA相对表达水平较常温时极显著升高(P<0.01) 。
2.5 热应激对肝脏中Keap1-Nrf2通路及下游基因表达的影响由图 2可见:奶牛在热应激时其Keap 1和Nrf2 mRNA表达较常温时均有极显著升高(P<0.01) 。
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图 2 热应激下肝脏组织中Keap 1 和Nrf2 mRNA的表达(n=6) Figure 2 The mRNA expression of Keap 1 and Nrf2 under heat stress in liver Keap 1 :Kelch-样环氧氯丙烷相关蛋白1基因Kelch-like ECH-associated protein 1 gene;Nrf 2 :核因子E2相关因子2基因Nuclear factor erythroid 2-related factor 2 gene |
同时,我们对Nrf2通路的4个下游基因的mRNA表达水平进行了检测(图 3)。结果显示:与常温时相比,热应激时奶牛Nrf2通路4个下游基因(HO 1、GCLC、NQO1和GCLM )中,HO 1和NQO1 mRNA表达显著升高(P<0.05) ,GCLC和GCLM mRNA表达有所升高,但差异不显著(P>0.05) 。
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图 3 热应激下Nrf 2 下游4个基因 mRNA表达(n=6) Figure 3 The downstream genes mRNA expression of Nrf 2 under heat stress HO 1 :血红素氧合酶1基因Heme oxygenase-1;GCLC:谷氨酰半胱氨酸合成酶催化亚单位基因Glutamate-cysteine ligase catalytic subunit gene;NQO 1 :醌氧化还原酶1基因NAD(P)H dehydrogenase -1 gene;GCLM:谷氨酸-半胱氨酸连接酶修饰亚基基因Glutamate-cysteine ligase modifier subunit gene |
目前对于热应激的各项判定标准中,最为常用的是温湿指数(THI)。根据已有研究结果,按照THI的计算公式[8],若以湿度为0作前提,当温度达到32 ℃时,THI最低值为72。这一数值即为奶牛发生热应激的最低THI。奶牛生性喜温怕热,最适环境温度为10~15 ℃,当温度高于22 ℃或温湿指数(THI)超过72时,就出现热应激状态。本试验于2013年6月29日至2013年8月5日对南京农业大学江浦畜牧兽医实验站牛舍的温度进行检测,结果发现日间平均气温32 ℃以上持续时间达25 d,最高温度为38 ℃,高温持续时间远远超过72 h,即此气候条件下奶牛处于热应激状态。应激状态下,机体内源性皮质醇的分泌量会激增,帮助机体抵抗应激刺激,特别是乳房炎、败血症、子宫内膜炎等炎症应激反应[9]。因此,血浆皮质醇水平常被作为机体是否处于应激状态或应激强度的客观指标。Wise等[10]报道,热应激时奶牛血液中皮质醇含量升高。李建国等[11]研究发现,不同热应激对奶牛血液中皮质醇影响不同,急性热应激时升高,而慢性热应激时则降低。穆玉云[12]的研究表明,热应激时不耐热牛的皮质醇水平变化较大,慢性热应激时会有所降低,而耐热牛则会升高。本试验检测到热应激引起了奶牛皮质醇水平极显著升高,与Wise等[10]的结论一致。
有研究表明,热应激促进皮质醇与儿茶酚胺的释放,并可诱导O2 ·- 与OH-等自由基的产生,导致细胞膜内脂质过氧化物的生成,引起氧化应激[13]。Lin等[14]报道热应激会导致机体的活性氧产生增加,引起氧化应激,并且,对抵抗应激反应能力较弱的肝脏组织损伤尤其明显。王菲等[7]发现,热应激诱导小鼠肝脏MDA含量升高,SOD和GSH-Px活性有所升高。Yang等[15]研究显示,热应激可使肉鸡活性氧(ROS)活性显著升高,脂质过氧化增加,线粒体呼吸链功能及抗氧化酶活性显著降低,肝脏MDA合成增加。本试验中,热应激时奶牛肝脏MDA含量升高,CAT、SOD和GSH-Px活性有所升高,与以上研究结果一致。
当奶牛热应激发生时,发挥拮抗热应激保护机体的一个重要蛋白就是HSP70(heat shock protein 70) 。由于其mRNA在低温下快速分解的特性,HSP70的调节主要发生在转录环节[16]。本试验发现,热应激时奶牛肝脏内HSP 70 mRNA表达水平极显著升高,证实在试验的第5周奶牛发生了热应激。
碱性磷酸酶(AKP)存在于机体的多种组织中,血液中的AKP主要来源是肝脏和骨骼组织[17]。泌乳期奶牛需要大量Ca2+,Ardeshirpour等[18]研究发现,泌乳可以造成骨骼组织的损失,血液中AKP浓度升高。从这一角度来看,血液中AKP浓度的升高可能是由于奶牛泌乳期动员骨骼组织供应Ca2+,从而发生的一种正常变化。另一方面,当肝细胞发生损伤时,也可以在血液中检测到升高的AKP。薛瑞益[19]在对围产期奶牛代谢活动研究中发现,脂代谢异常引起肝脏发生氧化应激时,奶牛血液中AKP活性会升高。从这一角度来说,若血液中升高的AKP来自于肝脏,则提示热应激可能引起一定的肝脏损伤。本试验检测到血液AKP活性显著升高,一方面可能是由于奶牛对骨骼组织动员产生的结果,另一方面也可能是由于热应激引起肝脏损伤而产生的病理性结果,或两者兼有。其详细机制有待进一步研究。
Keap1-Nrf2-ARE信号通路介导的Ⅱ相解毒酶和抗氧化基因的转录,被认为是细胞抗氧化机制中最重要的通路。在氧化应激原的作用下,Keap l上的2个半胱氨酸位点C273和C288被同时修饰,致使Keapl与Nrf2的偶联及泛素化酶对Nrf2的泛素化作用减弱或消除,Nrf2 与Keapl解偶联后转入核内,与抗氧化反应元件ARE相结合,启动下游抗氧化基因及Ⅱ相解毒酶的表达,包括HO 1、GCLC、NQO1和GCLM 等,发挥强大的抗氧化损伤能力[20-22]。有关该通路在热应激时的相应变化研究尚不多见。
基于以上推测,我们检测了肝脏中Keap1-Nrf2-ARE信号通路及其下游基因的mRNA水平。研究发现热应激时奶牛肝脏中Keap 1与Nrf2 mRNA表达水平均显著升高,说明奶牛肝脏发生了氧化应激。Nrf2下游4个抗氧化基因中,HO 1 和NQO1 mRNA表达水平显著升高,而GCLM、GCLC mRNA表达水平有升高但差异不显著,说明热应激时肝脏中Keap1-Nrf2-ARE信号通路处于激活状态,即抗氧化损伤机制处于活跃状态,这与蔡维霞等[5]的研究结果一致。本试验结果表明，夏季高温应激可致奶牛肝脏中Keap1-Nrf2-ARE信号通路介导的Ⅱ相解毒酶和抗氧化基因的转录通路被激活,在抵抗肝脏应激、保护机体健康方面可能具有重要作用。
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