南京农业大学学报  2017, Vol. 40 Issue (1): 145-150   PDF    
http://dx.doi.org/10.7685/jnau.201601018
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文章信息

白五娇, 金鹏锦, 邝美倩, 魏全伟, 石放雄, 茆达干
BAI Wujiao, JIN Pengjin, KUANG Meiqian, WEI Quanwei, SHI Fangxiong, MAO Dagan
热应激对黄体孕酮代谢通路的影响
Effects of heat stress on the pathway associated with luteal progesterone metabolism
南京农业大学学报, 2017, 40(1): 145-150
Journal of Nanjing Agricultural University(Social Science), 2017, 40(1): 145-150.
http://dx.doi.org/10.7685/jnau.201601018

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收稿日期: 2016-01-11
引用本文
白五娇, 金鹏锦, 邝美倩, 等. 热应激对黄体孕酮代谢通路的影响[J]. 南京农业大学学报, 2017, 40(1): 145-150.
BAI Wujiao, JIN Pengjin, KUANG Meiqian, et al. Effects of heat stress on the pathway associated with luteal progesterone metabolism[J]. Journal of Nanjing Agricultural University(Social Science), 2017, 40(1): 145-150.  DOI: 10.7685/jnau.201601018
热应激对黄体孕酮代谢通路的影响
白五娇, 金鹏锦, 邝美倩, 魏全伟, 石放雄, 茆达干    
南京农业大学动物科技学院, 江苏 南京 210095
收稿日期: 2016-01-11
基金项目: 国家自然科学基金项目（31501956）；中央高校基本科研业务费专项资金
作者简介: 白五娇,硕士研究生
通讯作者: 茆达干,教授,博士,研究方向为动物生殖生理与调控,E-mail:maodagan@njau.edu.cn
摘要: [目的] 以假孕大鼠为模型，探讨热应激对氯前列烯醇（PGF）诱导的黄体退化过程中孕酮水平及其代谢通路相关蛋白表达的影响。 [方法] 用PMSG/hCG（D0）联合处理50只大鼠，诱导假孕，然后随机分为非热应激（NHS）和热应激（HS）两组。每天在相同时间，将HS组置于40℃应激2 h。假孕第7天，热应激结束2 h后，各组大鼠以PGF分别处理0、1、2、8和24 h后屠宰，收集血清和卵巢组织。用酶联免疫法检测血清孕酮浓度，蛋白免疫印迹法和免疫组织化学法检测孕酮水平及其代谢通路相关蛋白的表达。 [结果] 热应激前、后假孕大鼠的直肠温度差异显著（P<0.05）；PGF降低了两组大鼠血清孕酮浓度，热应激抑制了PGF诱导的孕酮浓度下降（P<0.05）；PGF或热应激处理对PKA磷酸化底物、StAR、P450scc、3βHSD及NR4A1-F表达均无显著影响（P>0.05），但均诱导NR4A1-S表达上调（P<0.05），且热应激降低PGF诱导的NR4A1-S表达（Plt;0.05）；PKA磷酸化底物主要在类固醇生成细胞的细胞核中表达，而StAR、P450scc、3βHSD和NR4A1-F均在类固醇生成细胞的细胞质表达。 [结论] 热应激降低了PGF诱导的假孕大鼠黄体退化过程中NR4A1-S的表达，提示NR4A1-S可能参与调控黄体退化过程中孕酮的代谢。
关键词： 热应激    假孕大鼠    前列腺素F2α    黄体退化    孕酮    NR4A1   
Effects of heat stress on the pathway associated with luteal progesterone metabolism
BAI Wujiao, JIN Pengjin, KUANG Meiqian, WEI Quanwei, SHI Fangxiong, MAO Dagan    
College of Animal Science and Technology, Nanjing Agricultural University, Nanjing 210095, China
Abstract: [Objectives] This study was designed to investigate the effect of heat stress on the pathway associated with the progesterone synthesis and catabolism during cloprostenol(prostaglandin F2α analogue,PGF)-induced luteal regression in pseudopregnant rats. [Methods] A total of 50 rats were induced pseudopregnancy by sequential PMSG/hCG(D0) treatment paradigm and randomly distributed into non-heat stress(NHS) group and heat stress(HS) group. The rats in HS group were exposed to 40℃ at the same time every day for 2 h. On day 7 of pseudopregnancy,after 2 h post-stress recovery,rats were treated with PGF for 0,1,2,8 or 24 h and then were sampled. Blood were collected to determine serum concentrations of progesterone by enzyme-linked immunosorbent assay,and ovaries were collected to determine the proteins associated with the progesterone metablism by western blot and immunohistochemistry. [Results] The changes in the rectal temperature in pseudopregnant rats was significant before and after heat stress(P<0.05);PGF decreased progesterone concentrations in both HS and NHS groups,and heat stress blunted PGF-induced decline in the progesterone concentrations(P<0.05);PGF or heat treatment alone didn't alter the expressions of phospho-PKA substrates,StAR,P450scc,3βHSD and NR4A1-F(P>0.05),but significantly increased NR4A1-S expression(P<0.05). Furthermore,heat stress reduced NR4A1-S expression in response to PGF(P<0.05);the phospho-PKA substrates expressed mainly in the nuclei of steroidogenic cells,while StAR,P450scc,3βHSD and NR4A1-F uniformly expressed in the cytoplasm of steroidogenic cells. [Conclusions] Heat stress could reduce PGF-induced NR4A1-S expressions in pseudopregnant rats,which might be correlated with regulation of the progesterone catabolism during luteal regression.
Key words: heat stress    pseudopregnant rats    prostaglandin F2α    luteal regression    progesterone    NR4A1   

近年来,随着畜牧业集约化和产业化的发展,热应激对动物生产带来的负面影响已受到研究者的广泛关注。热应激影响雌性动物的发情、卵泡发育、卵母细胞成熟和早期胚胎发育等[1]。虽然其机制尚未十分明确,但已有研究表明热应激通过干扰动物的生殖内分泌等发挥作用。热应激抑制促性腺激素释放激素(gonadotropin-releasing hormone,GnRH)分泌,影响了垂体活动,导致排卵障碍,黄体生成及孕酮的分泌受到抑制[2]。

孕酮在维持妊娠和调节发情周期中具有重要作用。低水平的孕酮导致卵泡发育障碍,进而引起异常卵母细胞成熟和早期胚胎死亡[3]。孕酮合成是一系列连续过程,包括胆固醇的吸收、合成、转运以及转化为孕酮,其中任一环节的异常都将影响孕酮的合成。故与孕酮合成相关的蛋白和酶的表达[4],如蛋白激酶A(protein kinase A,PKA)、类固醇合成急性调节蛋白(steroidogenic acute regulatory protein,StAR)、细胞色素P450胆固醇侧链裂解酶(cytochrome P450 cholesterol side-chain cleavage enzyme,P450scc)和3β羟基类固醇脱氢酶(3beta hydroxysteroid dehydrogenase,3βHSD),对黄体功能的维持具有关键作用。啮齿类动物血清孕酮含量还与20α-羟类固醇脱氢酶(20 alpha-hydroxysteroid dehydrogenase,20α-HSD)的表达有关,该酶将孕酮代谢为20α-羟孕酮(20 alpha-hydroxyprogesterone,20α-OHP)[5]。前列腺素F2α(PGF2α)诱导的假孕大鼠黄体退化过程中,孕酮浓度降低,同时20α-OHP浓度升高,且PGF2α诱导的 20α-HSD的升高与Nur77/NR4A1 mRNA的表达上升有关[5]。

目前,PGF2α诱导的黄体退化对孕酮水平及其代谢的影响有了广泛研究,但热应激调控黄体退化的分子机制尚不清楚。本研究以热应激对PGF诱导的黄体退化过程中孕酮水平的影响为切入点,以假孕大鼠为模型,从孕酮合成早期通路PKA活性、孕酮合成的关键蛋白及NR4A1 3个层次,探讨热应激影响孕酮水平的机制,为研究热应激对雌性生殖机能的影响提供理论依据。

1 材料与方法 1.1 试验动物

体质量为(45±5) g的3周龄SD雌性大鼠50只,购于南京青龙山实验动物研究所。在人工控制条件下,分笼饲养(每笼5只);鼠房温度22~25 ℃,光照明/暗周期为12 h/12 h;自由采食、饮水。

1.2 主要试剂和仪器

PMSG和hCG购自浙江省宁波三生药业有限公司;氯前列烯醇(PGF)购自辽宁省丹东何华动物制药公司;孕酮(P)酶联免疫测定(ELISA)试剂盒购自上海百蕊生物技术有限公司;HRP标记的羊抗兔IgG(SN134) 和HRP标记的羊抗小鼠IgG(SN133) 购自南京生兴生物技术有限公司;ECL试剂盒购自上海天能科技有限公司;SABC试剂盒购自武汉博士德生物工程有限公司;其他试剂均为国产分析纯。发光图像分析仪(LAS-4000) 购自日本的FUJIFILM公司。

1.3 试验分组

大鼠在室温下适应性饲养1周后,经腹腔注射PMSG,每只30 IU,促进卵泡发育。48 h后,注射hCG,每只30 IU,以促进排卵及黄体化[6],记为第0天。然后按照体质量相近原则随机分为两组,非热应激(non-heat stress,NHS)组和热应激(heat stress,HS)组。每天在相同时间(11:00—13:00) 将HS组置于预先加热到设定温度的隔水式培养箱(温度40 ℃),连续热应激7 d,并在热应激前后测量直肠温度[7]。第7天,热应激结束后2 h,腹腔注射PGF,每只30 IU,分别在处理后0、1、2、8或24 h颈椎脱臼法处死大鼠。收集血清,1 000 r·min-1离心10 min,取上清液。取出大鼠双侧卵巢,一侧置于4%多聚甲醛固定液中固定,用于免疫组织化学分析;另一侧置于液氮速冻后于-80 ℃保存,用于后续试验。

1.4 测定指标和方法 1.4.1 直肠温度的测定

每次热应激前、后,分别用电子体温计测定试验大鼠的直肠温度。

1.4.2 血清孕酮的测定

大鼠血清中孕酮水平用ELISA试剂盒测定。

1.4.3 蛋白免疫印迹分析

具体步骤参照Meng等[8]方法,用RIPA裂解法提取卵巢组织总蛋白,并用BCA法测定蛋白浓度。一抗(1:1 000) 为PKA磷酸化底物(# 9261,Cell Signaling)、StAR(sc-25806,Santa Cruz)、P450scc和3βHSD(内布拉斯加大学医学中心Davis JS博士赠予)、Nur77(NR4A1-F,554088,BD PharmingenTM)及NR4A1(NR4A1-S,CBX00289,Cosmo Bio),以α-tublin(M0203,CMC Sci)为内参,应用Image J软件进行灰度分析。

1.4.4 免疫组织化学分析

选取7 d非热应激组进行检测,具体步骤参照Wang等[9]的方法,采用SABC法测定。一抗(1:200) 为NR4A1(NR4A1-F,A6676,ABclonal)及1.4.3节中的抗体。以PBS缓冲液代替一抗作为阴性对照。显微镜下观察,有棕黄色染者为阳性。

1.5 数据统计与分析

试验数据用GraphPad 5.0软件进行整理,差异显著性检验采用ANOVA的Bonferroni检验法进行多重比较。统计结果以x±SE表示。

2 结果与分析 2.1 热应激对假孕大鼠直肠温度的影响

测定热应激前、后大鼠的直肠温度,发现热应激后的直肠温度显著升高(P<0.05,表 1),表明热应激模型成功。

表 1 热应激前、后假孕大鼠直肠温度的变化(n=25) Table 1 The changes of rectal temperature before and after heat stress in pseudopregnant rats
℃
热处理持续时间/d Duration of heat stress
1234567
热处理前Before heat stress35.86±0.1636.18±0.1736.63±0.1335.64±0.1535.69±0.1135.56±0.1435.75±0.11
热处理后After heat stress39.06±0.10*39.02±0.13*38.98±0.22*39.00±0.13*38.92±0.12*38.76±0.12*39.13±0.11*
 注: *表示与对照组(热应激前)相比,差异显著(P<0.05) 。 *means significant differences between before and after heat stress(P<0.05) .
表选项
2.2 热应激对假孕大鼠血清孕酮水平的影响

在假孕第7天,两组大鼠均用PGF(0、1、2、8和24 h)诱导黄体退化,比较不同时间点孕酮水平变化。结果(图 1)显示:与对照组(0 h)相比,PGF处理显著降低两组大鼠孕酮在处理后1、2和8 h的水平(P<0.05) ,但是在24 h又恢复到正常水平;HS组血清孕酮水平在1 h和 2 h则显著高于NHS组(P<0.05) ,表明热应激抑制了PGF诱导的假孕大鼠血清孕酮水平下降。

图 1 热应激对假孕大鼠氯前列烯醇(PGF)诱导的黄体退化过程中孕酮水平的影响 Figure 1 The effect of heat stress on the progesterone level during PGF-induced luteal regression in pseudopregnant rats 1) HS:热应激组 Heat stress group;NHS:非热应激组Non-heat stress group
2) 不同字母表示差异显著(P<0.05) 。The different letters mean significant differences(P<0.05) . The same as follows.
图选项
2.3 热应激对假孕大鼠孕酮代谢途径相关蛋白表达的影响 2.3.1 热应激对孕酮合成早期通路PKA磷酸化底物蛋白表达量的影响

为了检测热应激对孕酮合成通路早期PKA活性的影响,本试验采用针对(Ser/Thr)位点磷酸化抗体检测PKA磷酸化底物的状态。如图 2所示:热应激对假孕大鼠PGF诱导的黄体退化过程中PKA磷酸化底物蛋白的表达无影响(P>0.05) 。

图 2 热应激对假孕大鼠PGF诱导的黄体退化过程中 PKA磷酸化底物蛋白水平的影响 Figure 2 The effect of heat stress on the expression of phospho-PKA substrates during PGF-induced luteal regression in pseudopregnant rats
图选项
2.3.2 热应激对孕酮合成的关键蛋白表达量的影响

孕酮以胆固醇为底物,胆固醇在StAR的作用下进入线粒体内膜,被位于内膜的P450scc催化形成孕烯醇酮,然后在3βHSD的作用下生成孕酮[4]。为此本试验检测了促孕酮合成的StAR、P450scc和3βHSD这3种关键蛋白的表达。如图 3所示:热应激对假孕大鼠PGF诱导的黄体退化过程中StAR、P450scc和3βHSD蛋白的表达无影响(P>0.05) 。

图 3 热应激对假孕大鼠PGF诱导的黄体退化过程中 StAR、P450scc和3βHSD蛋白水平的影响 Figure 3 The effect of heat stress on the expression of StAR,P450scc and 3βHSD during PGF-induced luteal regression in pseudopregnant rats
图选项
2.3.3 热应激对NR4A1蛋白表达量的影响

NR4A1与啮齿动物孕酮的分解代谢密切相关,但先前研究主要集中在mRNA水平,本试验利用2种NR4A1抗体进行检测,结果发现针对其全长片段量[相对分子质量(6.6~8.8) ×104]的NR4A1(NR4A1-F)和针对其氨基酸序列第50~200的片段(相对分子质量约3.5×104) 的变异体NR4A1(NR4A1-S)。如图 4所示:热应激对假孕大鼠PGF诱导的黄体退化过程中NR4A1-F蛋白的表达无影响(P>0.05) ,但PGF或热应激单一处理均显著提高了NR4A1-S蛋白的表达,HS组NR4A1-S 水平在PGF处理后1 h和2 h明显低于NHS组(P<0.05) 。

图 4 热应激对假孕大鼠PGF诱导的黄体退化过程中NR4A1-F和NR4A1-S蛋白表达的影响 Figure 4 The effect of heat stress on the expression of NR4A1-F and NR4A1-S during PGF-induced luteal regression in pseudopregnant rats
图选项
2.4 假孕大鼠孕酮生成及代谢途径相关蛋白免疫组织学的定位特征

利用免疫组织化学方法系统地对PKA磷酸化底物、StAR、P450scc、3βHSD和NR4A1-F蛋白在假孕大鼠黄体中的定位特征进行了研究。如图 5所示:在假孕大鼠的黄体中,PKA磷酸化底物主要在类固醇生成细胞的细胞核中表达;StAR、P450scc、3βHSD和NR4A1-F均在类固醇生成细胞的细胞质中表达。

图 5 PKA磷酸化底物、StAR、P450scc、3βHSD和NR4A1-F在假孕大鼠黄体中的定位 Figure 5 Localization of phospho-PKA substrates,StAR,P450scc,3βHSD and NR4A1-F in the corpus luteum of pseudopregnant rats NC:阴性对照 Negative control;SC:类固醇生成细胞 Steroidogenic cells;NSC:非类固醇生成细胞 Non-steroidogenic cells
图选项
3 讨论

热应激主要通过两大机制引起生殖障碍[1]。一方面,热应激通过动力学改变体温,继而影响生殖功能,如重新分配机体的血流以增加散热消耗,减少采食量以降低代谢产热,改变能量平衡和养分利用率,从而影响发情周期、妊娠维持和胚胎发育。另一方面,热应激直接影响生殖轴或间接影响与性腺功能相关的其他细胞功能。

动物热应激前、后的直肠温度差值是评定其遭受热应激最直观的指标[7]。本研究中,热应激前、后大鼠的直肠温度差异显著,表明建立的大鼠热应激模型可行。在包括啮齿类动物在内的物种中,子宫分泌的PGF2α作为溶黄体素,在妊娠末期和分娩前启动黄体溶解。本试验结果表明PGF处理8 h内显著降低了血清孕酮水平,与我们之前的研究结果一致[6]。但其在24 h又恢复到正常浓度,与Kurusu等[10]以PGF2α(每只30 μg)处理假孕6 d的大鼠效果相似,即短暂的PGF处理不足以引起孕酮水平的持续下降。同时热应激抑制了PGF诱导的孕酮水平的下降,提示热应激可能抑制黄体退化过程中的孕酮水平下降,这与Kurowicka等[11]报道的高温提高间情期大鼠孕酮水平一致。推测这应该是由于热应激影响了孕酮的合成或分解代谢途径。

众多研究表明,孕酮合成主要受到上游cAMP/PKA及主要调节蛋白StAR、P450scc和3βHSD等相关因素的调控[4]。本试验观察到PGF或热应激单一处理对以上4个促类固醇生成相关蛋白的表达均无影响,提示PGF及热应激不影响黄体退化过程中孕酮生成途径。这与Stocco等[12]如下观点一致:大鼠黄体功能下降,不是由于PGF2α抑制孕酮的合成,而是由于促进了20α-HSD的酶活性,加速孕酮代谢,从而将其转变为无生物活性的代谢产物20α-OHP。

外源PGF2α处理假孕第8天大鼠[5]或发情中期母牛的黄体细胞[5],均促进 20 α-HSD基因快速大量表达。进一步研究发现,PGF2α调控20α-HSD启动子的上游区域,该区域包含1个与Nur77特异结合的位点和1个Nur77反应元件。Sudeshna等[5]研究表明PGF2α处理后3 h,Nur 77 mRNA表达显著增加,但可能与PGF2α处理诱导的黄体细胞凋亡有关。Nur77还参与调节其他类固醇基因表达,如Nur 77(NR4A1 -F)过表达促进人卵巢的 3βHSD、StAR、CYP11A1和CYP17 基因的表达[13]。但在本试验中,PGF2α或热应激单一处理均未影响NR4A1-F的表达,也未影响PKA磷酸化底物、StAR、P450scc和3βHSD蛋白的表达,但快速诱导NR4A1-S的表达,可能是单独热应激影响卵巢内与Nur77有关的其他通路,但需要进一步的试验加以证实。而且,热应激降低了PGF诱导的NR4A1-S表达水平,这与热应激抑制了PGF诱导的孕酮水平下降一致,提示NR4A1-S表达可能与孕酮的分解代谢有关。Nur77(NR4A1-F)包括3个结构域:N端的转录激活区(TAD/AF-1、1-267AA)、中间的DNA结合域(DBD、268-354AA)和C端配体结合域(LBD、367-598AA)。Li等[14]研究认为:TAD和DBD,而非LBD诱导了细胞迁移、通透性和肌动蛋白应力纤维的形成,并进一步证明了TAD的41~60氨基酸片段是调节这些功能必不可少的。本试验中NR4A1-S为针对50~200氨基酸片段设计的抗体所检测。因此我们推测,大鼠NR4A1-S可能是NR4A1-F的部分片段或者其剪接体,并可能参与黄体中孕酮分解代谢,但目前国内外未见相关报道。

已有研究表明了促进孕酮合成的PKA磷酸化底物肽、StAR、P450scc和3βHSD蛋白在类固醇生成细胞中的定位[12]。本试验的免疫组织化学结果显示,NR4A1-F主要在类固醇生成细胞的细胞质中表达,这与以前的研究结果一致[15]。研究显示NR4A1通过对靶细胞基因转录的调节,参与细胞增殖、凋亡的调控,其功能与其细胞亚定位有关,NR4A1定位于细胞核发挥促存活作用,而定位于细胞质则发挥抗凋亡作用[16]。研究表明,NR4A1在新鲜黄体细胞中表达量显著高于陈旧黄体细胞,表明NR4A1可能在黄体细胞凋亡过程中起调控作用[17-18]。因此,本试验中检测到的NR4A1-F可能参与维持黄体细胞的功能,然而所用的NR4A1-S抗体并没有检测到NR4A1-S的定位,可能是该抗体不适合用于免疫组织化学研究所致。

本试验结果表明,热应激降低了黄体细胞对PGF的敏感性,干扰了NR4A1-S蛋白的表达,从而抑制孕酮分解代谢。这也为解释夏季猪的分娩率降低[19]、分娩时间延长[20]和牛的发情周期延长[21]提供了证据。总之,热应激可能通过NR4A1-S调节孕酮分解代解途径,短暂干扰假孕大鼠PGF诱导的黄体孕酮的下降。对卵巢黄体NR4A1的深入研究将可能为抗热应激提供一条新的途径。

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