文章信息
- 沈怡斐, 鄂垚瑶, 阳芳, 张楠, 黄启为, 沈其荣
- SHEN Yifei, E Yaoyao, YANG Fang, ZHANG Nan, HUANG Qiwei, SHEN Qirong
- 西瓜根系分泌物中氨基酸组分对多黏类芽孢杆菌SQR-21趋化性及根际定殖的影响
- Effects of amino acids in root exudates of watermelon on the chemotactic reaction and root colonization of Paenibacillus polymyxa SQR-21
- 南京农业大学学报, 2017, 40(1): 101-108
- Journal of Nanjing Agricultural University(Social Science), 2017, 40(1): 101-108.
- http://dx.doi.org/10.7685/jnau.201603051
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文章历史
- 收稿日期: 2016-03-26
植物根际促生细菌(plant growth-promoting rhizobacteria,PGPR)是一类能在植物根际存活和定殖并具有促进植物生长或/及防控土传病害能力的有益微生物[1]。PGPRs可通过合成植物激素(吲哚乙酸、细胞分裂素、赤霉素等[2]),提高土壤中矿物质和氮素有效性(固氮、解钾和溶磷作用等[3])以及释放挥发性有机物质(如2,3-丁二醇和乙偶姻[4])等途径直接促进植物生长,并通过产生抗生素类物质,与病原菌竞争空间和营养,以及诱导植物系统抗性等[5]机制防控土传病害。PGPR菌株因其环境友好、安全无毒等优点,常与腐熟堆肥混合制成微生物有机肥,在农业生产中得到广泛应用,并在促进作物生长及防控土传病害等方面取得良好效果[6]。多黏类芽孢杆菌(Paenibacillus polymyxa)是一类具有重要生防作用的PGPR菌株,在农业生产领域具有广阔的应用前景[7]。
PGPR在植物根际的存活和定殖对于其充分发挥促生和防病作用至关重要,也是拮抗土传病原菌的重要机制之一,该定殖过程主要包括促生菌向根际的趋化和在根际聚集形成生物被膜两个步骤,其中前者是后者的基础和前提。趋化性(chemotaxis)指微生物对多种化学物质的浓度梯度产生趋向或趋避响应的行为[8],是微生物适应环境变化而生存的一种基本属性。研究表明PGPR向植物根际的趋化与其根际定殖与促生/生防功能发挥密切相关,且该过程主要由宿主植物产生的根系分泌物所介导[9]。目前关于植物根系分泌物中诱导根际微生物趋化的特定信号物质的研究已有较多报道,主要包括氨基酸和小分子有机酸等。Tan等[10]研究结果表明:苹果酸、柠檬酸、琥珀酸和延胡索酸可以显著诱导解淀粉枯草芽孢杆菌T-5的趋化作用。de Weert等[11]研究发现荧光假单胞菌WCS365对番茄根系分泌物中的天冬氨酸、谷氨酸、异亮氨酸等氨基酸均表现出明显的趋化性。
西瓜在世界园艺业中占有重要地位,西瓜枯萎病是西瓜连作生物障碍的主要病害之一,严重影响西瓜产业的发展,利用PGPR抑制西瓜尖孢镰刀菌,控制西瓜土传枯萎病的发生,是一种很有前景的生物防控方法。多黏类芽孢杆菌SQR-21是本实验室分离的一株兼具促生及生防特性的根际促生菌,施用由菌株SQR-21制成的生物有机肥能够显著降低西瓜枯萎病病土中尖孢镰刀菌的数量[12]。西瓜根系分泌物中的苹果酸、柠檬酸等小分子有机酸可显著诱导菌株SQR-21的趋化性并提高其根际定殖能力[13],但西瓜根系分泌物中的氨基酸类物质对菌株SQR-21趋化性及根际定殖的影响尚不明确。本研究拟鉴定西瓜根系分泌物中的主要氨基酸组分,并比较菌株SQR-21对不同氨基酸组分的趋化性,最终通过原位试验研究外源添加趋化氨基酸对菌株SQR-21在西瓜根际定殖的影响,旨在进一步揭示菌株SQR-21与西瓜根系的互作机制,并为指导合理施用相关微生物肥料提供理论依据。
1 材料与方法 1.1 供试材料 1.1.1 供试植物西瓜品种为‘早佳84-24’,种子购于南京市蔬菜科学研究所。
1.1.2 供试菌株多黏类芽孢杆菌(Paenibacillus polymyxa)SQR-21保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心,CGMCC菌株编号为1544,由江苏省有机固体废弃物资源化利用重点实验室分离、鉴定,并经试验证明对黄瓜和西瓜枯萎病具有很好的防控效果。
1.1.3 培养基与主要试剂BHIS液体培养基:牛心脑浸液培养基13.3 g · L-1、蔗糖100 g · L-1,pH自然。
TSB固体培养基:胰蛋白胨15 g · L-1、大豆蛋白胨5 g · L-1、氯化钠5 g · L-1,pH7.2。
Hoagland营养液:Ca(NO3)2 · 4H2O 945 mg · L-1、KNO3 506 mg · L-1、NH4NO3 80 mg · L-1、KH2PO4 136 mg · L-1、MgSO4 493 mg · L-1、铁盐溶液2.5 mL,pH6.8。
铁盐溶液:FeSO4 · 7H2O 5.56 g · L-1、EDTA-Na2 7.46 g · L-1,pH5.5。
趋化缓冲液:K2HPO4 4.4 g · L-1、KH2PO4 4.2 g · L-1、EDTA-Na2 7.45 mg · L-1,pH7.0。
氨基酸标准品(组氨酸、精氨酸、苯丙氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、酪氨酸、天冬氨酸、天冬酰胺、甘氨酸、谷氨酸、谷氨酰胺、赖氨酸、丝氨酸、色氨酸、脯氨酸、甲硫氨酸、苏氨酸、丙氨酸、半胱氨酸)均购于南京鼎思生物技术有限公司。牛心脑浸液培养基购于南京辉亚生物科技有限公司。
1.2 试验方法 1.2.1 无菌西瓜苗培养选取籽粒饱满的西瓜种子,用70%的乙醇浸泡15 s后,于1 g ·L-1 HgCl2溶液中表面消毒10 min,再用无菌水反复漂洗10次,在室温条件下浸种8 h,然后将种子放入垫有湿润无菌滤纸的器皿中,置于30 ℃培养箱中保温催芽。种子露白后选取发芽程度一致的种子播入盛有无菌混合基质(石英砂和蛭石的质量比为1:1) 的300 mL组培瓶中,待幼苗子叶展开后移栽到装有40 mL无菌1/2 Hoagland营养液(pH6.8) 的50 mL三角瓶中。西瓜幼苗置于28 ℃温室中培养,光照16 h/黑暗8 h,每3 d更换1次营养液。
1.2.2 西瓜根系分泌物收集采用水溶液培养收集法,选取5~6片真叶的西瓜苗进行根系分泌物收集。将生长良好的植株从营养液中取出,用无菌水反复冲洗根系至无营养液残留,将西瓜幼苗根系完全没入装有40 mL无菌去离子水的50 mL三角瓶中,置于28 ℃温室中培养,1个光照周期(光照16 h/黑暗8 h)后收集三角瓶中含有根系分泌物的溶液。合并收集的溶液经慢速过滤(滤膜孔径0.22 μm)后,滤液冷冻干燥,浓缩得到西瓜根系分泌物干粉,-80 ℃保存备用。试验时称取23.5 mg西瓜根系分泌物干粉溶解于1.5 mL去离子水中,即为西瓜根系分泌物浓缩液,-20 ℃保存备用。
1.2.3 西瓜根系分泌物氨基酸组分测定取适量西瓜根系分泌物浓缩液经0.45 μm滤膜过滤后,采用氨基酸分析仪(Biochrom 30,USA)进行氨基酸组分测定。
1.2.4 菌株SQR-21对外源氨基酸的趋化研究1) 供试氨基酸及试验设计:取经鉴定存在于西瓜根系分泌物中的主要氨基酸天冬氨酸(Asp)、苏氨酸(Thr)、甘氨酸(Gly)、半胱氨酸(Cys)、缬氨酸(Val)、甲硫氨酸(Met)、异亮氨酸(Ile)、亮氨酸(Leu)、酪氨酸(Tyr)、苯丙氨酸(Phe)、组氨酸(His)、赖氨酸(Lys)和精氨酸(Arg)进行趋化试验分析。试验时将适量氨基酸标准品溶于趋化缓冲液中,至终浓度分别为0、20、40、60、80、100 μmol · L-1和100 mmol · L-1,并经0.22 μm滤膜过滤除菌后待用。
2) 趋化作用定性分析:趋化性试验定性分析参照Grimm等[14]的滴定分析法,并作适当修改。BHIS液体培养基接种过夜活化的菌株SQR-21种子液,37 ℃、170 r · min-1培养至对数中期(D600=1.0) ,将50 mL的发酵液于25 ℃、5 000 r · min-1离心浓缩后重新悬浮于12 mL趋化缓冲液中,再加入4 mL 1%的羟丙基甲基纤维素(Sigma,USA)制成菌悬液。将充分混匀的菌悬液倒入直径为6 cm的细胞培养皿中,每皿约4 mL,然后向培养皿正中央滴加10 μL浓度为100 mmol · L-1的氨基酸标准品。将培养皿于室温条件下静置30 min,观察培养皿中央趋化圈的变化情况。对照以趋化缓冲液代替氨基酸标准品。
3) 趋化作用定量分析:参照Adler[15]的方法,设计类毛细管试验,略作修改。BHIS液体培养基接种过夜活化的菌株SQR-21种子液,37 ℃、170 r · min-1培养至对数中期(D600=1.0) ,将发酵液于25 ℃、5 000 r · min-1离心浓缩后重新悬浮于等体积的趋化缓冲液中制成菌悬液,并用200 μL移液枪头吸取100 μL菌株SQR-21菌悬液待用。将1 mL注射器(Becton Dickinson)作为趋化性试验的毛细管,分别吸取100 μL不同浓度(0、20、40、60、80和100 μmol · L-1)氨基酸标准品,并将注射器针头插入上述移液枪头细口端,使氨基酸溶液与菌悬液充分接触。室温无菌条件下静置2 h后,从菌悬液中小心取出注射器针头。对注射器中的氨基酸溶液采用平板稀释涂布法进行细菌计数,37 ℃条件下培养24 h,计算移动到氨基酸溶液中的菌落数(colony-forming unit,CFU)。每个处理设置3次重复,以趋化缓冲液作为对照,计算3个重复平板菌落数的平均值。趋化性指数(relative chemotaxis index,RCI)值为处理CFU的平均值与相应对照CFU的比值,Gordillo等[16]研究表明当RCI≥2时即可认为处理的趋化性与对照相比差异显著。
为了尽量缩短每个步骤的操作时间以保证趋化缓冲液中菌体的活力,本试验将供试的13种氨基酸分为5组,分批进行氨基酸定量趋化试验。组Ⅰ:酪氨酸、甘氨酸、异亮氨酸;组Ⅱ:甲硫氨酸、天冬氨酸、精氨酸;组Ⅲ:半胱氨酸、苏氨酸、组氨酸;组Ⅳ:苯丙氨酸、亮氨酸;组Ⅴ:缬氨酸、赖氨酸。另外,为了试验条件的统一性,每组中均单独设置了对照(即趋化物浓度为0 μmol · L-1的处理),各个氨基酸的趋化计数结果均与各自组内对照的趋化计数结果对比得到其趋化性指数RCI值。
1.2.5 外源添加氨基酸对菌株SQR-21在西瓜根际定殖的影响试验方法参照凌宁[13]的方法并适当修改。每个无菌组培瓶盛有60 g无菌蛭石,预先接种重悬于1/4 Hoagland营养液的菌株SQR-21菌悬液,使其终浓度约为106 CFU · g-1,并充分混匀。将按照1.2.1节中方法培养至5~6片真叶的无菌西瓜幼苗根系在60 μmol · L-1的氨基酸标准品中浸湿后移栽入组培瓶中的蛭石内,对照以趋化缓冲液代替氨基酸标准品,每种氨基酸设置3个重复。将组培瓶置于28 ℃温室中培育3 d(光照16 h/黑暗8 h)后,收集西瓜根系并对根际定殖的菌株SQR-21进行涂布计数。从蛭石中小心取出西瓜根系,用无菌水洗去黏附的蛭石后,将根系放在小研钵内添加1 mL的无菌水研磨成浆,将匀浆进行系列梯度稀释,接种到TSB固体平板培养基上,每个稀释梯度3个重复,37 ℃培养24 h后进行菌落计数。
1.3 数据统计与分析试验数据采用Microsoft ExcelTM 2007统计软件进行数据统计和绘图。采用IBM SPSS statistical Ver.20软件进行不同处理的方差分析和差异显著性检验(Duncan′s multiple range tests)。
2 结果与分析 2.1 西瓜根系分泌物中氨基酸组分测定利用氨基酸分析仪从西瓜根系分泌物中共检测出13种游离氨基酸(图 1):天冬氨酸(Asp)、苏氨酸(Thr)、甘氨酸(Gly)、半胱氨酸(Cys)、缬氨酸(Val)、甲硫氨酸(Met)、异亮氨酸(Ile)、亮氨酸(Leu)、酪氨酸(Tyr)、苯丙氨酸(Phe)、组氨酸(His)、赖氨酸(Lys)和精氨酸(Arg)。
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图 1 西瓜根系分泌物中游离氨基酸的液相色谱分析图 Figure 1 Chromatogram of free amino acids from root exudates of watermelon 1:天冬氨酸Asp;2:苏氨酸Thr;3:甘氨酸Gly;4:半胱氨酸Cys;5:缬氨酸Val;6:甲硫氨酸Met;7:异亮氨酸Ile;8:亮氨酸Leu;9:酪氨酸Tyr;10:苯丙氨酸Phe;11:组氨酸His;12:赖氨酸Lys;13:精氨酸Arg |
西瓜根系分泌物中各游离氨基酸的具体含量见表 1,其中苏氨酸含量最高,为163.17 μg · g-1,甘氨酸含量最低,为6.17 μg · g-1。
| 氨基酸 Amino acids | 含量/(μg·g-1) Content |
| 天冬氨酸Asp | 99.49 |
| 苏氨酸Thr | 163.17 |
| 甘氨酸Gly | 6.17 |
| 半胱氨酸Cys | 15.67 |
| 缬氨酸Val | 17.93 |
| 甲硫氨酸Met | 27.68 |
| 异亮氨酸Ile | 69.58 |
| 亮氨酸Leu | 101.92 |
| 酪氨酸Tyr | 84.55 |
| 苯丙氨酸Phe | 57.85 |
| 组氨酸His | 34.23 |
| 赖氨酸Lys | 50.98 |
| 精氨酸Arg | 9.59 |
| 总计Total | 738.82 |
滴定分析法(drop assay)定性研究结果表明:除酪氨酸和甲硫氨酸外,菌株SQR-21对其余的11种氨基酸均表现出趋化性(图 2),即培养皿中的细菌向中心的趋化物游动并聚集形成趋化圈。菌株SQR-21对苏氨酸、苯丙氨酸、精氨酸和组氨酸的趋化性最强,形成明显的趋化圈。
类毛细管定量试验结果与定性试验结果大致相同。菌株SQR-21对各个浓度的精氨酸、组氨酸和苯丙氨酸均表现出明显的趋化性,相关趋化性指数(RCI)均大于2,即处理的趋化性与对照相比具有显著差异,特别是60 μmol · L-1浓度处理时RCI值均大于4(图 3)。对于7种氨基酸(苏氨酸、赖氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、半胱氨酸、甘氨酸、亮氨酸),其在低浓度时菌株SQR-21的趋化性较弱,在中等浓度(40~80 μmol · L-1)时可诱导菌株SQR-21一定的趋化性,RCI值为2~3.5(图 3)。而对于甲硫氨酸、酪氨酸和天冬氨酸,菌株SQR-21大多不表现出趋化性或表现出很弱的趋化性,RCI值小于2(图 3)。
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图 2 菌株SQR-21对氨基酸类物质的趋化反应(滴定分析法) Figure 2 Chemotactic response of strain SQR-21 towards different amino acids in drop assay |
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图 3 菌株SQR-21对不同浓度氨基酸的趋化反应(类毛细管定量试验) Figure 3 Chemotactic response of strain SQR-21 toward different concentrations of amino acids(capillary tube test) 柱顶的数字代表对应的趋化性指数(RCI),方框中的数字代表其RCI≥4。 The numbers upon the bars represent RCI,the numbers in boxes represent RCI≥4. |
由趋化性试验结果可知,菌株SQR-21对精氨酸、组氨酸和苯丙氨酸具有较强的趋化性,选择这3种氨基酸组分及其趋化效果最明显的浓度(60 μmol · L-1),设计原位试验进一步验证氨基酸对菌株SQR-21在西瓜根际定殖的影响。结果(图 4)表明:这3种氨基酸均能促进菌株SQR-21在西瓜根际的定殖,与对照均存在显著差异(P<0.05) ,其中苯丙氨酸、组氨酸和精氨酸对应的根际定殖细菌数量分别为对照的1.9、1.7和1.5倍。
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图 4 根系浸润不同氨基酸后菌株SQR-21在西瓜根际的定殖数量 Figure 4 The population levels of strain SQR-21 recruited by watermelon roots after adding different amino acids to the rhizosphere 不同字母表示在0.05水平差异显著。 Bars with different letters are significantly different at 0.05 level. |
根系分泌物是联系植物与根际土壤微生物的重要媒介,能为根际微生物提供生存和繁衍所需的营养和能源物质,并作为信号物质吸引或排斥特异微生物,促进根际有益微生物的定殖。根际微生物感受植物根系释放的特定信号并向根际趋化,是其根际定殖及功能发挥的重要前提。已有研究表明,根系分泌物中的小分子有机酸和氨基酸等均可以作为信号物质来介导根系与微生物之前的互作关系。凌宁[13]已通过研究表明,西瓜根系分泌物中的小分子有机酸能够诱导根际促生多黏类芽孢杆菌SQR-21的趋化性而增强其根际定殖。氨基酸类物质也是根系分泌物的重要组分,在调控植物-微生物互作作用中发挥着重要作用,赵大君等[17]也发现凤眼莲根系分泌物中的氨基酸组分可以诱导根际肠杆菌属F2的趋化性。但关于西瓜根系分泌物中氨基酸组分对其根际有益菌株SQR-21的趋化和定殖的影响尚不明确,本研究通过氨基酸流动分析仪检测发现西瓜根系分泌物中游离氨基酸的种类较多且含量较高,分别为酪氨酸、甲硫氨酸、天冬氨酸、亮氨酸、甘氨酸、半胱氨酸、缬氨酸、异亮氨酸、赖氨酸、苏氨酸、苯丙氨酸、精氨酸和组氨酸。
滴定分析试验可反映微生物对于环境变化的一种快速运动的反应机制,当环境中有引诱剂存在时,细菌会朝向该物质做定向游动并聚集在物质周围,从而使原本均匀的菌悬液中央形成1个菌环,即趋化圈,趋化圈的大小和深浅可以反映细菌对引诱剂的趋化能力。本研究中,除甲硫氨酸和酪氨酸以外的其余11种氨基酸均能使菌株SQR-21产生趋化圈,其中苏氨酸、精氨酸、组氨酸和苯丙氨酸的趋化现象最为强烈。胡小加等[18]研究报道表明枯草芽孢杆菌对油菜根系分泌物中的精氨酸和组氨酸具有明显趋化性,本研究结果与其一致。
目前已报道的根系分泌物中诱导根际微生物趋化的特定信号分子主要包括氨基酸、小分子有机酸类物质等。可溶性糖类常作为微生物的碳源,但研究发现许多微生物对多种糖类趋化性较弱(如铜绿假单胞菌RM46对葡萄糖的趋化性较弱[19])或不产生趋化性(如慢生型大豆根瘤菌USDA 110[20])。同样地,虽然氨基酸可以作为微生物的氮源,但许多微生物对某些氨基酸也不产生趋化性,甚至产生趋避现象。如在20种常见氨基酸中,大肠杆菌只对天冬氨酸等7种氨基酸产生强烈的趋化性,对精氨酸等3种氨基酸既不趋化也不趋避,而对谷氨酰胺等7种氨基酸则产生趋避现象[21]。凤眼莲根际肠杆菌属F2也只对凤眼莲根系分泌物中组氨酸等7种氨基酸存在强烈趋化性,而对脯氨酸等10种氨基酸则表现出一定的趋避作用[17]。因此,微生物对某种化合物是否具有趋化性与其是否为碳、氮源不一定有直接关系。
类毛细管定量试验发现趋化物对细菌的正趋化作用往往存在一个最适浓度范围,并非趋化物的浓度越高,细菌的趋化现象越明显。Mesibov等[22]在研究大肠杆菌对氨基酸的趋化性时即发现某些氨基酸在低浓度时表现为一定的正趋化作用,而在高浓度时则具有一定程度的负趋化作用。本研究中的类毛细管趋化定量分析表明菌株SQR-21对各个浓度的精氨酸、组氨酸和苯丙氨酸均表现出明显的趋化性,且当其处于中等浓度(60~80 μmol · L-1)时菌株SQR-21的趋化能力最强,其RCI值达到4.0。对于7种氨基酸(苏氨酸、赖氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、半胱氨酸、甘氨酸、亮氨酸),其在低浓度和高浓度时对菌株SQR-21的趋化性均较弱,而在中等浓度(40~80 μmol · L-1)时则可诱导一定的菌株SQR-21趋化性,RCI值为2~3.5。说明菌株SQR-21对某些氨基酸的趋化可能依赖于浓度梯度:即在中等浓度时的趋化能力较强,而在低浓度和高浓度时则有所下降。Zhang等[23]研究解淀粉芽孢杆菌SQR9对于不同浓度小分子有机酸的趋化性也表现出类似现象。所有类似的结果都表明根系分泌的代谢产物能够影响根际微生物的移动,且根际微生物对物质的趋化能力随着物质的种类及浓度的变化而产生差异。
根际细菌通过一套复杂的趋化系统感受环境信号并控制运动方向,以目前研究较为透彻的大肠杆菌趋化信号通路为例,该系统主要包括甲基趋化受体蛋白MCP(methyl-accepting chemotaxis protein)、组氨酸激酶CheA、调控蛋白CheY及连接蛋白CheW等[24]。细菌细胞膜上的MCP感受到环境中的趋化物后会通过连接蛋白CheW将信号传递给组氨酸激酶CheA并抑制后者的活性,从而降低调控蛋白CheY的磷酸化水平,最终控制鞭毛逆时针旋转而向趋化物方向游动[24]。多黏类芽孢杆菌响应氨基酸等信号分子的基本趋化通路与大肠杆菌类似,但具体的反应过程及感受特定趋化物的受体蛋白有待进一步深入研究。
根际有益微生物响应植物根系分泌物并向根系定向趋化是其发挥生防和促生功能的前提,但生防菌在植物根际的成功定殖继而形成生物被膜才是其功能发挥的关键步骤。西瓜根系分泌物中的氨基酸组分能诱导菌株SQR-21对西瓜根系的趋化性,但其促进菌株SQR-21在西瓜根系定殖的过程还有待论证。本研究原位试验结果表明:趋化试验中现象最明显的精氨酸、组氨酸和苯丙氨酸均能显著提高菌株SQR-21在西瓜根际的定殖能力。前人已有结果表明拟南芥植物根系分泌的三羧酸循环中的L-苹果酸,在一定的浓度范围内促进根际有益菌——枯草芽孢杆菌FB17的定殖,从而协助自身抵御病害[25],此外de Weert等[11]也已报道番茄根际分泌的苹果酸和柠檬酸可以促进荧光假单孢菌WCS365的定殖。而关于宿主植物根系分泌物中氨基酸组分促进根际有益菌在植物根际定殖的研究还鲜有报道。
植物根际是一个具有根际效应的特殊生态环境,向根际中引入趋化物,有助于PGPR菌株在植物根际和根际土壤中的存活和定殖,这可为生物有机肥的科学运用和推广提供试验依据。先前已有研究表明根际接种菌株SQR-21能够系统性地降低西瓜根系分泌物中酚酸类物质——肉桂酸的含量,而一定浓度的肉桂酸对尖孢镰刀菌分生孢子的萌发具有显著促进作用[13],但关于根际接种菌株SQR-21对西瓜根系分泌物组分及其对尖孢镰刀菌的影响尚未展开。接下来将主要探究向健康和发病(即尖孢镰刀菌FON预先侵染)植株根系接种菌株SQR-21后,对西瓜根系分泌物组分(包括酚酸、氨基酸、可溶性糖等)及其对尖孢镰刀菌的影响,以期为解析菌株SQR-21降低西瓜枯萎病发病的作用机制提供参考。
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