盐酸替洛隆是一种人工合成的有机化合物, 其结构如图 1所示, 相对分子质量小, 仅有483.42。长期研究发现该小分子化合物在人与动物健康史上发挥了重要的作用。Krueger等^[1-2]和Mayer等^[3]首次研究发现该化合物在小鼠上有抗病毒活性。越来越多的研究显示该化合物药理活性广泛, 如增强自然杀伤(NK)细胞吞噬活性^[4]、抗病毒^[5]、抗肿瘤^[6]、抗炎^[7]、解热^[8]和免疫调节^[9]等, 而这些药理活性是和其诱导产生的一类细胞因子--干扰素直接相关的^[10-11]。从结构上看, 这些活性是由它独特的平面结构--中间芴酮环与两侧对称的修饰侧链^[12]而引发的。1974年, Andrews等^[13]成功合成了盐酸替洛隆及其类似物和衍生物, 但是其中一步F-C反应条件苛刻, 导致盐酸替洛隆收率低、杂质多, 而且因其反应为固固反应, 容易冲料, 操作不易控制。鉴于Andrews提出的方法显示中间体2, 7-二羟基-9-芴酮合成工艺成熟易得, 本试验直接将该中间体与合适的氯代烷基化合物发生取代、酸化得到目标化合物, 继而对该化合物进行初步活性鉴定, 并进一步探讨其对小鼠干扰素的诱导作用, 为临床新兽药的申报及药物生产过程提供参考。

1 材料与方法 1.1 试验材料和仪器 1.1.1 材料

2, 7-二羟基-9-芴酮和2-二乙氨基氯乙烷盐酸盐为工业级, 甲苯、乙醇、硝酸、盐酸、氨水、乙腈、氢氧化钾、氢氧化钠和磷酸二氢钾均为AR级, 硝酸银和硫代乙酰胺均为标准级; 盐酸替洛隆对照样品(99.9%, 上海阿拉丁生化科技股份有限公司); 小鼠α1干扰素ELSIA试剂盒(上海依克赛生物有限公司)。

1.1.2 仪器

JJ-1型定时电动搅拌器, 江苏金坛市金城国胜实验仪器厂; DGG-9240型电热恒温鼓风干燥箱, 上海森信实验仪器有限公司; 梅特勒-托利多FiveEasy Plus台式pH计, 梅特勒托利多国际贸易(上海)有限公司; Imark-酶标仪, 伯乐生命医学(上海)有限公司; SGWX-4显微熔点仪, 上海仪电物理光学仪器有限公司; 安捷伦1200型高效液相色谱仪, 安捷伦科技有限公司; WD-A药物稳定性检查仪, 天津东裕科技有限公司。

1.1.3 试验动物

SPF级ICR小鼠(雌)50只, 20 g左右, 购自扬州大学比较医学中心, 试验前于南京农业大学实验动物中心饲养3 d。

1.2 盐酸替洛隆的合成与鉴定 1.2.1 盐酸替洛隆的合成

在三颈瓶中, 加入10.0 g (0.03 mol)2, 7-二羟基-9-芴酮、30.1 g (0.17 mol)2-二乙氨基氯乙烷盐酸盐、22.5 g (4.0 mol) KOH、32 mL H₂O和150 mL甲苯, 回流反应24 h, 冷却, 分液; 甲苯层用50 mL KOH水溶液(3 mol · L^-1)洗涤, 分液, 甲苯层浓缩至干, 加入42 mL无水乙醇, 通HCl气体至溶液pH值达到3, 析出固体, 抽滤, 干燥, 得粗品20 g (盐酸替洛隆合成得率93%)。

1.2.2 盐酸替洛隆纯化

在单颈瓶中加入盐酸替洛隆粗品20 g, 用一定量乙醇加热回流至全溶, 静置冷却, 析出结晶, 抽滤, 干燥, 得19.3 g (96.5%)精制品。

1.2.3 盐酸替洛隆含量测定

精确称取10 mg盐酸替洛隆, 置于100 mL量瓶中, 加超纯水溶解并稀释至刻度, 摇匀; 精确量取500 μL, 置于10 mL量瓶中, 用超纯水稀释至刻度, 摇匀; 精确量取20 μL注入液相色谱仪, 记录色谱图。另取盐酸替洛隆对照样品, 同法测定。外标法以峰面积计算, 即得样品中盐酸替洛隆的含量。

1.2.4 盐酸替洛隆高效液相色谱检测方法验证

1)色谱条件:以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂; 色谱柱为ODS-C₁₈(250 mm×4.6 mm, 5 μm); 流动相为磷酸盐缓冲液(0.025 mol · L^-1, pH3.5)和乙腈(体积比为80 : 20), 检测波长270 nm; 流速0.8 mL · min^-1; 柱温35 ℃; 进样体积20 μL; 理论塔板数按替洛隆峰不低于8 000。2)标准曲线绘制:分别配制2、4、5、10和20 μg · mL^-1的对照样品供试液, 依次进样, 得到色谱图, 按面积归一化法, 用峰面积对进样浓度进行线性回归分析。3)精密度:取对照样品溶液(5 μg · mL^-1)连续进样5次, 记录色谱图。4)溶液稳定性:将对照样品溶液(5 μg · mL^-1)分别于0、2、4、6、8、12和24 h取样分析, 记录色谱图。5)重现性:称取对照样品6等份, 配制为5 μg · mL^-1, 进样, 记录色谱图。6)准确度:称取3份对照样品, 分别配制为4、5和6 μg · mL^-1, 进样分析, 记录色谱图。

1.2.5 理化性质分析

参照《中国兽药典》(2010版一部)附录操作准则分别测定外观性状、熔点、pH值、溶解性、盐酸盐鉴别和其他检查(包括干燥失重、硫酸根限量、重金属含量、引湿性)。

1.2.6 稳定性试验

将药物敞口放置于药物稳定性试验箱中(因本品极易吸潮, 试验中设置相对湿度为25%), 在温度为60 ℃、光照度为4 500 lx的条件下放置10 d, 分别于5和10 d精确称取适量盐酸替洛隆研究其含量、性质的变化。

1.3 干扰素诱导作用 1.3.1 药液配制

称取250 mg盐酸替洛隆用PBS (pH7.0)缓冲液稀释至质量浓度为25 mg · mL^-1, 另以PBS (pH7.0)作为对照组安慰剂用。

1.3.2 小鼠给药及采样

将适应新环境的ICR试验小鼠随机分成2组, 每组分别按体质量10 μL · g^-1灌胃药物和安慰剂。分别于给药后的0、1、2.5、4.5、6、7.5、12和24 h摘除眼球采血约0.5 mL, 待37 ℃温浴2 h后置于冰箱降温, 取上层亮黄色清液10倍稀释得到检测血清样本。

1.3.3 样本检测

按照ELISA试剂盒的试验操作说明, 将血清样本的稀释液和不同浓度的干扰素标准品稀释液分别依次加到96孔微孔板中, 置37 ℃ 2 h。用洗涤液洗涤5次, 加入生物素化抗体工作液(biotin-conjugate diluent), 37 ℃继续放置1 h。洗涤5次, 加入酶结合物工作液(streptavidin-HRP diluent)再37 ℃恒温放置1 h, 避光。洗涤5次, 5 min内加入显色底物, 反应20 min。直接将终止液加入到各孔, 立即置于酶标仪检测A₄₅₀值。

2 结果与分析 2.1 合成盐酸替洛隆的基本鉴定

由图 3可知:本试验合成的盐酸替洛隆结构特点如下:红外光谱[IR (KBr) v (cm^-1)]:1 708.9(C=O), 2 943.3, 2 596.5(CH)。质谱[ESI-MS (m/z)]:411[M+1]⁺。C₂₅H₃₄N₂O₃(MW=410.3)。核磁[¹H NMR (400 MHz, D₂O), δ(10^-6)]:7.12(2H, d), 6.99(2H, d), 6.89(2H, d), 4.39(4H, t), 3.68(4H, t), 3.42(8H, q), 1.44(12H, t)。

2.2 样品中盐酸替洛隆含量测定

含量测定方法准确度高, 精密度、重现性好, 在2~20 μg · mL^-1能呈现良好的线性, 方法可靠。3批样品的含量测定结果分别为99.57%、99.67%和99.80%(图 4)。

2.3 盐酸替洛隆的理化性质

3批样品理化性质一致, 表明稳定性高, 且都达到了兽药典规定的要求:外观均为橘红色结晶性粉末, 颜色均匀; 在水和甲醇中易溶, 微溶于乙醇, 难溶于甲苯; 3批成品熔点分别是229~231、230~232和228~230 ℃, 熔程短且可见纯度高; 10 g · L^-1盐酸替洛隆水溶液显弱酸性, pH值5.0~5.5;3批成品均呈现了盐酸盐的特点, 能使硝酸银试剂产生硝酸不溶的白色沉淀; 干燥失重分别是0.23%、0.27%、0.31%;其他硫酸根和重金属含量均分别小于0.02%和0.001%;极易吸潮, 24 h增重25%。

2.4 盐酸替洛隆的稳定性

3批盐酸替洛隆在高温、强光照射的条件下, 性状不变, 放置5 d的含量平均降低了0.5%, 10 d的平均减少了1.3%, 在高温、强光照射下含量变化均小于5%。说明本方法制备的盐酸替洛隆性质稳定。

2.5 盐酸替洛隆的干扰素诱导作用

盐酸替洛隆处理小鼠的血清稀释10倍后检测其诱导干扰素水平, 结果(图 5)表明:与对照组相比, 试验组小鼠α₁干扰素水平在给药4.5 h之前一直保持一致, 4.5 h开始升高, 到6 h升高程度越发明显, 至7.5 h, 表达量约500 pg · mL^-1, 并继续升高, 至12 h到达峰值2 000 pg · mL^-1, 且保持这个水平至24 h。

3 讨论

本试验中, 盐酸替洛隆样品收率达到93%, 显著高于Andrews等^[13]61%的收率。另一方面, 盐酸替洛隆的诱导干扰素成功说明了其较好的诱导活性, 这一作用可为临床治疗病毒性疾病提供很大帮助。有研究表明与其他诱导剂的诱导能力相比, 盐酸替洛隆诱导干扰素的特点为产生诱导作用较晚但维持时间长^[14], 本研究的结果与之相一致。依据试验结果, 我们欲将其开发为免疫增强剂, 用于与疫苗联用时以增强免疫活性^[15]; 或在与抗病毒药联用以增强药效, 这一点将由之后的试验进行验证。

尽管如此, 还需要对其进行更全面的综合评价及对其他动物的干扰素诱导作用和抗病毒活性的研究, 才能为盐酸替洛隆在临床的广泛应用提供更科学的依据。盐酸替洛隆目前在国外已被广泛应用, 但在我国还未被使用, 关于这方面的报道也甚少。因此, 盐酸替洛隆将会为解决我国畜禽健康问题带来新方案。