胚胎着床是一个复杂的生理过程, 是决定妊娠成功与否的关键, 它的成功主要取决于胚胎能否成功植入到处于容受状态下的子宫内膜。因为胚胎发育到特定时期才具有入侵子宫内膜的能力, 而子宫内膜也在这一特定时期才允许胚胎植入, 所以二者必须同步健康发育。胚胎着床包括胚泡脱去透明带、定位、黏附、侵入到子宫内膜等过程, 其中甾体激素居主导地位, 细胞因子、生长因子、黏附因子和蛋白酶等参与其中, 并通过胞内信号转导及关键基因的表达使子宫内膜发生一系列复杂变化^[1]。

McGinnis等^[2]和Scott等^[3]在果蝇体内发现一类与果蝇体节突变相关的基因, 即同源框(homeobox, HOX)基因, 它属于多基因家族的转录调节基因。HOX基因均含有一个约183个核苷酸组成的同源框序列, 编码61个氨基酸, 构成同源域结构, 通过螺旋-转角-螺旋结构形成可以结合DNA的结合域, 可识别下游靶基因的DNA序列(TTAT或TAAT), 从而激活或抑制下游基因的转录^[4]。

在脊椎动物中, 同源框基因(HOX)分为4簇, 分别以HOXA、HOXB、HOXC和HOXD表示。HOXA基因簇中, HOXA-9、HOXA-10、HOXA-11、HOXA-13分别在小鼠输卵管、子宫内膜、宫颈、阴道上有不同表达^[2-3]。近年来研究表明, HOXA-10参与子宫内膜发育和胚胎种植的多个环节, 如子宫内膜增殖、脱膜化、胞饮突形成、血管通透性等子宫内膜容受性的建立, 以及胚胎的定位和黏附的调节^[5-6]。有研究发现, HOXA 10可通过调控下游靶基因如ITGB 3 ^[7-8]、IGFBPI^[9]、整合素β3^[7]、EMX 2 ^[10]、FK 506 ^[11]、结合蛋白4基因等的表达来调控子宫内膜容受性变化, 进而调控胚胎着床过程。

DNM1L (dynaminl-like)是动力蛋白超家族的成员之一, 是线粒体分裂体系的重要组成成分。在不同物种中, DNM1L基因与多种分子相互作用后, 可以定位于线粒体并组装成高级结构, 引起膜的收缩和分裂。近期研究发现, DNM1L在细胞凋亡、胚胎着床过程以及多种疾病中也具有重要作用^[12-13]。本试验旨在证实HOXA10可作用于DNM1L启动子区域并调控DNM1L基因表达, 保证胚胎着床顺利进行, 为提高妊娠成功率的研究提供新方向。

1 材料与方法 1.1 材料

3周龄昆明小白鼠购自南京市江宁区青龙山动物繁殖场。Lipofectamine 2000、DMEM-F12培养基、青/链霉素、胎牛血清(FBS)、胶原蛋白酶Ⅰ和胰蛋白酶-EDTA等细胞培养试剂购自Invitrogen公司; 孕马血清促性腺激素(PMSG)购自宁波第二激素厂; 双荧光素酶报告基因试剂盒购自Promega公司; 质粒大量提取试剂盒、胶回收试剂盒、PCR纯化试剂盒购自Omega公司; Trizol购自Invitrogen公司; 针对HOXA10的特异性小干扰RNA[siRNA, 共3条, 分别命名为siRNA-HOXA10 (1)、(2)、(3)]购自上海吉玛生物公司; pcDNA3.1、pGL-3载体和小鼠3T3细胞株为本实验室保存; 实时荧光定量PCR (RT-qPCR)试剂盒和点突变试剂盒购自南京诺维赞公司; 感受态细胞购自全式金生物公司; 引物合成及测序均由南京金维致生物公司完成。

1.2 网站预测

通过转录因子结合位点预测网站(http://www.ifti.org/Tfsitescan/.html), 对DNM1L转录起始位点上游0~-3 000 bp碱基序列进行分析。

1.3 怀孕7 d内小鼠子宫内膜的分离

将40只8周龄体质量为23~25 g的昆明小白鼠分成8组, 每组5只。以雌雄比为2 : 1合笼过夜。次日早上检查雌鼠阴道有阴栓者定为妊娠第1天, 未孕的记为0, 直到怀孕第7天。期间每天09:00将1组5只小鼠断颈处死, 无菌取出子宫内膜, 剔除其系膜及脂肪组织, 眼科镊夹住单侧子宫角, 用处理过的4号针头从近输卵管端逐渐向子宫颈方向挤压滚动, 使子宫内膜呈长条状完整滑出, 放入干净的EP管中迅速置液氮保存。

1.4 HOXA10过表达载体与野生型和突变型DNM1L启动子区域萤光素酶报告载体构建 1.4.1 HOXA10过表达载体构建

根据GenBank网址提供的小鼠HOXA10基因CDS区编码序列(Gene ID:NM008263.3), 应用Primer Premier 5.0软件设计含限制性内切酶EcoRⅠ和KpnⅠ序列的引物。为了保证酶切的高效性和连接后的准确性, 将酶切位点5′端加入保护碱基, 3′端加入2 bp与目的片段对应位置的碱基序列(引物序列见表 1)。小鼠子宫内膜基质细胞cDNA为模板, 用高保真DNA聚合酶pfu进行扩增, 片段大小为1 295 bp。扩增体系:10×Buffer 5 μL, MgSO₄(50 mmol · L^-1)2 μL, dNTP (10 mmol · L^-1)1 μL, Hi Fi Taq酶(5 U · μL^-1, Invitrogen)0.2 μL, 上、下游引物(10 μmol · L^-1)各1 μL, cDNA 1 μL, 加ddH₂O至50 μL。PCR程序条件:94 ℃ 3 min; 94 ℃ 30 s, 58 ℃ 30 s, 72 ℃ 75 s, 共35个循环; 72 ℃ 10 min。回收电泳条带单一的产物与pcDNA3.1质粒进行EcoRⅠ和KpnⅠ的双酶切。酶切体系:内切酶各1 μL, 10×Buffer 2.5 μL, DNA 1 000 μg, 用ddH₂O补至25 μL, 37 ℃ 16 h。鉴定并纯化酶切产物后进行连接。连接体系:10×T₄连接酶Buffer 2.5 μL，DNA 0.3 pmol，载体0.03 pmol，T₄连接酶1 μL, 用ddH₂O补至25 μL, 16 ℃ 16 h。将连接好的产物转到DH5α感受态细胞中, 挑出5个单克隆进行菌液PCR鉴定, 选出阳性克隆送去测序, 进行序列比对, 确认连接正确无突变后进行扩增培养, 扩增培养时间16 h以上, 以减少质粒内毒素。大量提取质粒后测定浓度, 置于-20 ℃保存。载体质粒记为pcDNA3.1-HOXA10。

1.4.2 野生型DNM1L萤光素酶报告载体构建

根据GenBank网址提供的小鼠DNM1L DNA序列, 在DNM1L基因转录起始位点上游-1 767 bp位置, 应用Primer Premier 5.0软件设计含限制性内切酶Hind Ⅲ和KpnⅠ序列的引物(引物序列见表 1), 扩增片段为284 bp。以小鼠子宫组织DNA为模板进行PCR反应。反应体系:10×Buffer 5 μL, MgSO₄(50 mmol · L^-1)2 μL, dNTP (10 mmol · L^-1)1 μL, Hi Fi Taq酶(5 U · μL^-1, Invitrogen)0.2 μL, 上、下游引物(10 μmol · L^-1)各1 μL, cDNA 1 μL, 加ddH₂O至50 μL。PCR反应循环条件:94 ℃ 3 min; 94 ℃ 30 s, 59 ℃ 30 s, 72 ℃ 20 s, 共35个循环; 72 ℃ 10 min。电泳条带单一的PCR产物与质粒经酶切、连接、鉴定、测序、扩增培养, 成功构建野生型DNM1L萤光素酶报告载体, 记为pGL3-DNM1L-WT。

1.4.3 突变型DNM1L萤光素酶报告载体构建

首先将上、下游引物的5′端加入至少20 bp的互补区域, 引物的非互补区域长度至少20 bp, 所需引入的突变可以包含在互补区域内(2条引物上均引入点突变), 也可以包含在任一条引物的非互补区域, 突变点不能置于引物末端, 然后使用PrimeSTAR GXL DNA聚合酶对目标质粒进行扩增, 反应参照说明书。因上一步扩增含有原始模板, 为防止其在转化后形成假阳性转化子, 必须在进行重组转化前进行DpnⅠ消化。反应体系为DpnⅠ 1 μL, 扩增产物40~50 μL。将上述反应体系置于37 ℃反应1~2 h。如果上一步产物条带单一, DpnⅠ消化产物无需纯化, 可直接用于后续重组反应。如扩增不特异, DpnⅠ消化结束后进行胶回收并纯化目标扩增产物。引物5′端包含完全反向互补的一段序列, 因此在Exnase Ⅱ催化下扩增产物5′端和3′端可以发生同源重组, 完成扩增产物环化过程。反应体系为:DpnⅠ消化产物50~400 ng, Exnase Ⅱ 2 μL, 5×CEⅡBuffer 4 μL, ddH₂O补至20 μL。置37 ℃反应30 min。待反应完成后, 立即将反应管置于冰水浴中冷却5 min后进行转化。突变型DNM1L萤光素酶报告载体记为pGL3-DNM1L-M。

1.5 小鼠子宫内膜基质细胞的原代培养

3周龄昆明雌性小白鼠, 适应饲养5 d, 腹腔注射PMSG, 48 h后断颈处死, 无菌条件下取出子宫, 剔除系膜及脂肪组织, 放入含有1%双抗的冰PBS中, 剪刀剪碎组织, 用胰蛋白酶消化1 h, 500 r · min^-1离心5 min后, 弃上清液。用胶原蛋白酶Ⅰ消化1 h, 吸上清液置于另一个15 mL离心管中, 1 000 r · min^-1离心10 min。沉淀为子宫基质细胞和上皮细胞, 置于37 ℃、5% CO₂饱和湿度培养箱, 用含有10% FBS和1%双抗的DMEM-F12完全培养液培养。吸除漂浮在上层培养液的上皮细胞, 取下层贴壁的基质细胞继续培养, 用来进行转染试验。

1.6 小鼠3T3细胞的复苏与培养

从液氮罐里取出冻存的小鼠3T3细胞, 置于37 ℃水浴锅中解冻。将解冻好的细胞转移到15 mL干净的离心管中, 1 000 r · min^-1离心10 min后弃上清液, 离心管底部为3T3细胞。用含有10% FBS和1%双抗的DMEM-F12完全培养液清洗细胞2次。按每皿1×10⁶细胞接种于直径60 mm的无菌培养皿内, 置于37 ℃、5% CO₂、饱和湿度培养箱中培养。

1.7 过表达载体转染小鼠子宫内膜基质细胞

将小鼠子宫内膜基质细胞以密度为(1.5~3.5)×10⁵接种于6孔板中, 培养24 h后进行转染。每孔培养皿加入500 μL AB₁液(A液为10 μL Lipofectamine 2000和240 μL Optim混合5 min, B液为HOXA10过表达载体1.6 μg+Optim共250 μL混合5 min, A液和B液混合20 min后形成AB₁液), 培养4~6 h后换正常培养液, 48 h后提取细胞总RNA。转染分为3组, 每组3个孔, 分别是pcDNA3.1-HOXA10、pcDNA3.1(对照组)、空白组。

1.8 siRNA干扰试验

将小鼠子宫内膜基质细胞以密度为(1.5~3.5)×10⁵接种于6孔板, 培养24 h后进行转染。每孔培养皿加入500 μL AB₂液(A液为4 μL Lipofectamine 2000和246 μL Optim混合5 min, B液为siRNA 2 μL+Optim共250 μL混合5 min, A液和B液混合20 min后形成AB₂液), 培养4~6 h后换正常培养液, 48 h后提取细胞总RNA。转染分为5组:siRNA-HOXA10(1)、siRNA-HOXA10(2)、siRNA-HOXA10(3)、对照组和空白组, 每组3个孔(siRNA序列见表 2)。

1.9 子宫内膜组织和转染细胞RNA的提取与RT-qPCR

将1.2.2节所述的子宫内膜组织和转染后的细胞按照Trizol试剂盒说明方法提取总RNA, 经琼脂糖电泳和紫外分光光度计检测后, 参照反转录酶说明书合成cDNA。

以小鼠GAPDH基因为内参, RT-qPCR检测HOXA10和DNM1L基因相对表达量。反应条件:95 ℃ 1 min; 95 ℃ 15 s, 60 ℃ 15 s, 72 ℃ 45 s, 循环40次; 72 ℃ 8 min。结果通过-ΔΔC_T方法计算基因表达的相对比值(RT-qPCR引物序列见表 3)。

1.10 萤光素酶报告基因试验

将3T3细胞以(0.8~1.6)×10⁵细胞密度接种于12孔板中, 培养24 h后进行转染。转染4~6 h后换液, 12 h吸净培养液, PBS冲洗2次后加入250 μL PLB裂解15 min, 放入1.5 mL离心管里进行双荧光素酶活性测定。转染分为5组, 每组4个孔。转染组分别为:pGL3-DNM1L-WT (对照组)、HOXA10过表达载体和pGL3-DNM1L-WT共转染组、siRNA-HOXA10(3)和pGL3-DNM1L-WT共转染组、HOXA10过表达载体和pGL3-DNM1L-M共转染组、siRNA-HOXA10(3)和pGL3-DNM1L-M共转染组。

1.11 统计学处理

所有数据均用SPSS 16.0统计软件分析, 定量数据均以x±SD表示, 结果的差异显著性比较采用t测验。

2 结果与分析 2.1 转录结合位点预测

通过转录因子结合位点(TFSITESCAN)分析, DNM1L转录起始位点上游-1 767 bp位置存在可与HOXA10结合的保守序列TTAT, 因此HOXA10可能具备结合DNM1L启动子区域的能力, 进而调节DNM1L基因的表达。

2.2 怀孕0~7 d小鼠子宫内膜中HOXA10和DNM1L mRNA表达量的变化

RT-qPCR检测出HOXA10表达量在小鼠怀孕第4天子宫内膜中达到峰值, DNM1L表达量则在第3天达到峰值(图 1)。

2.3 HOXA10过表达载体及野生型DNM1L萤光素酶报告载体的鉴定

分别以基质细胞cDNA和子宫内膜组织DNA为模板, 扩增得到目的片段, 经过切胶回收, 双酶切处理, 连接, 转化, 涂板; 挑单克隆进行菌液PCR验证, 酶切鉴定, 测序与比对, 确定连接无误无突变, 表明成功构建了过表达载体和报告载体(酶切鉴定如图 2所示)。

2.4 原代培养小鼠子宫内膜基质细胞

子宫内膜主要由腺上皮和基质细胞组成, 原代培养基质细胞须将这2种细胞有效分离。内膜组织经胶原蛋白酶Ⅰ消化后, 去除了未完全消化的组织块和腺管, 可获得大多数基质细胞。利用上皮细胞和基质细胞贴壁时间不同的特性, 可得到纯度较高的基质细胞。如图 3所示:基质细胞呈纤维样生长, 呈现两种形态:梭形和多角形, 主要为三角形或星形, 排列成放射状, 并不紧靠连成片。

2.5 siRNA干扰和HOXA10过表达试验

试验表明, 相对于对照组, siRNA-HOXA10(3)使HOXA10表达量降低60%, 使DNM1L表达量增加1倍(P < 0.01)(图 4)。HOXA10过表达使HOXA10表达量较对照组增加了61倍, DNM1L表达量仅为对照组的1/3(P < 0.01)(图 5)。

2.6 萤光素酶报告基因测定

为了进一步观察转录因子HOXA10对DNM1L的表达调控, 进行了萤光素酶报告基因试验。以pGL3-DNM1L-WT为对照组, HOXA10过表达导致DNM1L启动子区萤光素酶活性极显著下降(P < 0.01)。siRNA干扰抑制内源性HOXA10的表达, 引起DNM1L启动子区萤光素酶活性极显著升高(P < 0.01)。为了确定内源性HOXA10是否直接作用于DNM1L启动子区域并影响其表达, 我们点突变了DNM1L启动子区域结合位点, 结果显示过表达HOXA10和siRNA干扰试验对DNM1L突变型萤光素酶活性无显著影响(P>0.05)(图 6)。

3 讨论

同源框A10基因(homeobox A10 gene, HOXA10)是多基因家族的转录调节基因之一, 参与生殖道发育、胚胎发育调控及植入，决定细胞定向分化和增殖。有研究证实, HOXA10在人类和鼠的胚胎着床过程中是必不可少的^[14]。HOXA10表达贯穿整个月经周期, 并随月经周期呈周期性改变, 在增生期和分泌早期, 表达无显著差异, 而在黄体期种植窗期的子宫内膜表达呈显著性增加。在胚胎着床过程中, HOXA10主要参与细胞的增殖与分化、造血及胚胎的形成和植入。它可通过调节下游基因的转录, 使子宫内膜发育到最佳容受状态, 以利于胚胎的植入^[15]。HOXA10基因敲除小鼠不孕, 表现出着床障碍、习惯性流产及少胎仔数, 但排卵正常。野生型小鼠经子宫注入HOXA10反义寡聚核苷酸会显著减少着床点, 而转入HOXA10表达质粒时可以显著提高胚泡着床率^[16-18]。有研究发现, 在许多生殖道疾病中, HOXA10在子宫内膜中均是低表达的, 而HOXA10的低表达很可能是这些疾病所致不孕的关键。也有研究显示, 在放置宫内铜节育器的妇女子宫内膜中, HOXA10的表达显著降低^[19]。由此可见, HOXA10是影响胚胎着床的关键因子。

DNM1L动力相关蛋白1(dynamin-related protein 1, Drp1), 也称DNM1L蛋白, 是线粒体分裂的必需蛋白。DNM1L能够介导线粒体的分裂, 其功能的丧失会导致线粒体之间的融合和连通性。使用生化和细胞培养的方法过表达的Drp1突变体能够影响线粒体的结构和功能, 导致核周围产生簇状的线粒体, 线粒体间的连通性也会因此增加^[20]。DNM1L还参与细胞的凋亡过程。由Drp1调控的线粒体分裂过程参与细胞内的调亡通路, 在发生凋亡的哺乳动物细胞中, 会有大量的线粒体发生分裂作用, 同时线粒体外膜的通透性和细胞色素c的释放也会随之增加^[13], 其过度表达可促进线粒体的分裂以及细胞色素c的释放^[21], 而过表达Drp1K38A不仅可以抑制线粒体分裂, 而且可以抑制或减慢Caspase活化及细胞凋亡^[22]。由Bax/Bak介导产生的线粒体内膜空间蛋白DDP/TIMM8a也能够结合到Drp1上, 促进线粒体处Drp1水平的增加并剌激线粒体的分裂^[23]。胚胎着床过程是一个复杂的生理过程, 包括激素、酶、细胞因子和免疫因子在内的多种物质均参与其中, 并且此过程也涉及到细胞的调亡和增殖。

胚胎着床是胚胎与子宫之间复杂的协调过程, 要求容受性子宫内膜和功能性胚泡同步发育并功能协调, 且在一个适合而短暂的阶段相互识别、黏附, 最终使胚胎植入子宫内膜。胚胎着床涉及许多因子, 它们共同构成纷繁复杂的信号途径及调控网络。到目前为止, 其具体的调控机制尚不明确。近年来, HOXA10在决定子宫内膜容受性方面的主导地位得到确立, 以HOXA10为中心的分子机制研究成为热点^[15]。我们希望通过对其下游基因研究, 找出调控胚胎着床的关键因子, 来揭示胚胎着床的真正机制。