氮素粒肥缓解水稻灌浆期高温胁迫的生理机制研究

http://dx.doi.org/10.16016/j.1000-5404.201609091

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缪乃耀, 唐设, 陈文珠, 李刚华, 刘正辉, 王绍华, 丁承强, 陈琳, 丁艳锋

MIAO Naiyao, TANG She, CHEN Wenzhu, LI Ganghua, LIU Zhenghui, WANG Shaohua, DING Chengqiang, CHEN Lin, DING Yanfeng

Research of nitrogen granular fertilizer alleviating high temperature stress at rice grain filling stage and its physiological mechanism

南京农业大学学报, 2017, 40(1): 1-10

Journal of Nanjing Agricultural University (Social Science), 2017, 40(1): 1-10.

http://dx.doi.org/10.16016/j.1000-5404.201609091

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收稿日期: 2016-04-07

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缪乃耀, 唐设, 陈文珠, 等. 氮素粒肥缓解水稻灌浆期高温胁迫的生理机制研究[J]. 南京农业大学学报, 2017, 40(1): 1-10. 复制到剪切板

MIAO Naiyao, TANG She, CHEN Wenzhu, et al. Research of nitrogen granular fertilizer alleviating high temperature stress at rice grain filling stage and its physiological mechanism[J]. Journal of Nanjing Agricultural University (Social Science), 2017, 40(1): 1-10. DOI: 10.16016/j.1000-5404.201609091 复制到剪切板

氮素粒肥缓解水稻灌浆期高温胁迫的生理机制研究

缪乃耀, 唐设, 陈文珠, 李刚华, 刘正辉, 王绍华, 丁承强, 陈琳, 丁艳锋

南京农业大学农学院, 江苏南京 210095

收稿日期: 2016-04-07

基金项目: 江苏省自然科学基金青年基金项目（BK20140721）；江苏高校优势学科建设工程资助项目（PAPD）

作者简介: 缪乃耀, 硕士研究生

通讯作者: 丁艳锋, 教授, 博导, 研究方向为水稻栽培生理生态, E-mail:dingyf@njau.edu.cn

摘要: [目的] 通过探究氮素粒肥缓解水稻灌浆期高温胁迫响应生理机制，为栽培措施缓解水稻高温危害提供理论基础。 [方法] 以‘武运粳24号’和‘宁粳3号’为材料，进行盆栽试验，于开花期进行低氮（每盆0 g纯氮）、中氮（每盆0.8 g纯氮）、高氮（每盆1.6 g纯氮）3种施氮水平处理，6 d后移入温室进行高温处理。测定了水稻叶温及穗温，净光合速率（P_n）、气孔导度（G_s）、蒸腾速率（T_r），SOD、POD、NR、GS活性，MDA、可溶性蛋白及氨基酸含量等。 [结果] 施用氮素粒肥显著降低了水稻的叶温和穗温，减少了高温下MDA的积累，促进水稻叶片的光合作用，提高抗氧化酶活性，增强了水稻植株氮代谢，增加硝酸还原酶、谷氨酰胺合成酶活性及氨基酸的含量。灌浆期高温降低了水稻结实率和千粒质量，氮素粒肥的施用显著缓解了高温对千粒质量和稻谷产量的影响。2个品种产量在各处理间存在显著差异，产量以低氮高温处理最低，高氮常温处理最高。‘宁粳3号’对高温胁迫更为敏感，减产幅度更大。高温胁迫初期水稻叶片内氨基酸含量显著提高，但随着胁迫时间的延长，叶片内氨基酸含量呈下降态势。氮素粒肥的施用既显著提高高温胁迫下水稻灌浆早期叶片中氨基酸的含量，同时也能持续维系水稻叶片有较高的氨基酸含量，从而提高了水稻抗逆性。 [结论] 氮素粒肥的施用能显著提高植物体内氮代谢水平与抗氧化酶活性，并增加叶片氨基酸含量，减少高温逆境条件下水稻产量损失。

关键词：水稻灌浆期氮素粒肥高温胁迫

Research of nitrogen granular fertilizer alleviating high temperature stress at rice grain filling stage and its physiological mechanism

MIAO Naiyao, TANG She, CHEN Wenzhu, LI Ganghua, LIU Zhenghui, WANG Shaohua, DING Chengqiang, CHEN Lin, DING Yanfeng

College of Agriculture, Nanjing Agricultural University, Nanjing 210095, China

Abstract: [Objective] The paper aims to investigate the effect of nitrogen granular fertilizer on rice under high temperature stress and its physiological mechanism of stress response, so as to provide cultivation guidance for avoiding rice heat damages. [Methods] Two major cultivars, 'Wuyunjing 24' and 'Ningjing 3', were used in this study and, under three nitrogen fertilizer levels, low nitrogen level (LN, 0 g nitrogen per pot), medium nitrogen level (MN, 0.8 g nitrogen per pot), and high nitrogen level (HN, 1.6 g nitrogen per pot) were established. The nitrogen treatment was taken in flowering stage of rice, and after 6 days we moved rice into greenhouse. Temperature of rice panicle and leaf, net photosynthetic rate (P_n), stomatal conductance (G_s), intercellular CO₂ concentration (C_i), antioxidant enzyme activity (SOD, POD), membrane lipid peroxidation (MDA) content, soluble protein, glutamine synthetase (GS) activity, nitrate reductase (NR) activity, and amino acid contents were investigated to observe the changes within different nitrogen fertilizer levels under high temperature. [Results] Results showed that the application of nitrogen granular fertilizer enhanced the net photosynthetic rate (P_n), stomatal conductance (G_s) and intercellular CO₂ concentration (C_i), and boosted the antioxidant enzyme activity (SOD, POD).The contents of MDA were reduced in nitrogen treatments and soluble protein, glutamine synthetase (GS) activity, nitrate reductase (NR) activity, and amino acid contents were up-regulated. Our results showed that high temperature reduced the seed-setting rate and 1 000-grain weight of rice.While the application of nitrogen granular fertilizer can significantly increase the rice 1 000-grain weight and make up for a loss of rice final yield under heat stress.'Ningjing 3' was susceptible to high temperature stress, and its grain yield decreased to greater extent. [Conclusion] The application of nitrogen granular fertilizer can regulate the nitrogen metabolism levels and antioxidant enzyme system in rice leaves, and increase the amino acid contents in rice, and finally alleviate the damages caused by high temperature in rice production.

Key words: rice grain filling stage nitrogen granular fertilizer high temperature stress

灌浆期是水稻对高温胁迫较为敏感的时期,水稻在抽穗期颖花分化已基本完成,总颖花数确定,此时的高温胁迫主要影响了水稻结实率和千粒质量。关于应对水稻高温胁迫的措施,除选育耐热品种外,合理的栽培措施也是一重要途径。氮肥管理是最重要的栽培措施之一,氮肥的后移对减轻灌浆期水稻高温伤害作用尤为显著。高温加速水稻灌浆进程,缩短灌浆时间,降低了水稻产量,对稻米品质也有一定影响^[1-2]。在高温下植物对土壤养分的需求增加,氮的充足供应能增强水稻植株的耐热性,在高氮条件下水稻冠层温度会低于低氮^[3]。氮素的施用能活跃水稻氮代谢,增强叶片光合作用,延缓植株的衰老。江文文等^[4]研究发现在孕穗期高温胁迫下增施氮肥小麦千粒质量和产量能得到显著提高,其原因是增施氮肥提高了谷氨酰胺酶活性和抗氧化酶活性,光合作用也得到进一步增强。闫川^[5]认为合理的穗肥施用利于水稻构建良好的群体,降低穗叶温和冠层温度从而提高抗热害能力。蒋琪等^[6]研究认为氮素穗肥(120 kg · hm^-2)的施用有助于超级稻构建合理的群体结构,促进籽粒生长发育,对水稻最终产量有提高作用。李岩等^[7]研究发现增温处理下水稻植株氮含量显著高于常温对照,植物对氮素的吸收与环境条件密切相关。另有研究发现通过调节水稻叶片中氨基酸代谢水平,可以提高水稻耐冷性并减少其在逆境下的产量损失^[8]。前人展开了大量关于氮素对水稻高温胁迫缓解作用的研究,但其研究大多集中在水稻开花前,对其氮代谢酶及氨基酸变化方面的研究尤为缺乏。本试验旨在探究氮素粒肥对灌浆期高温下水稻产量和叶片生理特性的影响,并阐明其机制,为水稻高温胁迫缓解措施提供一定科学依据。

关于水稻氨基酸的研究大多集中在籽粒。谷氨酸代谢在植物氨基酸代谢中起核心作用,谷氨酸家族主要包括谷氨酸、谷氨酰胺、脯氨酸和精氨酸,谷氨酸家族虽不包含人体必需氨基酸,但其中的脯氨酸被认为是植物在逆境下的重要渗透调节物质,另外精氨酸也参与了植物逆境防御^[9]。大量研究表明植物在多种逆境条件下其丙氨酸积累量都会上升^[10-11]。有研究表明,花后高温降低了水稻籽粒GS酶活性^[12],高温胁迫下水稻剑叶NR呈下降趋势^[13],对于高温下氮代谢酶活性的研究仍存在争议。本文进一步通过测定叶片氨基酸以及氮代谢相关酶活性来解释氮素粒肥缓解高温胁迫的机制。

1 材料与方法 1.1 材料和处理

试验于2015年在南京农业大学丹阳试验站(119°10′E,34°36′N)进行。供试材料为江苏省常规粳稻品种‘武运粳24号’和‘宁粳3号’。5月28日播种,6月19日选取长势一致的水稻幼苗分别移栽至盆中,每盆装15 kg风干黏壤土,每盆3穴,每穴2苗。基肥氮肥减半,每盆施氮0.5 g,磷钾肥按照高产栽培措施一次基施(每盆KH₂PO₄ 0.9 g,KCl 0.5 g),穗肥不施,于水稻开花期,施用氮素粒肥。氮素粒肥设3个处理,分别是:低氮处理(不施粒肥)、中氮处理(0.8 g纯氮/盆)和高氮处理(1.6 g纯氮/盆)。施肥6 d后移入温室高温处理,高温处理17 d移出温室,同步记录温度数据。高温处理期间,日均温为30.56 ℃,常温对照日均温为25.96 ℃。每个品种有6个处理:低氮常温(LNCK)、低氮高温(LNHT)、中氮常温(MNCK)、中氮高温(MNHT)、高氮常温(HNCK)和高氮高温(HNHT)。

1.2 测定项目与方法

分别于施肥后1、4、9 d取上3叶测定生理指标。样品在液氮中速冻30 s,然后在-80 ℃冰箱中保存;高温处理后7、14、21 d取整个植株,减去根部,将茎鞘、穗、叶分装信封中,在鼓风干燥箱中105 ℃杀青30 min,然后将温度调至80 ℃烘72 h后称质量。

1.2.1 叶温及穗温测定

在高温处理1、7、14 d后于12:00—14:00时使用非接触式红外测温仪测定水稻穗和叶片温度,测定时在叶片的中部避开叶脉的位置,每个处理测12次,取平均值^[5]。

1.2.2 光合作用参数测定

在高温处理第2天(天气晴好)的09:00—11:00,使用美国LICOR生产的LI6400便携式光合作用测定仪在剑叶中部测定净光合速率、气孔导度、胞间CO₂浓度和蒸腾速率。

1.2.3 MDA含量和POD、SOD活性及可溶性蛋白含量测定^[14]

采用NBT光化还原法测定超氧化物歧化酶(SOD)活性;采用愈创木酚法测定过氧化物酶(POD)活性;采用硫代巴比妥酸法测定膜脂过氧化产物丙二醛(MDA)含量;采用考马斯亮蓝法测定可溶性蛋白含量。

1.2.4 NR和GS活性测定和酶液提取

称取经液氮处理的叶片样品0.2 g,放入研钵中,加入1.5 mL提取液(100 mmol · L^-1 Tris-HCl、pH7.6,1 mmol · L^-1 EDTA,10 mmol · L^-1 β-巯基乙醇)在冰浴下的研钵中进行研磨。提取液在4 ℃、16 000 g离心20 min,上清液即为酶提取液。NR活性测定参考Aslam等^[15]的方法,略加修改。取0.75 mL酶提取液,加入到0.75 mL反应液中(含75 mmol · L^-1 KNO₃、3.0 mmol · L^-1 NADH和50 mmol · L^-1磷酸缓冲液(pH7.5))。在 25 ℃水浴下保温2 h后,加入2 mL显色液(1% 磺胺和0.02 mmol · L^-1 a-萘基乙稀二胺盐酸),显色60 min后540 nm比色。谷氨酰胺合成酶(GS)活性测定参照Zhang 等^[16]方法,略加修改。取0.6 mL酶提取液,分别加入0.3 mL 咪唑-盐酸缓冲液(0.25 mol · L^-1,pH7.0)、0.2 mL 谷氨酸钠(0.30 mol · L^-1,pH7.0)、0.1 mL MgSO₄(0.50 mol · L^-1)、0.2 mL ATP-Na(30 mmol · L^-1,pH7.0)。在 25 ℃水浴下保温 5 min后加入 0.1 mL 0.5 mol · L^-1羟胺试剂,再在 25 ℃水浴下保温 15 min后加入0.8 mL 10% FeCl₃试剂终止反应。5 000 r · min^-1离心15 min后540 nm比色。GS活性单位用每毫克蛋白质在1 h催化形成γ-谷氨酰异羟肟酸(γ-glutamylhydroxamate)物质的量(μmol)表示。

1.2.5 产量构成

成熟期每个处理取3穴水稻测每穗的结实率和千粒质量,每个处理3个重复。

1.2.6 氨基酸测定

采用盐酸水解法,用L8900自动分析仪分析。植株样品在105 ℃杀青30 min后,80 ℃ 烘至恒质量(前期籽粒温度不要超过60 ℃)。磨成粉过80目筛后,贮存在4 ℃待测。准确称取100 mg糙米粉样于气相色谱顶空进样瓶(以米粉为例,其他样品根据蛋白质含量转换)中,先加入少量6 mol · L^-1 HCl,迅速充分摇匀后,再加HCl于气相色谱顶空进样瓶瓶颈处,不宜过满,充入氮气立即盖上盖子。在(110±1)℃水解22~24 h后冷却(中间不能降温或关烘箱),转移至100 mL容量瓶,至少洗涤3次,使用超纯水定容至100 mL,盖上塞子,静止2 h。取1 mL于10 mL小烧杯中,将烧杯放入干燥器,抽真空蒸干后溶解于1 mL 0.02 mol · L^-1 HCl中,经1 mL注射器和0.22 μm过滤至进样瓶,上机分析。

1.2.7 数据统计与分析

试验结果均以3次重复的平均值表示,采用Microsoft Excel 2010 进行初步整理和绘图,用SPSS 20.0软件进行方差分析。

2 结果与分析 2.1 高温处理期间的温度变化

高温处理下的日平均温度为30.56 ℃,常温对照的日平均温度为25.96 ℃,日平均增温为4.60 ℃(图 1)。最高温度超过35 ℃是水稻高温胁迫的温度。17 d高温处理中有14 d日最高温超过了35 ℃,有 9 d最高温度超过了40 ℃,高温处理日平均最高温达40.16 ℃,常温对照日平均最高温则为30.6 ℃(图 2)。

	图 1 高温处理下日平均温度变化 Figure 1 Change of the daily average temperature under high temperature treatment HT:高温处理High temperature;CK:常温对照Normal temperature. The same as follows.
图选项

	图 2 高温处理下日最高温度变化 Figure 2 Change of the daily highest temperature under high temperature treatment
图选项

2.2 氮素粒肥对高温胁迫下水稻产量及产量构成因素的影响

高温胁迫下2个粳稻品种的结实率和千粒质量显著下降,从而造成了产量的降低(表 1)。各处理间穗粒数的差异是水稻个体间的差异引起的,2个粳稻品种结实率对氮素粒肥的响应规律不一致,氮素粒肥能提高‘宁粳3号’的结实率,但却降低了‘武运粳24号’的结实率。在高温胁迫下,2个品种的千粒质量均显著下降,施用氮素粒肥显著提高了2个品种的千粒质量,从而缓解了高温胁迫的减产程度,随着施氮量的增加,缓解高温胁迫的效果更好。

2.3 氮素粒肥对高温胁迫下水稻氨基酸含量的影响

在3种氮素梯度下稻米中的氨基酸含量随施氮量的增加而增加,高温也促进了氨基酸的积累,其中天冬氨酸(Asp)、谷氨酸(Glu)、丙氨酸(Ala)、精氨酸(Arg)、脯氨酸(Pro)变化幅度较大,甲硫氨酸(Met)的含量受外界环境变化相对较小(表 2)。

表 1 氮素粒肥对高温胁迫下水稻产量及产量构成因素的影响 Table 1 Effect of nitrogen granular fertilizer on rice yield and yield components under high temperature stress

品种 Cultivar	处理 Treatment	穗粒数 Spikelets per panicle	结实率/% Seed setting rate	千粒质量/g 1 000-grain weight	产量/g Grain yield per pot
宁粳3号	LNCK	113.29^d	98.79^a	26.23^a	91.62^c
Ningjing 3	LNHT	120.56^c	73.89^c	22.35^d	62.13^f
	MNCK	122.51^bc	98.54^a	26.11^a	98.36^b
	MNHT	132.18^a	74.33^c	23.26^c	71.28^e
	HNCK	129.75^a	96.90^a	26.53^a	104.05^a
	HNHT	127.98^ab	89.01^b	23.83^b	84.72^d
武运粳24号	LNCK	146.77^ab	97.53^a	26.99^a	108.57^b
Wuyunjing 24	LNHT	128.34^c	92.22^b	22.89^d	76.16^f
	MNCK	140.19^b	97.47^a	27.74^a	106.51^c
	MNHT	144.10^b	85.04^c	24.79^c	85.34^e
	HNCK	146.31^b	98.13^a	27.39^a	110.48^a
	HNHT	153.79^a	84.84^c	26.01^b	95.37^d
注: LNCK:低氮常温Low nitrogen and normal temperature;LNHT:低氮高温Low nitrogen and high temperature;MNCK:中氮常温Medium nitrogen and normal temperature;MNHT:中氮高温Medium nitrogen and high temperature;HNCK:高氮常温High nitrogen and normal temperature;HNHT:高氮高温High nitrogen and high temperature. The same as below.

表选项

表 2 氮素粒肥对高温胁迫下水稻成熟期糙米中氨基酸含量的影响 Table 2 Effect of nitrogen granular fertilizer on amino acid contents in brown rice under high temperature stress

mg · g^-1
氨基酸 Amio acid	武运粳24号Wuyunjing 24						宁粳3号Ningjing 3
氨基酸 Amio acid	LNCK	LNHT	MNCK	MNHT	HNCK	HNHT	LNCK	LNHT	MNCK	MNHT	HNCK	HNHT
天冬氨酸Asp	5.712^e	6.589^d	6.979^c	8.789^b	6.522^d	9.645^a	5.898^f	7.228^e	7.581^d	10.102^b	8.942^c	11.320^a
苏氨酸Thr	2.265^e	2.616^cd	2.728^c	3.365^b	2.544^d	3.572^a	2.435^e	2.924^d	3.002^d	3.798^b	3.459^c	4.308^a
丝氨酸Ser	3.122^e	3.570^d	3.871^c	4.831^b	3.593^d	5.152^a	3.331^e	4.105^d	4.260^d	5.624^b	5.051^c	6.738^a
谷氨酸Glu	10.460^e	12.129^d	13.367^c	16.736^b	12.534^d	18.494^a	11.723^f	14.286^e	15.189^d	20.688^b	17.937^c	23.177^a
甘氨酸Gly	2.946^e	3.302^d	3.478^c	4.230^b	3.247^d	4.582^a	3.024^e	3.643^d	3.709^d	4.775^b	4.325^c	5.507^a
丙氨酸Ala	3.944^e	4.373^d	4.662^c	5.621^b	4.565^c	6.179^a	4.292^e	5.060^d	5.272^d	6.834^b	5.888^c	7.074^a
半胱氨酸Cys	0.981^c	1.020^c	1.009^c	1.193^b	0.956^c	1.286^a	1.015^e	1.102^d	1.131^d	1.413^b	1.275^c	1.659^a
缬氨酸Val	3.660^e	4.075^d	4.227^c	5.186^b	4.207^c	5.635^a	3.814^e	4.496^d	4.738^d	6.098^b	5.393^c	6.562^a
甲硫氨酸Met	1.404^b	1.502^b	1.491^b	1.512^b	1.400^b	1.646^a	1.401^b	1.161^c	1.350^bc	1.653^a	1.500^ab	1.280^bc
异亮氨酸Ile	2.159^e	2.460^d	2.615^c	3.266^b	2.583^c	3.553^a	2.314^f	2.762^e	2.965^d	3.921^b	3.527^c	4.362^a
亮氨酸Leu	5.011^e	5.611^d	6.116^c	7.547^b	6.017^c	8.424^a	5.411^f	6.402^e	6.924^d	9.310^b	8.116^c	10.064^a
酪氨酸Tyr	3.253^e	3.331^d	3.473^cd	4.371^b	3.563^c	4.904^a	3.240^f	3.612^e	3.950^d	5.473^b	4.561^c	5.869^a
苯丙氨酸Phe	3.116^e	3.484^d	3.614^c	4.659^b	3.598^cd	5.227^a	3.253^f	3.887^e	4.140^d	5.801^b	4.983^c	6.243^a
赖氨酸Lys	2.695^d	3.059^c	3.058^c	3.729^b	2.954^c	3.922^a	2.757^e	3.348^d	3.300^d	4.022^b	3.720^c	4.326^a
组氨酸His	1.571^e	1.808^d	1.898^c	2.362^b	1.839^cd	2.571^a	1.640^e	2.029^d	2.057^d	2.723^b	2.351^c	2.806^a
精氨酸Arg	5.402^e	6.179^d	6.570^c	8.307^b	6.441^c	9.192^a	5.492^e	6.856^d	7.081^d	9.699^b	8.185^c	10.225^a
脯氨酸Pro	3.297^e	3.617^d	3.881^c	4.643^b	3.813^c	5.047^a	3.564^e	4.064^d	4.279^c	5.366^a	4.887^b	5.444^a

表选项

2个粳稻品种在施加氮素粒肥和遭遇高温时,其叶片中的氨基酸含量均不同程度地上升(表 3)。高温处理后7 d,‘武运粳24号’叶片氨基酸含量在低氮时受高温影响较大,其只有在缺氮条件下对高温抵御能力表现下降。‘宁粳3号’水稻叶片耐高温能力差些。施加氮素粒肥后,2个品种叶片内各类氨基酸含量均大幅度提高,高氮处理效果优于中氮,这活跃了水稻植株的氮代谢水平,也为高温下各类酶的合成提供了充足氮源。高温处理14 d后的叶片氨基酸含量相对7 d变化已较小(表 4)。特别是低氮处理下‘宁粳3号’叶片氨基酸含量在14 d已经降到很低,这也是‘宁粳3号’耐热性相对较差的原因。高温和氮肥处理都能改变水稻叶片和籽粒中的氨基酸总量,但对各个氨基酸的组成比例影响不大。

表 3 氮素粒肥对高温胁迫7 d后水稻叶片氨基酸含量的影响 Table 3 Effect of nitrogen granular fertilizer on amino acid contents in rice leaves under high temperature stress for 7 d

mg · g^-1
氨基酸 Amio acid	武运粳24号Wuyunjing 24						宁粳3号Ningjing 3
氨基酸 Amio acid	LNCK	LNHT	MNCK	MNHT	HNCK	HNHT	LNCK	LNHT	MNCK	MNHT	HNCK	HNHT
天冬氨酸Asp	7.171^d	8.523^c	10.676^b	10.902^b	12.704^a	12.808^a	7.998^e	8.970^e	11.166^d	16.835^c	13.449^b	14.941^a
苏氨酸Thr	3.852^d	4.567^c	5.720^b	5.862^b	6.760^a	6.898^a	4.284^e	4.857^e	5.876^d	9.074^a	7.114^c	8.025^b
丝氨酸Ser	3.768^d	4.435^c	5.432^b	5.489^b	6.258^a	6.333^a	4.185^e	4.662^e	5.603^d	8.366^a	6.661^c	7.424^b
谷氨酸Glu	8.880^d	10.314^c	13.011^b	13.059^b	15.448^a	15.259^a	9.683^e	10.795^e	13.241^d	19.816^a	16.012^c	17.548^b
甘氨酸Gly	4.489^d	5.265^c	6.803^b	6.815^b	8.161^a	7.970^a	4.975^d	5.484^d	6.993^c	10.375^a	8.476^b	9.256^b
丙氨酸Ala	5.686^d	6.960^c	8.685^b	8.667^b	9.687^a	10.089^a	6.405^e	7.328^de	8.511^d	13.888^a	10.437^c	12.584^b
半胱氨酸Cys	0.903^d	0.974^c	1.149^b	1.091^ab	1.209^a	1.212^a	1.010^e	1.027^e	1.166^d	1.636^a	1.340^c	1.439^b
缬氨酸Val	4.519^d	5.249^c	6.558^b	6.668^b	7.572^a	7.741^a	4.924^e	5.440^e	6.597^d	10.082^a	8.066^c	8.933^b
甲硫氨酸Met	0.810^e	1.016^d	1.320^c	1.415^bc	1.586^ab	1.553^a	0.840^e	0.937^e	1.269^d	2.091^a	1.526^c	1.737^b
异亮氨酸Ile	2.998^d	3.557^c	4.521^b	4.560^b	5.266^a	5.427^a	3.320^e	3.736^e	4.502^d	7.235^a	5.601^c	6.287^b
亮氨酸Leu	6.608^d	7.957^c	10.055^b	10.368^b	11.979^a	12.174^a	7.363^e	8.384^e	10.352^d	16.275^a	12.619^c	14.245^b
酪氨酸Tyr	2.563^e	3.139^d	3.878^c	3.895^c	4.165^b	4.576^a	2.931^e	3.271^e	3.944^d	6.528^a	4.653^c	5.544^b
苯丙氨酸Phe	4.095^d	5.085^c	6.327^b	6.700^b	7.485^a	7.853^a	4.596^e	5.369^e	6.480^d	10.512^a	7.990^c	9.148^b
赖氨酸Lys	3.447^c	4.980^b	5.360^b	5.378^b	5.091^b	6.453^a	3.987^e	5.326^cd	4.568^de	10.050^a	5.774^c	7.938^b
组氨酸His	1.260^d	1.695^c	1.970^b	2.090^b	2.373^a	2.471^a	1.412^e	1.701^e	2.027^d	3.536^a	2.524^c	2.880^b
精氨酸Arg	4.216^e	5.237^d	6.597^c	6.665^c	7.231^b	7.953^a	4.813^e	5.533^de	6.275^d	10.830^a	7.852^c	9.403^b
脯氨酸Pro	4.004^d	4.725^c	5.951^b	6.212^b	6.757^a	7.223^a	4.532^e	5.016^e	6.306^d	9.549^a	7.400^c	8.663^b

表选项

表 4 氮素粒肥对高温胁迫14 d后水稻叶片氨基酸含量的影响 Table 4 Effect of nitrogen granular fertilizer on amino acid contents in rice leaves under high temperature treatment for 14 d mg · g^-1

mg · g^-1
氨基酸 Amio acid	武运粳24号Wuyunjing 24						宁粳3号Ningjing 3
氨基酸 Amio acid	LNCK	LNHT	MNCK	MNHT	HNCK	HNHT	LNCK	LNHT	MNCK	MNHT	HNCK	HNHT
天冬氨酸Asp	7.220^c	7.394^c	7.662^bc	8.754^b	10.490^a	11.270^a	4.967^e	5.637^d	10.049^c	10.236^c	10.972^b	12.159^a
苏氨酸Thr	3.934^c	3.934^c	4.152^bc	4.737^b	5.666^a	6.013^a	2.715^e	3.027^d	5.337^c	5.441^c	5.858^b	6.439^a
丝氨酸Ser	3.829^c	3.973^bc	4.084^bc	4.517^b	5.403^a	5.693^a	2.735^e	3.084^d	5.173^c	5.119^c	5.504^b	6.117^a
谷氨酸Glu	9.198^c	8.984^c	9.767^bc	10.538^b	12.996^a	13.396^a	6.276^e	6.846^d	11.953^c	11.795^c	12.855^b	14.314^a
甘氨酸Gly	4.603^c	4.671^c	4.772^bc	5.484^b	6.819^a	7.030^a	3.164^e	3.569^d	6.430^c	6.283^c	6.804^b	7.633^a
丙氨酸Ala	6.152^c	5.688^c	5.846^c	7.221^b	8.850^a	8.552^a	3.912^e	4.394^d	7.672^c	8.404^b	8.901^a	9.169^a
半胱氨酸Cys	0.992^c	0.847^c	0.921^bc	0.899^b	1.075^a	1.075^a	0.726^d	0.721^d	1.030^c	1.019^bc	1.082^b	1.186^a
缬氨酸Val	4.575^c	4.574^c	4.680^c	5.484^b	6.570^a	6.811^a	3.263^e	3.631^d	6.155^c	6.381^c	6.818^b	7.295^a
甲硫氨酸Met	0.822^c	0.679^bc	0.777^bc	0.975^b	1.218^a	1.261^a	0.493^c	0.485^c	1.038^b	1.001^b	0.983^b	1.339^a
异亮氨酸Ile	3.108^c	3.045^c	3.128^c	3.757^b	4.571^a	4.654^a	2.080^e	2.343^d	4.160^c	4.313^c	4.624^b	4.979^a
亮氨酸Leu	6.825^c	6.897^c	7.036^c	8.421^b	10.138^a	10.609^a	4.581^e	5.278^d	9.421^c	9.476^c	10.335^b	11.422^a
酪氨酸Tyr	2.812^c	2.696^c	2.711^c	3.239^b	3.934^a	3.978^a	1.896^e	2.128^d	3.594^c	3.515^c	3.950^b	4.419^a
苯丙氨酸he	4.237^c	4.341^c	4.426^c	5.562^b	6.395^a	6.946^a	2.881^f	3.364^e	6.040^d	6.396^c	6.818^b	7.403^a
赖氨酸Lys	3.953^d	3.623^cd	4.237^bc	4.610^b	5.677^a	5.636^a	2.504^c	2.722^c	5.294^b	5.301^b	5.597^a	5.715^a
组氨酸His	1.325^d	1.361^d	1.412^d	1.659^c	1.961^b	2.225^a	0.886^e	1.004^d	2.004^c	1.892^bc	2.051^b	2.325^a
精氨酸Arg	4.487^c	4.219^c	4.549^c	5.350^b	6.636^a	6.876^a	2.871^e	3.246^d	5.988^c	6.258^c	6.726^b	7.270^a
脯氨酸Pro	4.234^c	4.242^c	4.127^c	5.012^b	5.954^a	5.892^a	2.579^e	2.923^d	5.300^c	5.240^c	5.717^b	6.373^a

表选项

	图 4 氮素粒肥对高温胁迫下水稻穗温的影响 Figure 4 Effect of nitrogen granular fertilizer on rice panicle temperature under high temperature stress
图选项

增施氮素粒肥可降低水稻穗温和叶温,随着氮肥用量的增加,降温效果更好(图 3和图 4)。穗温和叶温的变化规律表现基本一致。在高温条件下,施用氮素粒肥对叶温的降低作用随处理时间延迟减弱,这也体现了氮肥的时效性。2个品种在穗温和叶温的变化规律方面基本相同。

	图 3 氮素粒肥对高温胁迫下水稻叶温的影响 Figure 3 Effect of nitrogen granular fertilizer on rice leaf temperature under high temperature stress a:武运粳24号Wuyunjing 24;b:宁粳3号Ningjing 3.The same as below.
图选项

2.4 氮素粒肥对花后高温胁迫下水稻剑叶光合作用的影响

短时间的高温处理并未抑制水稻的光合作用,但氮素粒肥的施用显著增强了水稻剑叶的光合作用(表 5)。2个品种在增施氮素粒肥后,剑叶净光合速率(P_n)、气孔导度(G_s)、胞间二氧化碳浓度(C_i)均有大幅度提高,这也是氮素粒肥降低水稻穗温和叶温的一个原因,其促进了光合作用,加快了水稻植株新陈代谢,大大提高了水稻植株的耐热性。中氮与高氮条件下水稻光合作用参数差异并不显著,2个品种的光合作用对氮素的响应表现基本一致。

表 5 氮素粒肥对高温胁迫下水稻剑叶光合作用的影响 Table 5 Effect of nitrogen granular fertilizer on rice flag leaf photosynthesis under high temperature stress

品种	处理	P_n/(μmol·m^-2·s^-1)	G_s/(mmol·m^-2·s^-1)	C_i/(μmol·mol^-1)	T_r/(mmol·m^-2·s^-1)
宁粳3号	LNCK	14.4^d	0.173^d	208.00^bc	4.97^c
Ningjing 3	LNHT	16.7^c	0.217^c	194.00^c	7.70^a
	MNCK	19.6^b	0.271^b	212.00^b	3.97^d
	MNHT	20.5^ab	0.292^ab	198.33^bc	6.23^b
	HNCK	20.8^ab	0.307^ab	234.67^a	7.81^a
	HNHT	22.0^a	0.338^a	212.67^b	6.58^b
武运粳24号	LNCK	15.6^b	0.180^d	196.67^b	5.57^b
Wuyunjing 24	LNHT	15.9^b	0.206^d	194.67^b	5.87^b
	MNCK	19.5^a	0.257^c	215.33^ab	4.44^b
	MNHT	21.0^a	0.287^bc	199.33^b	8.03^a
	HNCK	20.8^a	0.365^a	229.33^a	5.31^b
	HNHT	20.9^a	0.323^ab	226.67^a	5.81^b

表选项

2.5 氮素粒肥对高温胁迫下水稻叶片抗氧化酶活性及可溶性蛋白含量的影响 2.5.1 MDA含量

在高温条件下2个水稻品种MDA含量显著增加,但高氮处理下的叶片MDA含量显著低于低氮处理,这也体现了增施氮素粒肥后,水稻的耐热性提高,其细胞膜脂受伤害程度减轻(图 5)。

	图 5 氮素粒肥对高温胁迫下水稻叶片MDA含量的影响 Figure 5 Effect of nitrogen granular fertilizer on MDA content in rice leaves under high temperature stress
图选项

2.5.2 SOD和POD活性

2个品种在高温下SOD和POD活性显著上升,增施氮肥后SOD和POD酶活性提高,这说明高温下适量增施氮肥可激活细胞抗氧化酶系统从而提高水稻对高温的适应能力(图 6和图 7)。值得注意的是‘宁粳3号’在高温处理9 d后,其POD酶活性高温处理已低于常温对照,这说明此时植物体的抗氧化酶系统已出现衰退迹象,水稻受高温胁迫严重,活性氧大量上升,细胞内部代谢紊乱,植物抗氧化酶系统开始崩溃。

	图 6 氮素粒肥对高温胁迫下水稻叶片SOD活性的影响 Figure 6 Effect of nitrogen granular fertilizer on SOD activity in rice leaves under high temperature stress
图选项

	图 7 氮素粒肥对高温胁迫下水稻叶片POD活性的影响 Figure 7 Effect of nitrogen granular fertilizer on POD activity in rice leaves under high temperature stress
图选项

2.5.3 可溶性蛋白含量

在高温胁迫下2个水稻品种叶片的可溶性蛋白含量大幅上升,增施氮素粒肥后水稻叶片内可溶性蛋白含量也显著上升,高氮处理下可溶性蛋白含量显著高于中氮处理(图 8)。植物体内可溶性蛋白含量的上升也为抗氧化酶的合成提供充足氮源,增强植株清除活性氧机能,从而延缓叶片衰老,提高籽粒产量。

	图 8 氮素粒肥对高温胁迫下水稻叶片可溶性蛋白含量的影响 Figure 8 Effect of nitrogen granular fertilizer on soluble protein content in rice leaves under high temperature stress
图选项

2.6 氮素粒肥对高温胁迫下水稻叶片氮代谢相关酶活性的影响

高温胁迫下,NR和GS酶活性受到显著抑制,增施氮素粒肥可提高这2种酶的活性,这说明增施氮素粒肥能保证花后叶片中氮代谢系统的畅通和高效运转,提高植株氮代谢水平;高氮处理效果优于中氮处理(图 9和图 10)。另外,GS在高温处理9 d后其受胁迫的影响明显大于处理4 d后,在高温处理9 d后氮素粒肥对GS酶的作用仍然十分明显。2个粳稻品种氮代谢相关酶活性对高温和氮素的响应基本一致。

	图 9 氮素粒肥对高温胁迫下水稻叶片NR活性的影响 Figure 9 Effect of nitrogen granular fertilizer on NR activity in rice leaves under high temperature stress
图选项

	图 10 氮素粒肥对高温胁迫下水稻叶片GS活性的影响 Figure 10 Effect of nitrogen granular fertilizer on GS activity in rice leaves under high temperature stress
图选项

3 讨论

灌浆前期是水稻籽粒物质积累的重要阶段,灌浆初期(齐穗后20 d)是温度影响水稻产量和品质形成的关键时期,过高或过低温度均不利于提高水稻产量和品质^[17],水稻花后1~5 d是结实率对高温反应最敏感的时期,花后11~20 d是粒质量对高温反应最敏感的时期^[18]。同时,长江中下游同期历史气象数据显示,水稻灌浆前期遭遇高温极端天气概率更大。本试验进行了17 d高温处理,处理1、4、9 d水稻叶片生理特性变化显示,短时间高温胁迫已经对水稻抗氧化系统产生不利影响。高温处理下2个品种MDA积累量明显高于常温对照。叶片中SOD酶活性在高温处理1、4、9 d均高于常温对照。高温处理9 d,‘宁粳3号’叶片POD酶活性低于常温对照,而‘武运粳24号’仅仅在不施氮条件下POD酶活性低于常温对照,这也反映了2个水稻品种耐热性不同。在高温处理后期,水稻体内活性氧积累过多,植物体自身对逆境胁迫的调节能力也有一定限度,抗氧化酶系统开始衰退。结合前人研究结果^[19],可以推测随着高温处理时间的延长,植物体内抗氧化酶活性呈现先升高后降低趋势。氮肥能刺激植物抗氧化酶系统,减少细胞膜脂伤害,使植物细胞在逆境下仍能维持较高抗氧化酶活性^[20-22],本文在这方面与前人研究结果一致。前人认为高温利于水稻小麦籽粒中蛋白质的积累^[23-24],而本文中高温下水稻叶片中2种氮代谢相关酶均呈下降趋势,故认为高温下蛋白质的增加可能与粒质量降低、淀粉合成的减少有关。

植物组织器官温度可以反映植物受高温胁迫的程度,高温胁迫下水稻穗温和叶温显著上升,氮素粒肥的施用显著降低了穗温和叶温,对高温胁迫有一定缓解效果。施用氮素粒肥后水稻光合作用显著增强(剑叶净光合速率、气孔导度和胞间二氧化碳浓度均显著提高),这也是穗温和叶温降低的一个原因。高温胁迫下植物体内活性氧大量积累,SOD和POD对活性氧有清除作用进而提高作物在高温下的抗逆性。本研究结果表明灌浆期高温来临前,合理增施氮素粒肥能增强植物体氮代谢水平,增加气孔导度从而降低水稻穗、叶温,激活抗氧化系统防御功能,从而缓解高温带来的减产作用。

研究表明高温显著改变了水稻体内氨基酸含量^[25],谷氨酸代谢水平与逆境下水稻产量密切相关^[8,26-27],本文结论也与前人一致,氮素粒肥提高了水稻灌浆期水稻叶片谷氨酸代谢水平,进而也提高了作物产量。在高温处理后期,水稻叶片抗氧化酶在高温处理第9天已出现衰退迹象。在高温处理14 d后,水稻叶片中的氨基酸含量也不再上升,水稻叶片的GS活性在高温处理9 d也受到了较大抑制,这说明此时植物整体逆境抵御系统已开始崩溃,水稻体内活性氧积累过多,抗氧化系统衰竭,水稻氮代谢水平也受到严重抑制。叶片中氨基酸含量的变化也呈现前期高后期低的趋势,这也与抗氧化酶变化规律相一致。另外,高温下叶片中NR、GS活性受抑制,但叶片氨基酸含量却明显上升,推测这可能与植物体内逆境诱导谷氨酸脱氢酶(GDH)活性的升高有关。而籽粒中各类氨基酸含量的升高可能与高温下淀粉合成受到严重抑制相关,故氨基酸所占的比例升高。

研究表明,谷氨酸与ABA的信号转导密切相关^[28],ABA含量在逆境下上升,可见谷氨酸参与了植物逆境抵御的生理机制。氮素粒肥的施用提高了水稻叶片氨基酸含量,增强了植株的耐热性。水稻叶片氨基酸含量随着灌浆进程表现下降最终植株走向衰老,高温下叶片氨基酸含量下降更快,这也证明了高温有加速植物衰老的作用。此外,本试验还发现高温和施氮都显著改变了水稻叶片和籽粒中氨基酸的含量,但对各氨基酸组成比例影响不大。

关于氮肥对高温缓解作用的研究,前人大多集中在穗肥阶段,穗肥的施用能显著提高水稻穗粒数,而本文氮素粒肥主要提高了高温胁迫下水稻的千粒质量,对结实率和穗粒数影响不大。穗肥的施用距水稻灌浆还有很长一段时间,氮肥对水稻生长的促进作用是相当明显的,不同群体质量的水稻对高温的耐性显然是不同的。氮素粒肥的施用与高温来临时间间隔较短,研究氮素粒肥对水稻灌浆期高温胁迫的影响是更为直接明显的,应对高温热害的来临也具有实际可行性。通过合理的氮肥管理(氮肥的后移)能提高作物灌浆期的耐热性,提高氮肥利用率^[4],这是一种经济有效且易推行的作物避热技术,能为大田作物栽培提供理论及实践依据,为全球变暖效应下的粮食安全提供保障。

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